宋佳華 余一凡 鄧文藝 宋相欽 靳帥 李濤 錢坤 王毅

器官移植是各類終末期器官疾病最有效的治療手段，為了解決器官移植中供者短缺的問題，人們開始探究異種移植。隨著豬-非人靈長類動物（non-human primate，NHP）腎移植實(shí)驗(yàn)的不斷發(fā)展，異種移植亞臨床研究在世界范圍內(nèi)不斷升溫，研究者們在異種移植排斥反應(yīng)、感染等方面積累了大量數(shù)據(jù)。2021 年9 月和11 月，Montgomery 等[1]分別完成2 例保留患者原腎的α-1, 3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（α-1,3-galactosyltransferase，GATT1）基因敲除（GTKO）豬-腦死亡腎移植，移植后的豬腎功能正常且術(shù)后54 h 內(nèi)未發(fā)生排斥反應(yīng)。同期，Porrett 等[2]對腦死亡患者行雙腎切除術(shù)，并移植10-基因編輯豬的雙腎，術(shù)后74 h 未見發(fā)生排斥反應(yīng)，移植腎灌注良好。在異種移植臨床研究中，研究者們普遍認(rèn)為豬腎的生理功能對患者長期預(yù)后將產(chǎn)生重要影響，但是具體促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin-angiotensinaldosterone system，RAAS）、有活性的維生素D3對移植腎功能及患者本身具有何種影響仍然需要大量研究。EPO 生成的減少、電解質(zhì)紊亂有可能導(dǎo)致移植術(shù)后腎功能代謝紊亂、酸堿平衡失調(diào)。并且腎移植的優(yōu)勢在于如果器官衰竭或患者出現(xiàn)危及生命的感染，則可以切除移植物，停止所有免疫抑制治療，并重新引入慢性透析[3]。積極開展異種移植生理學(xué)研究，切實(shí)推動異種來源EPO、腎素、鈣磷平衡實(shí)驗(yàn)研究，積累異種來源器官在生理學(xué)方面的研究經(jīng)驗(yàn)，為將來延長異種移植物的存活提供一些理論指導(dǎo)。

1 EPO 與異種移植

EPO 是一種刺激骨髓產(chǎn)生紅細(xì)胞的激素。生理方面，人類產(chǎn)生EPO 的第一個部位是神經(jīng)嵴，再從胎兒期的肝臟轉(zhuǎn)移到出生后的腎臟[4]。結(jié)構(gòu)方面，全長人EPO 的一級結(jié)構(gòu)包含166 個氨基酸，其分子量約為30.4[5]。1993 年，Wen 等[6]獲得了編碼多種哺乳動物成熟EPO 蛋白的互補(bǔ)DNA（complementary D N A，c D N A）序列，通過聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增技術(shù)得到猴、豬的EPO cDNA。進(jìn)而從中推斷出成熟EPO 蛋白的氨基酸序列，結(jié)合已知的人類序列，推斷出人EPO 與猴EPO 相同區(qū)間為91%，與豬EPO 相同區(qū)間為80%～82%，豬與NHP 的氨基酸同源性也超80%。由此可見，豬的EPO 與人類具有高度的同源性，但并不是完全一致。豬腎產(chǎn)生的EPO 能否在NHP 中發(fā)揮作用？豬與NHP 之間有無生理相容性？是否有必要通過基因敲除技術(shù)去改變氨基酸差異？目前有關(guān)這一方面的研究還比較少，值得深入探討。

1.1 EPO 及其受體的影響機(jī)制

EPO 受體（EPO receptor，EPOR）是一種跨膜糖蛋白，其基因位于19 號染色體短臂，長約5.0～6.5 kb。由8 個外顯子和7 個內(nèi)顯子構(gòu)成，分子量為62，由507 個氨基酸組成。EPOR 是Ⅰ類細(xì)胞因子受體超家族的成員，包含一個胞外結(jié)構(gòu)域、一個跨膜結(jié)構(gòu)域，一個缺乏酪氨酸激酶活性和與位于跨膜域近端的保守氨基酸基團(tuán)（WSXWS）激酶結(jié)合，形成同源二聚體、異源二聚體或異三聚體的復(fù)合體。其中，同源二聚體將在紅系祖細(xì)胞上激活并通過Janus 激酶（Janus kinase，JAK）2 觸發(fā)下游信號通路，緊接著通過信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）5、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）等下游通路維持紅細(xì)胞的生成[7]。異源二聚體是由EPOR 單體亞基和β 共同受體CD131 組成，其中EPOR-CD131 需要更高濃度的EPO 才能激活，并與其促進(jìn)紅細(xì)胞的生成、組織保護(hù)作用如介導(dǎo)抑制促炎因子和抑制凋亡有關(guān)[8]。筆者認(rèn)為，目前器官移植領(lǐng)域缺少異種來源EPO 在不同物種間的研究，EPOR 對其功能的實(shí)現(xiàn)存在著顯著的影響，是一個潛在的研究方向，并且豬EPO 與人的EPO 結(jié)構(gòu)不同，其能否與人的EPO 結(jié)合位點(diǎn)EPOR 結(jié)合，是否對人體具有有害作用，目前還沒有定論。

