歐蘇文 孫備 李樂(lè)

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胰膽外科 肝脾外科教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,哈爾濱 150001

【提要】 微生物作為腫瘤內(nèi)重要的生物學(xué)組分,在腫瘤發(fā)生、進(jìn)展及藥物治療反應(yīng)等多個(gè)方面發(fā)揮重要功能。瘤內(nèi)微生物群在胰腺癌病因?qū)W研究領(lǐng)域取得一定進(jìn)展。本文系統(tǒng)解析胰腺腫瘤內(nèi)微生物特征及其對(duì)腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和免疫微環(huán)境的影響,闡述基于瘤內(nèi)微生物的胰腺癌潛在治療策略,以期為相關(guān)領(lǐng)域研究提供更多的思路與見(jiàn)解。

胰腺癌惡性程度極高,80%～85%的患者在確診時(shí)即為不可切除或出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,其5年生存率不足10%[1-2]。作為重要的消化性器官,胰腺曾被認(rèn)為處于“無(wú)菌狀態(tài)”,然而,越來(lái)越多的研究證實(shí),正常胰腺組織或胰腺腫瘤組織內(nèi)均存在特定的微生物。瘤內(nèi)微生物雖被證實(shí)能夠參與胰腺腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展,但其對(duì)胰腺癌生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及藥物治療方面的調(diào)控機(jī)制仍不明確。本文系統(tǒng)解析胰腺良、惡性腫瘤瘤內(nèi)微生物多樣性,探討瘤內(nèi)微生物在胰腺癌治療領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值,并結(jié)合筆者團(tuán)隊(duì)工作,淺談目前瘤內(nèi)微生物在胰腺癌研究領(lǐng)域的諸多問(wèn)題及爭(zhēng)議,為該領(lǐng)域相關(guān)研究拓展新的思路。

一、胰腺腫瘤內(nèi)微生物的來(lái)源

生理狀態(tài)下,胰腺組織內(nèi)存在少量微生物,當(dāng)腫瘤發(fā)生時(shí),腫瘤內(nèi)部的微生物豐度可升高至正常組織的1 000倍[3]。這些微生物源自何處是一個(gè)值得探討的問(wèn)題。一方面,從解剖學(xué)角度,胰腺病變導(dǎo)致胰液的成分或pH改變,使微生物易于通過(guò)胰管逆行進(jìn)入胰腺[4-5]。另一方面,腸道細(xì)菌可能自主進(jìn)入腸系膜淋巴結(jié),進(jìn)而通過(guò)免疫細(xì)胞運(yùn)輸至胰腺[6-8]。筆者研究發(fā)現(xiàn),在急、慢性胰腺炎及胰腺腫瘤小鼠模型中,腸道菌群失衡可導(dǎo)致腸道局部炎癥反應(yīng),主要表現(xiàn)為炎癥因子如IL-17等大量釋放,進(jìn)而破壞腸道屏障功能,導(dǎo)致腸道內(nèi)細(xì)菌極易透過(guò)腸道屏障,進(jìn)入血液或者腸系膜淋巴組織,最終遷移至胰腺。此外,正常胰腺與胰腺腫瘤中均可檢出常見(jiàn)口腔細(xì)菌,如牙齦卟啉單胞菌等,并且,其菌群組成與口腔菌群極為相似,提示細(xì)菌還能夠借助“口腔-血液途徑”實(shí)現(xiàn)口腔菌群的重定位[5,9-10]。

