劉宇 王倩 王榮麗

肺纖維化(pulmonary fibrosis, PF)是一種常見(jiàn)的、可由多種病因引起的間質(zhì)性肺疾病,主要表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)(extracelullar matrix, ECM)在肺組織中過(guò)度沉積,大量瘢痕組織形成,導(dǎo)致氣體交換減少、進(jìn)行性呼吸衰竭[1-2]。山姜素是一種廣泛存在于自然界中的類黃酮化合物,具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗菌、抗病毒等多種作用[3-4],并且具有較低的全身毒性。研究表明黃酮類化合物抗肺纖維化的機(jī)制可能是通過(guò)抑制TGF-β1/Smad信號(hào)通路,進(jìn)而抑制成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞,減少ECM的產(chǎn)生,改善肺纖維化和緩解肺纖維化的進(jìn)展[5-7]。然而山姜素能否通過(guò)TGF-β1/Smad信號(hào)通路改善博來(lái)霉素誘導(dǎo)的PF仍有待研究。本研究應(yīng)用博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型探討山姜素的抗纖維化作用及其可能機(jī)制。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠60只,6～8周齡,體重18～20 g,購(gòu)自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2019-0010],質(zhì)量合格證號(hào):110324220101630175,飼養(yǎng)于本院腫瘤科動(dòng)物室。所有實(shí)驗(yàn)操作遵守實(shí)驗(yàn)室相關(guān)管理規(guī)定,經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院進(jìn)行倫理審批(swmu20230018)。

二、主要試劑與儀器

博來(lái)霉素購(gòu)自北京泰澤嘉業(yè)科技發(fā)展有限公司;山姜素購(gòu)自成都埃法生物科技有限公司;羥脯氨酸試驗(yàn)盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;HE染色試劑盒、Masson染色試劑盒購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司;Smad2/3、Smad7購(gòu)自Affinity Biosciences公司; TGF-β1、Col-1、E-Cad、α-SMA、ACTIN抗體購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司;酶標(biāo)儀購(gòu)自Rayto;電泳儀購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司;熒光定量PCR儀購(gòu)自Bio-rad;正置熒光顯微鏡購(gòu)自Nikon。

三、動(dòng)物分組及造模

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為對(duì)照組(NS)、模型組(BLM)、羧甲基纖維素鈉組(CMC)、低劑量山姜素組(Alp25)、中劑量山姜素組(Alp50)、高劑量山姜素組(Alp100),每組10只。模型制備[8]:小鼠腹腔注射1%戊巴比妥(50mg/kg)麻醉后,BLM組、CMC組、Alp25、Alp50、Alp100組采取一次性氣管內(nèi)滴注博來(lái)霉素2U/kg建立肺纖維化模型,NS組一次性氣管內(nèi)滴注相應(yīng)體積的生理鹽水,滴注后立即將小鼠直立旋轉(zhuǎn),使液體均勻分布于肺內(nèi)。從造模第二天開(kāi)始給藥,Alp25、Alp50、Alp100組分別腹腔注射25、50、100mg/kg山姜素溶液,NS組和BLM組腹腔注射給予相應(yīng)體積的生理鹽水,CMC組腹腔注射給予相應(yīng)體積的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液,隔天給藥1次,共10次。在第21天,麻醉處死小鼠,取雙肺組織待檢。

四、HE染色

取右肺上葉肺組織,置于4%多聚甲醛中固定、脫水、包埋、5μm切片。HE染色觀察肺組織病理改變。

五、Masson染色

石蠟切片經(jīng)Masson染色觀察肺組織纖維化程度。

六、ELISA法檢測(cè)HYP含量

取適量左肺下葉組織勻漿離心后取上清,采用堿水解法,按HYP試劑盒說(shuō)明操作,取上清于550 nm處測(cè)定吸光度值,根據(jù)下列公式計(jì)算各組小鼠肺組織中HYP的含量。

羥脯氨酸含量(ug/mg)=(測(cè)定OD值-空白OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品含量(5ug/mL)×[水解液總體積(mL)/組織濕重(mg)]

七、肺系數(shù)

剝離出小鼠肺組織,生理鹽水清洗,濾紙拭干肺組織表面水分后稱重,根據(jù)下列公式計(jì)算肺系數(shù)。

肺系數(shù)=[(肺臟重量(mg)/體重(g)]×100%

八、免疫組織化學(xué)法檢測(cè)TGF-β1、Smad2/3、Smad7表達(dá)