1.2 EPO 的貧血治療作用

在健康的成年人中，腎臟產(chǎn)生的EPO 占循環(huán)EPO 的90%[9]。雖然在終末期腎?。╡nd-stage renal disease，ESRD）患者中，肝可以代償性增加EPO 的合成，但這并不足以預(yù)防貧血[10]。在以往的研究中，有研究者報道過狒狒在豬腎異種移植手術(shù)后發(fā)生貧血，并積極采用外源性EPO 治療的案例，但其治療效果仍存在爭議。即使豬-NHP 異種模型已進(jìn)行了大量研究，仍不能明確豬的EPO 在NHP 中是否發(fā)揮了作用[11]。豬EPO 能否充分刺激宿主的骨髓仍然值得研究。當(dāng)然，也可以通過基因工程將人EPO 基因整合入豬細(xì)胞中，幫助其克服生理差異。需要注意的是，豬腎的血紅蛋白水平較低，這可能會在移植到人類體內(nèi)時改變EPO 的產(chǎn)生[12]。已有學(xué)者提出A 型血的豬GGTA1/胞苷單磷酸-N-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶（cytidine monophospho-N-acetylneuraminic acid hydroxylase，CMAH）雙敲除可能導(dǎo)致與貧血癥狀非常相似的病理學(xué)特征的發(fā)展[13]。探究異種移植基因敲除豬是否會導(dǎo)致貧血，是否會影響受者造血功能對異種移植研究具有重要意義。當(dāng)然，貧血也可能跟頻繁抽血和骨髓免疫抑制藥的應(yīng)用有關(guān)[14]。

在慢性腎?。╟hronic kidney disease，CKD）患者中，腎臟的周細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，隨后EPO 的產(chǎn)生能力下降并導(dǎo)致腎性貧血[15]。由此可見，CKD 患者的病變腎臟不能產(chǎn)生EPO。同時，腎血流量影響腎臟的氧供應(yīng)，缺氧也可增加急性腎損傷的易感性[16]，加速CKD 的進(jìn)展[17]，這說明EPO 生成同時也受血氧含量的影響[18]。這就要求研究者密切關(guān)注異種腎臟在受者體內(nèi)的表現(xiàn)，例如血管銜接情況、血氧含量、腎臟纖維化程度、腎功能情況等。

1.3 EPO 的免疫調(diào)節(jié)作用

移植術(shù)后需長期服用免疫抑制藥，這增加了感染的發(fā)生率，對受者而言是一個巨大的挑戰(zhàn)，而EPO能夠抑制體液免疫，減輕排斥反應(yīng)。Guglielmo 等[19]通過小鼠實(shí)驗(yàn)證明EPO 抑制濾泡輔助性T 細(xì)胞（follicular helper T cell，Tfh）的分化，抑制Tfh 依賴的抗體形成及抑制了小鼠同種異體心臟移植的T 細(xì)胞依賴性排斥反應(yīng)。同時也有相關(guān)研究表明含有共刺激阻斷的免疫抑制方案中添加EPO，可防止人類移植受者的排斥反應(yīng)和延長移植物存活時間[20]。EPO已被證明可以降低促炎因子水平，增強(qiáng)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞清除，同時促進(jìn)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）的誘導(dǎo)[20-21]。由此可見，EPO 具有免疫調(diào)節(jié)功能，雖然目前EPO 在移植中的作用并不完全清楚，有關(guān)異種腎移植方面的研究也比較少。但是目前有關(guān)自身免疫性疾病及間質(zhì)性腎炎的相關(guān)文獻(xiàn)表明，單核細(xì)胞也能產(chǎn)生EPO，EPO 能直接抑制輔助性T 細(xì)胞（helper T cell，Th）17 分化，Th17 在促進(jìn)自身免疫和抗腫瘤免疫方面發(fā)揮作用，而異常的Th17 反應(yīng)可導(dǎo)致黏膜器官炎癥、損傷和功能障礙[22]。同時，在移植術(shù)后貧血患者使用EPO 過程中抑制Th17 會導(dǎo)致Th17/Treg 之間比例失衡，加速腫瘤的發(fā)生[23]，因此，效應(yīng)Th17 和Treg 之間必須保持平衡，以保證移植術(shù)后患者既不會新發(fā)腫瘤，也不會引起排斥反應(yīng)過強(qiáng)。探究EPO 在異種移植中的免疫抑制作用，將有助于減輕排斥反應(yīng)，延長術(shù)后長期存活時間，合理規(guī)劃免疫抑制藥的使用。