二、胰腺腫瘤內(nèi)微生物的特征

因特殊的組織學(xué)特性,胰腺囊性腫瘤內(nèi)微生物菌落極為獨(dú)特。Li等[11]研究發(fā)現(xiàn),胰腺囊性占位的囊液中主要以擬桿菌屬、埃希菌屬或志賀菌屬和氨基酸球菌屬為主;并且不同類型囊性占位囊液中的微生物組成并無(wú)差異。作為最常見(jiàn)的胰腺囊性腫瘤,胰腺導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀黏液瘤(intraductal papillary mucinous neoplasm,IPMN)囊液中細(xì)菌豐度顯著高于其他類型囊性腫瘤[12],而且高度不典型增生IPMN囊液的細(xì)菌DNA拷貝數(shù)顯著高于低度不典型增生IPMN。高度不典型增生IPMN囊液內(nèi)主要以顆粒菌屬、沙雷菌屬和梭桿菌屬為主,而低度不典型增生的IPMN囊液則以甲基桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和丙酸桿菌屬為主。Hozaka等[13]對(duì)IPMN和正常胰腺組織的石蠟樣本進(jìn)行16s rDNA 測(cè)序,發(fā)現(xiàn)二者在物種豐度與多樣性方面并無(wú)差異,但浸潤(rùn)型IPMN中梭桿菌的相對(duì)豐度顯著高于非浸潤(rùn)型IPMN,提示瘤內(nèi)微生物可能參與IPMN的進(jìn)展[14]。目前,多數(shù)研究通過(guò)對(duì)比胰腺良性或低度惡性腫瘤與惡性腫瘤瘤內(nèi)微生物的差異,探究其在腫瘤診斷以及良、惡性鑒別中的應(yīng)用價(jià)值。然而,因不同類型胰腺囊性腫瘤的組織結(jié)構(gòu)、起源均不盡相同,瘤內(nèi)微生物多樣性及成分復(fù)雜,同時(shí),部分囊液的獲取依賴于超聲內(nèi)鏡等手段,獲得的瘤內(nèi)微生物易受到醫(yī)源性操作的影響,如胃內(nèi)容物及口腔細(xì)菌污染等,因此,筆者建議應(yīng)慎重看待瘤內(nèi)微生物在評(píng)估胰腺腫瘤良惡性方面的作用。

對(duì)于胰腺癌與正常胰腺組織內(nèi)的菌群是否存在差異這一問(wèn)題,目前仍存爭(zhēng)議[9,15-16]。研究發(fā)現(xiàn),胰腺癌組織中主要以變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門為主;卟啉單胞菌屬、梭桿菌屬、普雷沃菌屬、二氧化碳嗜纖維菌屬、嗜血桿菌屬及月形單胞菌屬豐度也較正常組織更高[5,9,15-17]。另外,不同預(yù)后的胰腺癌患者的腫瘤組織內(nèi)的菌群組成也存在明顯差異,長(zhǎng)期生存的患者比短期生存患者的腫瘤組織內(nèi)菌群多樣性更高[18]?；诨蚪M和轉(zhuǎn)錄組特征,胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)可分為基底樣、經(jīng)典和混合亞型[19]?；讟幽[瘤更具侵襲性且預(yù)后更差,微生物組分析提示,腫瘤內(nèi)主要以不動(dòng)桿菌屬、假單胞菌屬和Sphingopyxis屬為主,且其豐度與腫瘤預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[20]。此外,真菌作為另一類常見(jiàn)微生物,也被證實(shí)與胰腺癌的進(jìn)展相關(guān)[21-22]。Aykut等[3]研究發(fā)現(xiàn),PDAC組織中子囊菌門和擔(dān)子菌門顯著升高;進(jìn)一步研究提示,腫瘤組織中馬拉色菌屬主要參與PDAC進(jìn)展。

