徐 清,張姝迪,強(qiáng)詩雨,邢運(yùn)鑫,馬一凡,阮曉旭,周靜萍,鄧 超,2

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.口腔醫(yī)學(xué)院;2.重大疾病非編碼RNA轉(zhuǎn)化研究安徽普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 蕪湖 241002)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)簡稱OSCC,是最常見的頭頸部惡性腫瘤之一。在過去20年里OSCC的5年病死率高達(dá)35%[1],深入研究OSCC發(fā)生和發(fā)展相關(guān)基因,對于檢測OSCC侵襲轉(zhuǎn)移以及評估臨床預(yù)后非常重要。最近研究表明長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在基因轉(zhuǎn)錄、mRNA穩(wěn)定性、表觀遺傳改變、蛋白質(zhì)性能及關(guān)系等方面均起著關(guān)鍵作用[2-3],與腫瘤的發(fā)生發(fā)展亦密切相關(guān)[4-5]。lncRNA SNHG1又名linc00057,研究發(fā)現(xiàn)其可通過不同的信號通路和分子機(jī)制促進(jìn)或抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[6],但尚未發(fā)現(xiàn)其在OSCC中的作用。本研究采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測OSCC組織以及細(xì)胞系中l(wèi)ncRNA SNHG1的表達(dá)情況,通過慢病毒轉(zhuǎn)染改變其表達(dá),觀察lncRNA SNHG1對OSCC細(xì)胞N-cadherin、MMP-9表達(dá)的影響,探究其在OSCC發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病例資料 2020年10月～2021年7月在弋磯山醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除且術(shù)后病理確診的20例OSCC患者,術(shù)前均未接受放化療,男13例,女7例,年齡43～81(62.4±10.3)歲。均于術(shù)中留取距原發(fā)灶邊緣5 cm處的癌旁組織為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn):①所有OSCC患者均未接受術(shù)前放療、化療等治療;②所有患者均經(jīng)術(shù)前病理檢查診斷為OSCC;③臨床資料完整。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 胎牛血清(上海雙洳生物科技有限公司);Western及IP細(xì)胞裂解液、PMSF、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配置試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);Defined K-SFM、DMEM、胰蛋白酶(美國賽默飛世爾科技公司);熒光定量檢測試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司];CCK-8(合肥睿捷生物科技有限公司);兔抗人N-cadherin、Vimentin、MMP-9多克隆抗體、山羊抗鼠IgG(H+L)(武漢愛博泰克生物科技有限公司);lncRNA SNHG1慢病毒載體、polybrene[和元生物技術(shù)(上海)股份有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR檢測OSCC細(xì)胞中SNHG1、N-cadherin、MMP-9、vimentin基因表達(dá)情況 用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)CAL27、HN6、SCC25OSCC細(xì)胞,HOK細(xì)胞則接種于含生長因子的Defined K-SFM培養(yǎng)基,細(xì)胞均置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),當(dāng)培養(yǎng)瓶底部融合率達(dá)到90%時(shí),qRT-PCR檢測各細(xì)胞系中長鏈非編碼RNA SNHG1的相對表達(dá)量。PCR擴(kuò)增條件:95℃ 15 min,95℃ 10 s,60℃ 30 s,95℃ 15 s,共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-△△Ct法計(jì)算lncRNA SNHG1的相對表達(dá)量,引物序列如表1所示。

表1 引物序列

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 收集對數(shù)增殖階段的CAL27細(xì)胞,接種到24孔板(1×105/孔,500 μL/孔),當(dāng)?shù)?天細(xì)胞融合率達(dá)到30%時(shí),分別加入polybrene為5 μg/mL,感染復(fù)數(shù)(MOI)為20的lncRNA SNHG1慢病毒空轉(zhuǎn)載體(LV-CN組)和lncRNA SNHG1慢病毒過表達(dá)載體(LV-SNHG1組),病毒感染12 h后更換為正常的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在病毒感染細(xì)胞后96 h,更換為含有相應(yīng)最佳濃度(1 μg/mL)的嘌呤霉素篩選培養(yǎng)基10 d后,在嘌呤霉素濃度減半(0.5 μg/mL)的完全培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。

