［摘要］目的識別糖尿病神經(jīng)病變的分子失調(diào)機制及復方芪鷹顆粒的治療作用機制。方法從GEO數(shù)據(jù)庫下載糖尿病神經(jīng)病變和糖尿病相關(guān)的GSE42568數(shù)據(jù)集，進行差異表達基因分析、共表達分析和富集分析，鑒定共表達模塊基因及其參與的生物作用。利用qRT-PCR反應(yīng)檢測核心基因的表達。通過2型糖尿病神經(jīng)病變患者和大鼠模型判斷復方芪鷹顆粒的治療作用及相關(guān)機制。結(jié)果糖尿病神經(jīng)病變與糖尿病之間有1965個顯著差異表達基因，并聚類為6個共表達模塊。富集結(jié)果顯示重要模塊基因顯著參與神經(jīng)調(diào)節(jié)及氧化應(yīng)激相關(guān)生物功能和信號通路。與對照組比較，核心基因APOA1和MCTP1在糖尿病神經(jīng)病變患者中顯著上調(diào)，而FABP4、SCD、ADIPOQ和PLIN1則顯著下調(diào)。動物實驗表明復方芪鷹顆粒對大鼠的糖尿病神經(jīng)病變具有治療作用，且與氧化應(yīng)激相關(guān)。此外，復方芪鷹顆粒不僅可以緩解DN患者的氧化應(yīng)激水平，還對核心失調(diào)基因的表達有影響。結(jié)論復方芪鷹顆?？梢酝ㄟ^抑制氧化應(yīng)激加快神經(jīng)傳導速度，改善糖尿病神經(jīng)病變的臨床癥狀。

［關(guān)鍵詞］糖尿病神經(jīng)病變；復方芪鷹顆粒；氧化應(yīng)激；差異表達基因

doi：10.3969/j.issn.1674-7593.2023.06.016

MolecularDysregulationMechanismsofDiabeticNeuropathyandtheEffectofCompoundQiyingGranuleonIt

Abudushalamu·Abudureyimu，Akebaier·Wupu，DingQi，LiuTao，HuXiaoling**

TheAffiliatedTraditionalChineseMedicineHospitalofXinjiangMedicalUniversity，Urumqi830000

**Correspondingauthor：HuXiaoling，email：li29852721@163.com

［Abstract］ObjectiveToidentifythemoleculardysregulationmechanismofdiabeticneuropathyandthetherapeuticmechanismofCompoundQiyingGranule.MethodsGSE42568datasetsrelatedtodiabeticneuropathyanddiabetesweredownloadedfromtheGEOdatabasefordifferentialexpressiongeneanalysis，co-expressionanalysis，andenrichmentanalysistoidentifyco-expressedmodulegenesandtheirbiologicalrolesinvolved.TheexpressionofcoregeneswasdetectedusingqRT-PCRreactions.Patientswithtype2diabeticneuropathyandratmodelswereusedtodeterminethetherapeuticeffectsandrelatedmechanismsofCompoundQiyingGranules.ResultsTherewere1965significantlydifferentiallyexpressedgenesbetweendiabeticneuropathyanddiabetes，whichwereclusteredinto6co-expressionmodules.Theenrichmentresultsshowedthatimportantmodulegenesweresignificantlyinvolvedinneuromodulationandoxidativestress-relatedbiologicalfunctionsandsignalingpathways.Comparedwiththecontrolgroup，thecoregenesAPOA1andMCTP1weresignificantlyup-regulatedindiabeticneuropathypatients，whileFABP4，SCD，ADIPOQandPLIN1weresignificantlydown-regulated.AnimalexperimentsshowedthatCompoundQiyingGranulehadatherapeuticeffectondiabeticneuropathyinratsandwasassociatedwithoxidativestress.Inaddition，CompoundQiyingGranulecouldnotonlyalleviatetheoxidativestresslevelinDNpatients，butalsohadaneffectontheexpressionofcoredysregulatedgenes.ConclusionCompoundQiyingGranulecanacceleratenerveconductionvelocityandimprovetheclinicalsymptomsofdiabeticneuropathybyinhibitingoxidativestress.

［Keywords］Diabeticneuropathy;CompoundQiyingGranules;Oxidativestress;Differentiallyexpressedgenes

糖尿病被認為是21世紀現(xiàn)代社會的一個主要的保健問題［1］。糖尿病神經(jīng)病變（Diabeticneuropathy，DN）是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥，并影響到2型糖尿病患者，在50%以上的DN患者中出現(xiàn)嚴重的神經(jīng)損傷［2-3］。DN主要是感覺神經(jīng)紊亂以及運動神經(jīng)功能障礙，盡管經(jīng)過了幾十年的研究，除了改善生活方式和控制糖尿病之外，沒有其他較好的治療方法［4-6］。高血糖被認為是DN發(fā)展的主要病理生理因素，但其具體的機制有待闡述。有證據(jù)表明，神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激分子可能會導致DN［7］。由于缺乏對DN的復雜性和不同病因的了解，其靶向治療的發(fā)展受到了阻礙。依帕司他是目前治療DN的主要藥物，但常出現(xiàn)腹部不適和腹瀉等不良反應(yīng)。復方芪鷹顆粒是新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院的院內(nèi)制劑，已被廣泛應(yīng)用于DN的治療，但其具體作用機制尚不明確。本研究針對GEO數(shù)據(jù)庫中DN和糖尿病相關(guān)表達基因鑒定DN的可能分子機制和潛在靶標，進一步探討復方芪鷹顆粒治療DN的作用機制。