筆者認(rèn)為,目前關(guān)于胰腺癌菌群鑒定與分析中存在以下幾點(diǎn)問(wèn)題:(1)由于樣本取材、處理及保存方式的不同,易導(dǎo)致外源性細(xì)菌的污染,影響結(jié)果的可靠性。大多數(shù)研究采取石蠟切片進(jìn)行菌群分析,切勿忽略石蠟包埋過(guò)程中造成的微生物污染,因此,采取適當(dāng)?shù)膶?duì)照樣本,有助于合理排除“潛在”污染的微生物,也是獲得準(zhǔn)確結(jié)果的關(guān)鍵。(2)不同的測(cè)序手段、分析方法導(dǎo)致結(jié)果的不一致或不可重復(fù)。目前常規(guī)應(yīng)用的測(cè)序方法包括細(xì)菌16s rDNA、真菌ITS測(cè)序以及宏基因組測(cè)序等,然而,各種方法孰優(yōu)孰劣?16s rDNA與ITS測(cè)序獲取的微生物的類別較少,并且需要合理排除測(cè)序過(guò)程中導(dǎo)致的其他外源性微生物干擾。對(duì)于宏基因組測(cè)序,因尚缺乏適用于瘤內(nèi)微生物注釋的數(shù)據(jù)庫(kù)及金標(biāo)準(zhǔn),導(dǎo)致不同注釋策略獲得的結(jié)果存在一定的差異,因此需要慎重選擇[3,23-24]。

三、瘤內(nèi)微生物促進(jìn)胰腺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

胰腺癌因其生長(zhǎng)迅速且易出現(xiàn)早期轉(zhuǎn)移,進(jìn)而失去手術(shù)時(shí)機(jī),導(dǎo)致預(yù)后較差。瘤內(nèi)微生物被證實(shí)通過(guò)一系列機(jī)制參與胰腺癌進(jìn)展,如牙齦卟啉單胞菌激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)AKT信號(hào)通路,進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[9,25];在小鼠模型中,胰腺癌內(nèi)真菌,如球形馬拉色菌能通過(guò)激活甘露糖結(jié)合凝集素或補(bǔ)體3促進(jìn)胰腺癌生長(zhǎng)[3]。然而,在體外實(shí)驗(yàn)中,不同細(xì)菌感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖能力影響差異巨大,較低的MOI(如1∶1或50∶1)能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng),而較高的MOI(500∶1)則抑制腫瘤生長(zhǎng)[9]。筆者認(rèn)為,需合理應(yīng)用體外模型研究微生物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖能力的影響。就研究方法而言,采用與瘤內(nèi)細(xì)菌相同或近似的微生物豐度干預(yù)腫瘤細(xì)胞,才能準(zhǔn)確地反映其對(duì)腫瘤生物學(xué)特性的改變。此外,瘤內(nèi)微生物還能夠影響腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移,如具核梭桿菌通過(guò)誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞與癌旁正常細(xì)胞以自分泌和旁分泌的方式釋放炎癥因子(粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、C-X-C基序趨化因子配體1、IL-8及巨噬細(xì)胞炎性蛋白3α等),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲與遷移[26-27]。胰腺癌腫瘤微環(huán)境中不僅包括大量腫瘤上皮細(xì)胞與腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer associated fibroblasts,CAFs),還包括各種免疫細(xì)胞以及內(nèi)分泌細(xì)胞等,那么何種細(xì)胞主要參與瘤內(nèi)微生物介導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移?筆者研究發(fā)現(xiàn),瘤內(nèi)微生物廣泛存在于腫瘤上皮細(xì)胞與CAFs中,隨著單細(xì)胞研究技術(shù)的廣泛應(yīng)用,能夠更清晰地描繪瘤內(nèi)微生物在不同腫瘤成分中的分布,結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù),可以進(jìn)一步理解瘤內(nèi)微生物在不同細(xì)胞亞群中的功能及其在腫瘤進(jìn)展中的作用與動(dòng)態(tài)變化。