將石蠟切片脫蠟至水,組織切片置于盛滿抗原修復(fù)緩沖液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù),3%雙氧水溶液室溫避光孵育阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,滴加3%BSA封閉,滴加PBS按一定比例配好的一抗,4°C孵育過(guò)夜,滴加二抗,室溫孵育50min,滴加DAB顯色劑顯色,復(fù)染、脫水、透明、封片。用數(shù)字化電子顯微鏡進(jìn)行切片掃描,K-Viewer進(jìn)行圖像采集。

九、免疫熒光染色檢測(cè)E-cad、α-SMA、Col-1表達(dá)

將石蠟切片脫蠟至水,組織切片進(jìn)行抗原修復(fù),BSA封閉,滴加配好的一抗,4°C孵育過(guò)夜,滴加二抗,室溫孵育50min,DAPI復(fù)染細(xì)胞核,避光室溫孵育10min,淬滅組織自發(fā)熒光,封片。切片掃描后,CaseViewer進(jìn)行圖像采集,使用Image J進(jìn)行熒光定量分析。

十、Western Blot檢測(cè)Smad2/3、Smad7蛋白表達(dá)

取左肺上葉組織,加入裂解液(使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑),研磨,離心,提取組織蛋白,制備分離膠和濃縮膠,上樣后進(jìn)行電泳,電泳至溴酚藍(lán)里最底部大約1cm即可終止電泳,進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,將PVDF膜放入脫脂牛奶中封閉,加入一抗,4℃孵育搖床過(guò)夜,洗膜,二抗孵育,洗膜,最后化學(xué)發(fā)光顯影,進(jìn)行凝膠圖像分析。

十一、RT-PCR檢測(cè)TGF-β1 mRNA表達(dá)

取適量左肺下葉組織,按試劑盒說(shuō)明將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA鏈,以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增條件為:95℃預(yù)變性30 s,95℃變性15 s,60℃退火30 s,共40個(gè)循環(huán)。GADPH上游引物序列:5′- CCTCGTCCCGTAGACAAAATG-3′,下游引物序列:5′- TGAGGTCAATGAAGGGGTCGT-3′;TGF-β1上游引物序列:5′- TAATGGTGGACCGCAACAAC-3′,下游引物序列:5′-CCACATGTTGCTCCACACTTGAT-3′。以GADPH為內(nèi)參,計(jì)算TGF-β1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

十二、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、山姜素對(duì)肺纖維化小鼠體重及肺組織結(jié)構(gòu)的影響

如(圖1A)所示,NS組小鼠體重逐漸增加,而構(gòu)建肺纖維化模型的小鼠,在0～4天期間,體重逐漸下降;4天后,BLM組和CMC組小鼠體重?zé)o明顯上升;Alp50組在給予治療后,小鼠的體重逐漸恢復(fù);Alp25組和Alp100組小鼠體重恢復(fù)無(wú)Alp50組明顯。從HE染色和Masson染色可以看出(圖1C),NS組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整,無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),無(wú)明顯膠原纖維增生;BLM組和CMC組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)損害明顯,肺泡結(jié)構(gòu)紊亂,炎性細(xì)胞大量浸潤(rùn),大量藍(lán)染膠原纖維沉積;與BLM組比較,Alp25、Alp50、Alp100組小鼠肺組織病變結(jié)構(gòu)有所改善,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少,藍(lán)染膠原纖維沉積減少,而Alp50組改善最明顯。并且與BLM組和CMC組相比,Alp50組小鼠肺系數(shù)降低更明顯(圖1B)。

圖1 (A)小鼠體重變化;(B)肺組織肺系數(shù);(C)肺組織HE染色和Masson染色

二、山姜素對(duì)肺纖維化小鼠肺組織Col-1表達(dá)的影響

如(圖2)所示,與NS組相比,BLM組和CMC組小鼠肺組織中Col-1表達(dá)顯著升高;與BLM組相比,Alp25、Alp50、Alp100組小鼠肺組織中Col-1表達(dá)降低,而Alp50組降低更顯著。