1材料與方法

1.1生物信息學分析

從GEO數(shù)據(jù)庫（www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中收集DN數(shù)據(jù)集GSE42568。通過affy包的RMA函數(shù)對原始數(shù)據(jù)進行標準化，并構(gòu)建基因表達譜。然后通過limma包構(gòu)建DN和糖尿病的差異表達基因譜。設(shè)置篩選閾值Plt;0.05鑒定差異表達基因。通過加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析差異表達基因。對感興趣模塊基因通過STRING數(shù)據(jù)庫（https：//cn.string-db.org/）建立蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein-proteininteraction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，將網(wǎng)絡(luò)內(nèi)連接度最高的基因作為核心基因。利用R語言Clusterprofiler包對模塊基因進行基因本體（Geneontology，GO）分析。另外，通過基因集富集分析軟件計算基因參與的京都基因和基因組百科全書（Kyotoencyclopediaofgenesandgenomes，KEGG）信號通路。Plt;0.05為篩選閾值。

1.2臨床研究

分別收集3例健康受試者（對照組）、3例2型DN患者（神經(jīng)病變組）、3例接受復方芪鷹顆粒治療4周（復方治療組）以及3例接受依帕司他治療4周（依帕司他組）的DN患者血清?；颊呔炇鹬橥鈺?。本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學臨床中心倫理委員會批準。

用Trizol從血液樣本中分離出總RNA，用PrimeScriptTM對RNA進行反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用該cDNA為模板，采用SYBRGreenMasterMix進行實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（Quantitativereal-timepolymerasechainreaction，qRT-PCR）。用2–ΔΔCT法計算mRNA的相對表達。GAPDH用作內(nèi)參基因，引物序列見表1。

通過ELISA試劑盒檢測血清中的超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase，SOD）（批號Aug2019）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）（批號Aug2019）及8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxy-2deoxyguanosine，8-OHDG）（批號Aug2019）水平，ELISA試劑盒均購自上海江萊生物科技有限公司。

1.3動物實驗

DN大鼠的造模過程參考前期研究［8-9］。60只8周齡雄性Wistar大鼠，購自新疆醫(yī)科大學，體質(zhì)量180～220g，飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～26℃，相對濕度40%～70%。在自由飲水和標準飲食2周后，隨機分為對照組、神經(jīng)病變組、復方治療組（2.34g/kg）和依帕司他組（0.25g/kg），各15只。大鼠連續(xù)喂食高脂飲食8周，禁食14h后，腹腔注射鏈脲佐菌素30mg/kg，第3天再次注射鏈脲佐菌素30mg/kg。血糖≥11.1mmol/L的大鼠被認為是糖尿病的成功模型。在糖尿病大鼠的基礎(chǔ)上繼續(xù)高脂飲食4周后，使用medicalkeypoint-4workstation肌電圖儀測量糖尿病大鼠下肢坐骨神經(jīng)的感覺和運動傳導速度，以感覺或運動傳導速度減慢＞11%判斷為DN模型成功。復方治療組和依帕司他組連續(xù)給藥4周，神經(jīng)病變組和對照組每日均以相同劑量的蒸餾水灌胃。10%水合氯醛（300mg/kg）麻醉下處死大鼠，分離腓腸神經(jīng)節(jié)組織和血清。所有動物護理和實驗方案均經(jīng)新疆醫(yī)科大學動物護理和倫理委員會審批。

4%甲醛固定腓腸神經(jīng)節(jié)組織，蠟塊包埋后通過Kullshitzky髓鞘染色法染色。計數(shù)發(fā)生神經(jīng)病變（結(jié)周脫髓鞘、磷脂過度皺褶、結(jié)間隙增多、節(jié)段性脫髓鞘、髓鞘發(fā)生潰變/Wallerian變性）的纖維，計算病變纖維占總纖維數(shù)的百分率。

通過ELISA試劑盒檢測血清中的SOD（批號Aug2019）、MDA（批號Aug2019）及8-OHDG（批號Aug2019）水平。ELISA試劑盒均購自上海江萊生物科技有限公司。

1.4統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布計量資料采用±s表示，多組間的比較采用單因素方差分析，兩組間進一步比較采用LSD-t檢驗，以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1與DN相關(guān)的差異表達基因及生物功能

差異分析結(jié)果顯示DN與糖尿病患者之間有1965個顯著差異表達基因，見圖1。通過加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析將具有協(xié)同表達模式的基因聚類為6個模塊，見圖2。其中，灰色模塊與DN的正相關(guān)性最高，青綠色模塊與DN的負相關(guān)性最高，見圖3。