1.4 EPO 的腎臟保護(hù)作用

缺血-再灌注損傷是腎移植受者常見的手術(shù)并發(fā)癥，Zhou 等[24]研究者表明經(jīng)EPO 預(yù)處理的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠緩解移植后缺血-再灌注導(dǎo)致的急性腎損傷，保護(hù)細(xì)胞免于凋亡，對器官具有較好的保護(hù)作用。EPO 除了通過改善缺血-再灌注損傷保護(hù)器官外，還能通過糾正貧血來延緩腎功能惡化[25]，貧血的嚴(yán)重程度也與移植物衰竭和死亡密切相關(guān)[26]。需要注意的是，腎移植術(shù)后早期輸血雖可以短期內(nèi)把血紅蛋白提高到正常范圍，但是這可能加速腎功能惡化，降低移植物的存活率[27]。因此，既要早期用藥防止腎性貧血的發(fā)生，又要注意監(jiān)測，防止腎功能加速惡化。由此可見，EPO 在降低缺血-再灌注損傷、糾正腎性貧血、減緩移植物失功等方面具有一定的保護(hù)作用，可延長患者生存期，降低患者二次移植的發(fā)生率。

2 RAAS 與異種移植

在異種移植實(shí)驗(yàn)中，腎臟解剖學(xué)的差異引起了人們的廣泛重視，雖然豬腎在大小、形狀和功能上與人類的腎臟相似，但與人類的腎臟相比豬腎臟濃縮尿液的能力存在一定差異。這是由于豬腎的腎單位比人類腎臟少，排泄的尿液量更大，雖然大體解剖特征相似，但濃縮尿液的能力與人類腎臟相比效率較低，顯著影響著術(shù)后長期存活率。異種移植實(shí)驗(yàn)中針對RAAS 的研究迫在眉睫。

2.1 RAAS 的腎臟保護(hù)作用

腎素由腎臟入球小動脈的近球細(xì)胞合成、貯存并釋放到血液中。當(dāng)機(jī)體循環(huán)血量減少或血壓下降時腎血流量減少，刺激腎臟近球細(xì)胞腎素分泌增多，腎素能夠?qū)⒀芫o張素原（angiotensinogen，AGT）轉(zhuǎn)變成血管緊張素（angiotensin，Ang）Ⅰ，Ang Ⅰ在血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的作用下，形成具有降解緩激肽作用的Ang Ⅱ。Ang Ⅱ具有很高的生物活性，有強(qiáng)烈的收縮血管作用，使血壓升高同時促使醛固酮分泌，潴留水鈉，刺激交感神經(jīng)節(jié)增加去甲腎上腺素分泌，增加交感神經(jīng)遞質(zhì)和提高特異性受體的活性等，導(dǎo)致血壓升高。

豬-狒狒的體內(nèi)模型實(shí)驗(yàn)表明，豬腎分泌的腎素降低了NHP 中的AGT 活性，豬腎濃縮尿液的能力也下降，并且血漿中Ang Ⅱ的產(chǎn)生被抑制可能導(dǎo)致低血容量和低血壓發(fā)生[28]。異種移植后，血漿腎素活性和醛固酮水平顯著降低[29]，人AGT 在體外不能被豬腎素有效地切割。在CKD 患者，尤其是ESRD 患者中，存在著RAAS 的過度激活[30]。研究提示血漿Ang Ⅱ濃度降低可能是由于豬腎素與狒狒AGT 的反應(yīng)性降低，這說明RAAS 改善低血容量和低血壓的能力受到一定損傷，維持RAAS 的穩(wěn)定將更好地保護(hù)移植腎。在異種移植實(shí)驗(yàn)中，RAAS 作為一個低血容量監(jiān)測激素系統(tǒng)來維持動脈血壓，檢測RAAS 有助于調(diào)節(jié)細(xì)胞外液和血容量以及全身血管阻力。