圖2 A:免疫熒光檢測(cè)各組小鼠肺組織中Col-1表達(dá)(×100);B:各組小鼠肺組織中Col-1表達(dá)定量分析

三、山姜素對(duì)肺纖維化小鼠肺組織E-cad表達(dá)的影響

如(圖3)所示,與NS組相比,BLM組和CMC組小鼠肺組織中E-cad表達(dá)降低;與BLM組相比,Alp50組小鼠肺組織中E-cad表達(dá)顯著升高。

圖3 A:免疫熒光檢測(cè)各組小鼠肺組織中E-cad表達(dá)(×100);B:各組小鼠肺組織中E-cad表達(dá)定量分析

四、山姜素對(duì)肺纖維化小鼠肺組織α-SMA表達(dá)的影響

如(圖4)所示,與NS組相比,BLM組和CMC組小鼠肺組織中α-SMA表達(dá)升高;與BLM組相比,Alp50組小鼠肺組織中α-SMA表達(dá)降低。

圖4 A:免疫熒光檢測(cè)各組小鼠肺組織中α-SMA表達(dá)(×100);B:各組小鼠肺組織中α-SMA表達(dá)定量分析

五、山姜素對(duì)肺纖維化小鼠肺組織Smad2/3和Smad7蛋白表達(dá)的影響

如(圖5)所示,與NS組相比,BLM組和CMC組小鼠肺組織中Smad2/3蛋白表達(dá)升高,Smad7蛋白表達(dá)下降;與BLM組相比,Alp50組小鼠肺組織中Smad2/3蛋白表達(dá)降低,Smad7蛋白表達(dá)升高。

圖5 A:Western Blot檢測(cè)各組小鼠肺組織中Smad2/3和Smad7蛋白表達(dá)電泳圖;B:各組小鼠肺組織中Smad2/3蛋白表達(dá)定量分析;C:各組小鼠肺組織中Smad7蛋白表達(dá)定量分析

六、山姜素對(duì)肺纖維化小鼠TGF-β1/Smad信號(hào)通路及肺組織HYP含量的影響

如(圖6A、6B)所示,與NS組相比,BLM組和CMC組小鼠肺組織中Smad2/3、TGF-β1表達(dá)升高,Smad7表達(dá)降低;與BLM組相比,Alp50組小鼠肺組織中Smad2/3、TGF-β1表達(dá)降低,Smad7表達(dá)升高;而Alp25、Alp100組小鼠肺組織中TGF-β1/Smad信號(hào)通路相關(guān)蛋白及mRNA表達(dá)變化無(wú)Alp50組明顯。如(圖6C)所示,BLM組小鼠肺組織中的HYP含量高于NS組,而Alp50組小鼠肺組織中的HYP含量低于BLM組。

圖6 (A)各組小鼠肺組織中Smad2/3、Smad7和TGF-β1免疫組化(×200);(B)各組小鼠肺組織中TGF-β1 mRNA表達(dá);(C)各組小鼠肺組織中HYP含量

討 論

肺纖維化是一種常見(jiàn)的肺間質(zhì)疾病,其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜,以炎癥和廣泛的纖維化為主要特征,在發(fā)病的過(guò)程中,肺泡上皮細(xì)胞因反復(fù)的損傷導(dǎo)致持續(xù)的炎癥反應(yīng),進(jìn)而發(fā)生纖維化[9]。肺纖維化患者治療困難、預(yù)后差、死亡率高,并且肺纖維化患者肺癌發(fā)生率遠(yuǎn)高于普通人群[10]。目前針對(duì)肺纖維化尚無(wú)有效的根治方法,僅有吡非尼酮和尼達(dá)尼布被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于特發(fā)性肺纖維化的治療[11]。但是,吡非尼酮和尼達(dá)尼布長(zhǎng)期服用所導(dǎo)致的肝功能損害和昂貴的費(fèi)用,使大部分肺纖維化患者難以承受。因此,研發(fā)一種安全、高效、經(jīng)濟(jì)的抗肺纖維化藥物是非常必要的。既往研究表明,山姜素能夠改善葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎、改善四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化、改善卵清蛋白誘導(dǎo)的過(guò)敏性哮喘、改善脂多糖聯(lián)合吸煙誘導(dǎo)慢性阻塞性肺疾病[4,12-14],但是在肺纖維化治療上未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)山姜素可以有效地抑制TGF-β1/Smad信號(hào)通路的表達(dá),對(duì)肺纖維化有一定的治療作用。