1.2.3 CCK-8檢測細(xì)胞增殖 收集嘌呤霉素篩選10 d后各組對數(shù)生長期CAL27,0.25%胰蛋白酶消化,制備單細(xì)胞懸液,接種至96孔板(2 000個(gè)/孔,100 μL/孔),設(shè)置3個(gè)時(shí)間梯度,每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔,在細(xì)胞貼壁后(約4 h)的0、24、48、96 h時(shí),分別在避光條件下每孔加入10 μL CCK-8溶液,盡量避免打出氣泡,然后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育,3 h后檢測各孔吸光度(OD450 nm),繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移 收集轉(zhuǎn)染后嘌呤霉素已篩選10 d且各組處于對數(shù)生長期CAL27細(xì)胞,接種至6孔板(1×106/孔,2 mL/孔),當(dāng)?shù)?天細(xì)胞在孔中融合率達(dá)90%后,用1 mL的無菌藍(lán)槍頭沿著直尺垂直于6孔板豎向劃線,用PBS輕輕沖洗6孔板,重復(fù)沖洗2次后換成不含血清的DMEM培養(yǎng)基,此時(shí)在顯微鏡下觀察并拍照,作為0 h的圖片,此后分別于劃痕后6、12、24 h鏡下觀察并拍照,lmage J軟件分析細(xì)胞劃痕面積。

1.2.5 Western blot檢測N-cadherin、MMP-9蛋白的表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染后嘌呤霉素已篩選10 d的CAL27細(xì)胞,加入細(xì)胞裂解液于冰上裂解30 min,12 000 g離心5 min取上清,此即為細(xì)胞總蛋白,隨后根據(jù)BCA試劑盒的使用方法檢測各組細(xì)胞蛋白質(zhì)濃度并進(jìn)行定量,加入2×的loading buffer后,于100℃高溫煮沸使蛋白變性。通過電泳、轉(zhuǎn)膜、TBST清洗、封閉、孵育,顯影后采用凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照及應(yīng)用Image J軟件分析各條帶灰度值,最后分析出各蛋白的相對含量進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 OSCC組織與癌旁組織中l(wèi)ncRNA SNHG1的表達(dá) OSCC組織lncRNA SNHG1的表達(dá)水平(0.621±0.255)低于癌旁組織(1.053±0.196),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t配對=8.027,P<0.001)。

2.2 lncRNA SNHG1在OSCC細(xì)胞系中的表達(dá) 各OSCC細(xì)胞系相對于HOK細(xì)胞的表達(dá)量如圖1所示,CAL27、HN6相對于HOK細(xì)胞lncRNA SNHG1的表達(dá)含量降低(P<0.001),SCC25相對于HOK細(xì)胞lncRNA SNHG1的表達(dá)含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。因lncRNA SNHG1在CAL27細(xì)胞中的表達(dá)水平相對較低,故選用CAL27細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

n=3,F=85.95,P<0.001;***P<0.001。圖1 lncRNA SNHG1 mRNA在OSCC細(xì)胞系中的表達(dá)

2.3 過表達(dá)lncRNA SNHG1對OSCC細(xì)胞增殖的影響 CAL27細(xì)胞過表達(dá)SNHG1后lncRNA SNHG1的相對表達(dá)含量如圖2A所示,與LV-CN相比,LV-SNHG1組lncRNA SNHG1相對含量升高(t=58.850,P<0.001)。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2B所示,轉(zhuǎn)染24、48、96 h后,LV-SNHG1組細(xì)胞的吸光度值低于LV-CN組(t24 h=15.530,t48 h=12.760,t96 h=13.830,均P<0.001),表明lncRNA SNHG1的過表達(dá)能明顯抑制OSCC細(xì)胞的增殖能力。

A.過表達(dá)SNHG1后CAL27細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SNHG1 mRNA表達(dá)水平,n=3,***P<0.001;B.過表達(dá)SNHG1后CAL27細(xì)胞增殖水平變化,n=4,***P<0.001。圖2 過表達(dá)IncRNA SNHG1對OSCC細(xì)胞增殖的影響