2.2 RAAS 的血壓維持作用

豬與人存在生理差異，人的AGT 只能被人的腎素識別并切割，而不能被其他哺乳動物的腎素識別并切割[31]，這也許是物種間基因差異導(dǎo)致的識別蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)過程中的區(qū)別。豬腎素具有嚴(yán)格的底物特異性，NHP 的AGT 在體外研究中被證明是豬腎素的不良底物[12]。即使AGT 在所有NHP 中的化學(xué)結(jié)構(gòu)都是相同的[28]，但在豬-狒狒的體內(nèi)研究中也證實(shí)豬腎素對NHP 的AGT 活性降低，這可能導(dǎo)致狒狒受體的血管收縮能力降低，并導(dǎo)致在體內(nèi)保留液體的能力受損，由于人與NHP 的生理相似性，推測豬腎素對NHP 的AGT 活性與人類相同。因此，豬的腎素不能切割人的AGT。目前還不確定豬腎產(chǎn)生的腎素是否會影響血容量狀態(tài)，應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步的觀察和研究。在以往的異種移植實(shí)驗(yàn)中時常有發(fā)生低血容量和低血壓的報道，研究者們一般建議用基因工程生產(chǎn)人的腎素，不建議敲除豬腎素基因，他們認(rèn)為這會影響豬的健康[32]。同時低血容量和低血壓也提示RAAS 可能受損。異種移植后NHP 體內(nèi)電解質(zhì)穩(wěn)態(tài)的機(jī)制尚不清楚，因?yàn)镽AAS 在移植后可能受到損害。在異種移植的背景下，豬腎素活性降低可能導(dǎo)致醛固酮的產(chǎn)生減少和低血容量介導(dǎo)的血流動力學(xué)不穩(wěn)定[33]。目前尚不確定在豬移植物中產(chǎn)生的腎素是否能維持人的RAAS 穩(wěn)定。

2.3 RAAS 對移植受者的影響

在同種腎移植手術(shù)中，很少切除患者的原腎。原腎可能產(chǎn)生殘留的腎素，但從終末期腎臟分泌的腎素不太可能滿足生理需求，特別是需要透析的患者[28]。在CKD 患者中，腎血流隨著腎萎縮而減少，并且80%～90%合并有高血壓，這主要是由于腎單位大量丟失，導(dǎo)致水、鈉潴留和細(xì)胞外容量增加，以及腎臟RAAS 激活與排鈉減少。在首個測量豬腎移植到免疫抑制NHP 的功能研究中，ESRD 患者接受豬腎移植后，原腎可能會留在原位，并仍可能殘留一些過濾功能，但這估計是總腎小球?yàn)V過率（glomeruar filtration rate，GFR）的10%。在異種移植中，雖然已有的研究結(jié)果表明，移植到狒狒體內(nèi)的轉(zhuǎn)基因豬腎能夠維持狒狒相對正常的腎功能[34]，但進(jìn)行性腎損傷的結(jié)果提示，這是腎單位代償?shù)慕Y(jié)果。因此，了解受體的腎過濾和分泌功能，以及在豬腎移植到NHP 后，其是否隨時間變化至關(guān)重要。如果豬到人的異種腎移植要想成功，必須提供足夠和可持續(xù)的GFR。準(zhǔn)確評估異種腎移植后GFR 的演變對于臨床決策和藥物劑量至關(guān)重要。因此，使用尿或血漿清除內(nèi)源性或外源性過濾標(biāo)志物來測量GFR 成為首個人類異種移植研究的關(guān)鍵因素[33]。

在體內(nèi)研究測量異種腎移植后NHP 中RAAS 通路的成分將有助于了解豬腎素活性。另一個需要考慮的因素是豬移植物產(chǎn)生AGT 的能力。據(jù)筆者檢索文獻(xiàn)，尚無豬腎移植的體內(nèi)研究表明豬腎素在NHP 中的活性。如果豬腎素不能以臨床顯著的速率切割人或NHP 的AGT，可能需要考慮產(chǎn)生基因工程表達(dá)人腎素的豬。