既往研究表明,運(yùn)用博來(lái)霉素誘導(dǎo)C57BL/6小鼠建立PF模型是目前應(yīng)用最廣泛的方法。一次性氣管內(nèi)滴注博來(lái)霉素后,PF發(fā)展分為三個(gè)階段,1～7天為急性損傷及炎癥期,7～14天為炎癥向纖維化活躍過(guò)度,21天后為慢性纖維化階段,21～28天為膠原沉積的高峰[8]。所以本實(shí)驗(yàn)采取一次性氣管內(nèi)滴注博來(lái)霉素構(gòu)建PF模型,并運(yùn)用此模型探究山姜素對(duì)PF的作用及可能機(jī)制。HYP是膠原蛋白的主要成分,在膠原蛋白的合成和穩(wěn)定中起重要作用,能間接反應(yīng)肺組織纖維化[15]。本研究結(jié)果顯示,BLM組和CMC組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)損害嚴(yán)重,肺泡結(jié)構(gòu)紊亂,炎性細(xì)胞大量浸潤(rùn),大量藍(lán)染膠原纖維沉積,HYP含量升高,肺系數(shù)增加。HE染色、Masson染色以及膠原沉積的結(jié)果提示本研究成功誘導(dǎo)小鼠肺纖維模型。經(jīng)過(guò)山姜素治療后,小鼠體重逐漸上升,小鼠肺組織結(jié)構(gòu)有所改善,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少,藍(lán)染膠原纖維沉積減少,HYP含量下降,肺系數(shù)減少,表明治療后小鼠整體生活質(zhì)量得到了改善,小鼠的PF得到改善,其中中劑量組(Alp50)改善最明顯。但本研究未消除山姜素對(duì)炎癥的影響,難以區(qū)分山姜素是單純抗纖維化作用還是依賴抗炎效應(yīng)的抗纖維化作用。

在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中,過(guò)度的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)可能發(fā)揮著重要作用[16]。隨著EMT的進(jìn)展,上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cad減少,間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA增加,成纖維細(xì)胞迅速增加,產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì),促進(jìn)肺纖維化的形成[9]。而肌成纖維細(xì)胞分泌的Col-1也可以促進(jìn)肺纖維化[17]。既往研究表明,蘿卜硫素治療肺纖維化小鼠后,Col-1、α-SMA表達(dá)減少,E-cad表達(dá)增加[18]。在本研究中,通過(guò)免疫熒光的方法可以直觀的看到各組小鼠的E-cad、α-SMA和Col-1的表達(dá)。本研究結(jié)果表明,經(jīng)過(guò)山姜素治療后的小鼠,Col-1和α-SMA的表達(dá)減少,E-cad的表達(dá)增加,山姜素能減少ECM的沉積,改善PF的進(jìn)展,其中以Alp50組的改善最明顯。但本研究未探究山姜素是否可通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、氧化失衡等其他因素共同改善PF。

參與PF發(fā)生發(fā)展過(guò)程主要的信號(hào)通路有NF-κB、Nrf-2、PI3K/Akt/mTOR、JAK2/STAT3、TGF-β1/Smad、Wnt/β-catenin[19]。其中TGF-β1/Smad信號(hào)通路是肺纖維化發(fā)生發(fā)展的重要通路。研究表明,抑制TGF-β1/Smad信號(hào)通路的表達(dá),能有效地抑制肺纖維化的進(jìn)展,因此,TGF-β1/Smad信號(hào)通路也是治療肺纖維化的潛在靶點(diǎn)[20-21]。研究表明,肺纖維化的發(fā)生與TGF-β1/Smad信號(hào)通路激活有關(guān),TGF-β1的作用依賴于Smads蛋白,TGF-β1與TGF-β受體結(jié)合,激活Smad2、Smad3,被激活的Smad2/3復(fù)合物與胞漿內(nèi)的Smad4結(jié)合形成co-Smads,以調(diào)節(jié)基因表達(dá);抑制性Smad7能與受體結(jié)合,進(jìn)而抑制Smad2、Smad3的激活[22]。因此,TGF-β1的下調(diào)被認(rèn)為是終止纖維化過(guò)程的關(guān)鍵。研究表明TGF-β1可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的聚集、激活和增殖并導(dǎo)致過(guò)多的ECM沉積和膠原蛋白生成,還可以刺激促炎性和促纖維化細(xì)胞因子的表達(dá)[23-24]。既往研究表明,芍藥苷治療肺纖維化小鼠后,Smad2/3表達(dá)降低、Smad7表達(dá)升高[25]。研究結(jié)果表明,經(jīng)過(guò)山姜素治療后的小鼠,Smad2/3、TGF-β1表達(dá)降低,Smad7表達(dá)升高,而Alp50組的作用比Alp25組和Alp100組更加明顯。因此,山姜素可以抑制TGF-β1/Smad信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá),進(jìn)而改善肺纖維化的進(jìn)展,其中Alp50組改善最明顯。但該研究未探究山姜素是否可通過(guò)其他信號(hào)通路改善PF。

以上研究結(jié)果顯示,山姜素可以通過(guò)阻止EMT,抑制TGF-β1/Smad信號(hào)通路的表達(dá),改善肺纖維化的進(jìn)展,達(dá)到抑制肺纖維化的作用。本研究為治療肺纖維化提供了新的理論依據(jù)。