四、瘤內(nèi)微生物重塑腫瘤免疫微環(huán)境

胰腺癌瘤內(nèi)菌群能夠重塑腫瘤免疫微環(huán)境,影響腫瘤生長(zhǎng)及對(duì)藥物治療的反應(yīng)。在KrasG12D/Pdx1-Cre小鼠模型中,抗生素能夠有效清除胰腺內(nèi)微生物,抑制組織內(nèi)骨髓源性免疫抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSC)富集,促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞Th1分化及CD8+T細(xì)胞激活[15]。同時(shí),組織內(nèi)微生物選擇性激活Toll樣受體,驅(qū)動(dòng)單核細(xì)胞向腫瘤抑制性表型分化,介導(dǎo)T細(xì)胞的免疫耐受,最終加速腫瘤進(jìn)展。Riquelme等[18]通過(guò)構(gòu)建人源化糞菌移植小鼠模型,證實(shí)了來(lái)自長(zhǎng)期生存的胰腺癌患者的腸道菌群通過(guò)改變胰腺腫瘤內(nèi)菌群組成,增強(qiáng)腫瘤CD8+T細(xì)胞活化并抑制MDSC和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞富集,從而遏制腫瘤生長(zhǎng)。此外,腫瘤內(nèi)某些特定微生物也被證實(shí)通過(guò)調(diào)控免疫影響腫瘤進(jìn)展。具核梭桿菌通過(guò)CXCL1-CXCR2軸誘導(dǎo)的MDSC向瘤內(nèi)遷移,抑制CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn),加速腫瘤生長(zhǎng)[26];牙齦卟啉單胞菌通過(guò)刺激中性粒細(xì)胞趨化因子的產(chǎn)生,進(jìn)而招募中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及誘導(dǎo)彈性蛋白酶分泌,促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[9]。那么是否可以通過(guò)重塑腸道菌群進(jìn)而影響胰腺及腫瘤免疫微環(huán)境?筆者研究發(fā)現(xiàn),對(duì)抗生素處理后的小鼠進(jìn)行糞菌移植能夠顯著上調(diào)胰腺組織中菌群相對(duì)豐度,同時(shí)可影響組織內(nèi)巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞的分布,提示可以通過(guò)糞菌移植實(shí)現(xiàn)對(duì)胰腺癌內(nèi)腫瘤菌群豐度的調(diào)控,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)胰腺癌組織內(nèi)免疫微環(huán)境重塑[28-29]。

五、瘤內(nèi)微生物對(duì)胰腺癌治療的影響

Geller等[30]研究發(fā)現(xiàn),攜帶長(zhǎng)型胞苷脫氨酶(long isoform of the enzyme cytidine deaminase,CDDL)基因的一大類細(xì)菌能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對(duì)吉西他濱的耐藥。CDDL通過(guò)代謝吉西他濱使其失活,降低腫瘤內(nèi)藥物濃度,使腫瘤細(xì)胞得以逃避化療藥物的殺傷。含有CDDL的細(xì)菌主要屬于γ變形菌門,且其已被證實(shí)在胰腺癌組織中具有較高的豐度。上述結(jié)果提示,通過(guò)改變腫瘤內(nèi)特定菌群豐度能夠逆轉(zhuǎn)以吉西他濱為核心的化療耐藥。抗生素作為系統(tǒng)性清除細(xì)菌最簡(jiǎn)單易行的手段,已被證實(shí)能夠顯著延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移性或不可切除胰腺癌患者預(yù)后,而其對(duì)可切除腫瘤患者預(yù)后無(wú)明顯影響;并且抗生素能夠有效增強(qiáng)以吉西他濱和5-氟尿嘧啶為基礎(chǔ)的化療效果,這也提示通過(guò)特定抗生素靶向干預(yù)腫瘤組織內(nèi)菌群將有助于提高腫瘤對(duì)化療的反應(yīng)[31]。免疫治療適用于高微衛(wèi)星不穩(wěn)定或錯(cuò)配修復(fù)基因缺陷的亞型腫瘤,由于胰腺癌組織內(nèi)缺乏免疫細(xì)胞浸潤(rùn)且僅有2%腫瘤存在上述突變,免疫治療的效果差強(qiáng)人意[32]。雖然有研究提示,口服抗生素聯(lián)合抗PD-1能夠延緩胰腺癌進(jìn)展,但其對(duì)腫瘤內(nèi)菌群改變的作用以及腫瘤免疫狀態(tài)的影響仍需進(jìn)一步探究[15]。