GO富集結(jié)果顯示灰色模塊基因涉及神經(jīng)調(diào)節(jié)、氧化還原過程等生物功能，見圖4。MCTP1是模塊中參與氧化應(yīng)激的上調(diào)差異表達基因。KEGG富集結(jié)果發(fā)現(xiàn)青綠色模塊基因在過氧化物酶體增殖物激活受體（Peroxisomeproliferators-activatedreceptors，PPAR）信號通路中顯著富集，見圖5。通過對青綠色模塊構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)識別了連接度最高的前10個基因作為核心基因，見圖6。其中，下調(diào)的FABP4、SCD、ADIPOQ和PLIN1，以及上調(diào)的APOA1參與了PPAR信號通路，被識別為關(guān)鍵基因。

2.2復方芪鷹顆粒在DN患者中的氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)作用

神經(jīng)病變組核心基因APOA1和MCTP1高于對照組（P＜0.05），而FABP4、SCD、ADIPOQ和PLIN1則低于對照組（P＜0.05）；依帕司他組和復方治療組的APOA1和MCTP1表達低于神經(jīng)病變組（P＜0.05），F(xiàn)ABP4、SCD、ADIPOQ和PLIN1表達高于神經(jīng)病變組（P＜0.05），見圖7。神經(jīng)病變組MDA和8-OHDG水平高于對照組（P＜0.05），SOD水平低于對照組（P＜0.05）；依帕司他組和復方治療組的MDA和8-OHDG水平低于神經(jīng)病變組，SOD水平高于神經(jīng)病變組（P＜0.05），見圖8。

2.3復方芪鷹顆粒改善DN大鼠氧化應(yīng)激水平

神經(jīng)病變組大鼠腓腸神經(jīng)損傷纖維百分比高于對照組（P＜0.05）；依帕司他組和復方治療組腓腸神經(jīng)損傷纖維百分比低于神經(jīng)病變組（P＜0.05），見圖9A。神經(jīng)病變組MDA和8-OHDG水平高于對照組（P＜0.05），SOD水平低于對照組（P＜0.05）；依帕司他組和復方治療組的MDA和8-OHDG水平低于神經(jīng)病變組（P＜0.05），SOD水平高于神經(jīng)病變組（P＜0.05），見圖9B～D。

3討論

與單純糖尿病相比，糖尿病并發(fā)神經(jīng)病變的發(fā)病機制是多因素的，需要針對這些機制給出綜合方法干預(yù)治療。本研究為實現(xiàn)這一目標邁出了重要的一步，確定了DN相關(guān)的基因集，這些基因的差異表達可能參與了DN的發(fā)展。初步分析發(fā)現(xiàn)差異表達基因聚類為6個共表達模塊。每一個模塊可能表征著不同的分子機制［10］。與DN的正相關(guān)性最高的灰色模塊基因顯著參與了神經(jīng)調(diào)節(jié)、炎癥和氧化還原過程的調(diào)節(jié)。DN的特點是神經(jīng)功能障礙和四肢神經(jīng)末梢變性，在DN的臨床和基礎(chǔ)研究中，絕大多數(shù)集中在神經(jīng)元成分上［11］。評估DN的神經(jīng)損傷是幫助臨床醫(yī)生診斷和治療DN的有效工具［12］。另外，長期糖尿病可導致神經(jīng)元呼吸鏈活性降低，活性氧增加，加劇了細胞內(nèi)損傷和細胞功能障礙，同時激活絲裂原活化蛋白激酶［13-15］。這可能促進下游細胞氧化應(yīng)激的激活，導致更多的神經(jīng)元損傷［14］。PPAR信號具有重要的代謝調(diào)節(jié)作用，可能參與DN過程［16-17］。已有研究證明了PPAR對DN具有保護作用［18-19］。這與本研究結(jié)果相符合，富集PPAR信號的模塊與DN具有負相關(guān)性。

高華等研究顯示，復方芪鷹顆粒對大鼠DN具有逆轉(zhuǎn)作用［20］。復方芪鷹顆粒組方由5味藥物組成：黃芪補氣健脾為君；黃精補氣養(yǎng)陰，鷹嘴豆調(diào)補陰陽、補益中氣，并用為臣；丹參活血化瘀，蟬蛻疏風祛邪，共為佐藥。該方藥可明顯改善麻木、疼痛、發(fā)涼等臨床癥狀，并可改善運動神經(jīng)及感覺神經(jīng)傳導速度，具有協(xié)同降糖作用［21］。復方芪鷹顆粒不僅改善了神經(jīng)纖維的損傷，還降低了DN患者和大鼠的氧化應(yīng)激水平。越來越多的證據(jù)表明DN與氧化應(yīng)激有關(guān)［22］。氧化應(yīng)激參與DN的主要證據(jù)是DN實驗動物模型產(chǎn)生過量的自由基，內(nèi)源性抗氧化酶的活性降低，這些作用在抗氧化治療中得到改善，并與緩解DN癥狀有關(guān)［23-24］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)復方芪鷹顆?？赏ㄟ^抑制氧化應(yīng)激途徑參與調(diào)節(jié)DN，這一點可以成為臨床試驗的重點進一步展開研究。

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（2021-09-24收稿）