2.4 過表達(dá)lncRNA SNHG1對OSCC細(xì)胞遷移的影響 細(xì)胞劃痕后6、12、24 h實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3、4所示,劃痕后6、12 h的LV-SNHG1組細(xì)胞愈合率較同時(shí)期的LV-CN組略低,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t6 h=1.142,t12 h=1.315,P>0.05),劃痕后24 h LV-SNHG1組的細(xì)胞愈合率低于同時(shí)期的LV-CN組(t24 h=19.520,P24 h<0.001),表明過表達(dá)SNHG1能抑制OSCC細(xì)胞的遷移能力。

n=3,***P<0.001。圖3 過表達(dá)SNHG1后不同時(shí)間細(xì)胞劃痕的愈合情況分析

圖4 過表達(dá)SNHG1后兩組不同時(shí)間劃痕面積的對比

2.5 過表達(dá)lncRNA SNHG1對OSCC細(xì)胞遷移、侵襲相關(guān)蛋白與基因表達(dá)的影響 相比于LV-CN組,LV-SNHG1組的N-cadherin、MMP-9的表達(dá)降低(t=2.682、4.399,P<0.05)。且N-cadherin、Vimentin、MMP-9的表達(dá)降低(t=16.730、6.656、4.939,P<0.01),見圖5、6,表明過表達(dá)SNHG1能抑制OSCC細(xì)胞的遷移、侵襲。

n=3,*P<0.05;**P<0.01。圖5 過表達(dá)SNHG1后N-cadherin、MMP-9的蛋白表達(dá)水平

n=3,**P<0.01。圖6 過表達(dá)SNHG1后N-cadherin、Vimentin、MMP-9的基因表達(dá)水平

3 討論

lncRNA是RNA的成員之一,被證明參與腫瘤發(fā)生發(fā)展、細(xì)胞增殖和遷移[7-8]。與正常組織相比,lncRNA在很多不同的癌癥組織中呈差異性表達(dá)[9],并可調(diào)節(jié)癌基因和抑癌基因的表達(dá)[10]。在OSCC研究中發(fā)現(xiàn)了lncRNA的異常表達(dá)。lncRNA PCBP1-AS和lncRNA MEG3在OSCC細(xì)胞系中低表達(dá)[11-12];通過上調(diào)lncRNA PCBP1-AS、lncRNA MEG3分別激活JAK2/STAT3信號通路、p53通路可抑制OSCC細(xì)胞增殖和侵襲,促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13]。因此從lncRNA角度分析OSCC的發(fā)病機(jī)制對早期診斷OSCC及評估病人的預(yù)后均具有重要意義。

為探究lncRNA SNHG1在OSCC中的具體作用機(jī)制與影響,本實(shí)驗(yàn)通過qRT-PCR實(shí)驗(yàn)分別檢測了lncRNA SNHG1在OSCC組織和在OSCC細(xì)胞系的表達(dá)。結(jié)果顯示lncRNA SNHG1在OSCC組織和細(xì)胞系的表達(dá)均明顯低于正常對照組,提示上調(diào)lncRNA SNHG1的表達(dá)水平可能會影響OSCC細(xì)胞的生物學(xué)性狀。本實(shí)驗(yàn)通過上調(diào)lncRNA SNHG1探究其對OSCC細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的調(diào)控和遷移侵襲相關(guān)蛋白及基因的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,上調(diào)lncRNA SNHG1明顯抑制了OSCC細(xì)胞CAL27的增殖、遷移、侵襲能力。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,上調(diào)lncRNA SNHG1后N-cadherin、MMP-9蛋白含量的表達(dá)明顯降低;qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過表達(dá)lncRNA SNHG1后N-cadherin、Vimentin、MMP-9基因的表達(dá)明顯降低,表明過表達(dá)SNHG1能明顯抑制OSCC細(xì)胞的遷移、侵襲。

綜上所述,本研究認(rèn)為上調(diào)lncRNA SNHG1能明顯抑制OSCC細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。在接下來的工作中,課題組還需要分析其在體內(nèi)模型中對腫瘤生長的抑制作用。lncRNA SNHG1的潛在靶基因和信號通路亦有待進(jìn)一步探索,為lncRNA SNHG1早期作為臨床腫瘤治療的分子靶點(diǎn)應(yīng)用提供額外的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時(shí)我們前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)lncRNA SNHG1在順鉑耐藥的OSCC細(xì)胞中高表達(dá),未來,我們將進(jìn)一步研究患者血清中SNHG1的表達(dá)以及l(fā)ncRNA SNHG1對順鉑耐藥的OSCC細(xì)胞的細(xì)胞功能影響,確保OSCC患者的治療過程能夠得到更快、更有效的治療選擇。SNHG1可作為OSCC的診斷性生物標(biāo)志物,并有望成為治療選擇的生物標(biāo)志物。