六、針對(duì)瘤內(nèi)微生物的治療策略

瘤內(nèi)微生物廣泛存在且具組織特異性,針對(duì)瘤內(nèi)菌開(kāi)發(fā)靶向治療手段將為胰腺癌治療提供全新的方向。筆者認(rèn)為,抗生素雖然能夠降低腫瘤內(nèi)微生物豐度,但長(zhǎng)期應(yīng)用極易導(dǎo)致細(xì)菌耐藥、腸道菌群紊亂及繼發(fā)真菌感染等,其安全性與可靠性備受爭(zhēng)議。雖然目前眾多研究試圖探究如何通過(guò)精準(zhǔn)給藥改變腫瘤內(nèi)菌群豐度,實(shí)現(xiàn)對(duì)化療藥物的增敏作用,然而,目前研究的局限性在于(1)缺乏合理的動(dòng)物模型。大多研究采用小鼠皮下瘤模型予以瘤內(nèi)注射或者瘤旁注射的方式,最大程度改變腫瘤內(nèi)微生物豐度,然而,因皮下瘤通過(guò)皮膚直接與外界接觸,其微生物豐度難以控制。(2)靶向特定器官抗生素的篩選。目前尚無(wú)靶向抗生素能夠特定到達(dá)胰腺或者胰腺癌內(nèi),實(shí)現(xiàn)對(duì)靶器官微生物的定點(diǎn)清除。研究顯示噬菌體可以感染和裂解細(xì)菌,且對(duì)細(xì)菌物種具有高度的特異性,在治療細(xì)菌感染方面具有一定的優(yōu)勢(shì),因此,噬菌體療法已被考慮作為清除瘤內(nèi)細(xì)菌的一種手段[33-34]。通過(guò)構(gòu)建以噬菌體引導(dǎo)的“生物-非生物混合納米系統(tǒng)”,不僅能夠清除瘤內(nèi)具核梭桿菌,還能夠增強(qiáng)化療反應(yīng)、降低藥物用量及其毒性[35]。此外,通過(guò)腸道菌群移植、瘤內(nèi)菌群干預(yù)等方式改變瘤內(nèi)微生物,也可作為一種潛在治療策略。

七、未來(lái)展望

瘤內(nèi)微生物作為一個(gè)全新領(lǐng)域,在腫瘤治療方面存在巨大潛力,但目前尚缺乏基于臨床樣本的大規(guī)模測(cè)序分析,需要通過(guò)解析、識(shí)別及驗(yàn)證特定微生物在腫瘤中的豐度,并可視化其在腫瘤微環(huán)境中的定位,進(jìn)一步采用多組學(xué)研究策略,系統(tǒng)揭示瘤內(nèi)微生物與轉(zhuǎn)錄組、代謝組之間的內(nèi)在聯(lián)系。此外,微生物與腫瘤微環(huán)境的交互機(jī)制仍有待于進(jìn)一步探索,需要通過(guò)微生物與腫瘤細(xì)胞、CAFs、免疫細(xì)胞等共培養(yǎng)等技術(shù)手段,深入探究瘤內(nèi)微生物對(duì)不同細(xì)胞亞型的調(diào)控作用及其在腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及藥物治療等方面的分子機(jī)制。上述研究不僅有助于推動(dòng)微生物移植或益生菌治療在臨床中的探索,同時(shí)也為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)靶向相關(guān)通路、關(guān)鍵蛋白和代謝物的小分子抑制劑,提高腫瘤對(duì)化療甚至免疫治療的反應(yīng)提供更多的轉(zhuǎn)化基礎(chǔ)。

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