3 鈣磷代謝與異種移植

隨著CKD 的發(fā)病率越來越高，CKD 繼發(fā)鈣磷代謝紊亂的臨床并發(fā)癥也越來越多，如繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)、活性維生素D 分泌異常、成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）-23 增多等。當(dāng)然，在異種移植中也不例外。在CKD 及腎移植受者體內(nèi)鈣磷代謝紊亂主要受甲狀旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）、活性維生素D 及FGF-23 的調(diào)節(jié)[35]。首先，PTH 使破骨細(xì)胞活性和數(shù)目增加，導(dǎo)致血鈣水平升高。隨著骨骼中鈣的釋放，磷也會被釋放出來。因此，PTH 作用于腎臟，重新吸收鈣和排泄磷。為了恢復(fù)骨中的鈣和磷，PTH 還能激活腎臟中的1-α 羥化酶，將維生素D 轉(zhuǎn)化為其活性形式，進(jìn)一步導(dǎo)致腸道對鈣和磷的吸收增加，即PTH 抑制腎小管對磷的吸收，促進(jìn)腸道鈣、磷的吸收。當(dāng)血磷水平較高時，F(xiàn)GF-23 會從骨中釋放出來。FGF-23 是一種強(qiáng)效的磷酸化激素，可導(dǎo)致尿中磷酸鹽的排泄增加，并且通過抑制1-α 羥化酶的表達(dá)，抑制近端腎小管中1，25-二羥維生素D3的產(chǎn)生，通過增加24-羥化酶的轉(zhuǎn)錄來激活降解[36]，從而阻止維生素D 相關(guān)的腸道對磷的吸收，并對PTH 水平進(jìn)行調(diào)節(jié)。

維生素D-PTH 軸在CKD 患者中發(fā)揮了重要作用。CKD 患者早期血鈣、磷和PTH 基本維持正常，隨著腎功能的惡化，腎臟1，25-二羥維生素D3合成下降[37]。因此，出現(xiàn)低鈣和高磷血癥，PTH 進(jìn)一步釋放，引起繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)。在尿毒癥患者行腎移植術(shù)后，隨著腎功能的恢復(fù)，低鈣血癥及高磷血癥得到糾正。因此，異種移植術(shù)后的高鈣血癥和低磷血癥也很常見[29]。在異種移植受者體內(nèi)，PTH 將作用于異種來源腎臟，并參與鈣的重吸收與磷的代謝。骨、甲狀旁腺和腎臟之間這種相互依賴的激素關(guān)系在異種移植實(shí)驗(yàn)中存在許多干擾因素，其正常生理功能可能受到一定影響。例如，豬腎移植入狒狒體內(nèi)后機(jī)體出現(xiàn)了低磷血癥[38]；豬的血鈣和磷酸鹽水平高于人類，這表明在不同物種間鈣磷代謝平衡確實(shí)存在差異。高鈣血癥也與早期移植腎功能延遲恢復(fù)和紅細(xì)胞增多有關(guān)[39]，維生素D 還可以作為RAAS 的負(fù)調(diào)節(jié)劑?？梢姡i腎移植后生理功能之間相互影響，共同調(diào)節(jié)腎臟的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。

此外，在豬-NHP 的實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)基因豬腎移植到狒狒體內(nèi)后存活最長時間超過500 d[40]。但由于這些模型采用的免疫抑制方案與臨床差異較大、且模型的生理結(jié)構(gòu)與人體存在差異等限制條件，這些實(shí)驗(yàn)未能很好地研究豬腎對人體生理刺激引起的不良反應(yīng)[41-42]。因此，豬異種移植物對涉及鈣和磷酸鹽平衡的生理刺激的反應(yīng)程度也還有待確定[33]。比如，豬腎移植物對人體內(nèi)產(chǎn)生的FGF-23、PTH 和維生素D 是否有類似的反應(yīng)，豬腎移植物中的鈣敏感受體對血鈣水平的變化是否也有類似的反應(yīng)，這些都值得進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 語

在目前移植器官短缺的情況下，對于長期等待腎移植的患者來說，接受豬腎移植的好處明顯大于慢性透析[43]。豬和人類的生理機(jī)能之間存在著差異，這會導(dǎo)致一些未知的不良反應(yīng)。豬腎無法激活RAAS，或擾亂人類受者的磷酸鹽平衡，或造成腎性貧血，這是異種腎移植的潛在障礙。然而，這些障礙有望通過移植后的早期識別和管理來克服。近年來2 例成功的異種腎移植經(jīng)驗(yàn)表明，在關(guān)注排斥反應(yīng)、病毒傳播、免疫狀態(tài)等問題的同時，不能忽略對異種移植生理學(xué)的研究。在未來，研究者們可以借鑒目前已有的人源化胰島素、血清蛋白、凝血因子等基因修飾豬的方法去構(gòu)建模型，探究異種腎移植物生理方面的相關(guān)問題。隨著異種移植亞臨床研究的進(jìn)一步推進(jìn)，在不遠(yuǎn)的將來，異種來源EPO、RAAS、鈣磷代謝、維生素D3的生理相容性問題或?qū)⒊蔀檠芯繜狳c(diǎn)。