羅新?何夢竹?陳曦?萬健?張浪?李瑞?陳稷?田孟良

摘要：目的 克隆編碼麻牛膝（Cyathula capitata（Wall.） Moq.）CcTSK蛋白的基因全長，通過基因重組技術(shù)制備表達質(zhì)粒，對表達產(chǎn)物進行生物學預測和抑菌分析。方法 以麻牛膝嫩葉為材料，完成CcTSK基因cDNA的克隆。采用生信軟件分析該基因及編碼蛋白的生物學特征。構(gòu)建CcTSK基因原核表達載體，并轉(zhuǎn)入大腸埃希菌BL21（DE3）感受態(tài)中，IPTG誘導表達，考察CcTSK-GST融合蛋白的表達菌株對低濃度抗生素的敏感性、自身生長變化及在較高濃度抗生素下的存活率。結(jié)果 CcTSK基因的gDNA為12613 bp，CDS為3855 bp，共編碼1284個氨基酸。CcTSK蛋白為親水性不穩(wěn)定蛋白，沒有跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于沒有信號識別功能的非分泌蛋白，亞細胞定位預測該蛋白可能位于細胞核，并且具有核定位信號，含有TPR重復序列與LRR重復序列結(jié)構(gòu)域，二級結(jié)構(gòu)主要有α-螺旋（占53.89%）、無規(guī)卷曲（占32.79%）、延伸鏈（占8.88%）和β-轉(zhuǎn)角（占4.44%）。經(jīng)IPTG誘導后，CcTSK-GST融合蛋白的表達抑制大腸埃希菌生長。低濃度抗生素測試結(jié)果顯示，CcTSK-GST表達菌株對氯霉素（chloramphenicol， Cam）最敏感；高濃度抗生素處理下，CcTSK-GST的表達使得抑菌現(xiàn)象顯著增強。結(jié)論 成功獲得編碼CcTSK蛋白的基因全長及原核表達質(zhì)粒，并對其生物學特征進行了分析比較，該蛋白與擬南芥AtTSK蛋白有較高相似性。此外，CcTSK-GST融合蛋白的表達對大腸埃希菌增殖具有抑制作用，并且顯著增強抗生素所產(chǎn)生的抑菌現(xiàn)象。

關鍵詞：麻牛膝；TONSOKU；基因克?。簧镄畔W；抑菌；抗生素；增強效應

中圖分類號：R285文獻標志碼：A

Cloning， bioassay， and antibacterial activity of TONSOKU gene from Cyathula capitata （Wall.） Moq.

Luo Xin， He Meng-zhu， Chen Xi， Wan Jian， Zhang Lang， Li Rui， Chen Ji， and Tian Meng-liang

（College of Agronomy， Sichuan Agricultural University， Chengdu 611130）

Abstract Objective In order to predict the biological and antimicrobial analysis of the expressed product， the full length of the gene encoding CcTSK protein of Cyathula capitata （Wall.） Moq. was cloned and the expression plasmid was prepared by gene recombination. Methods The cDNA of CcTSK gene was cloned from tender leaves of Cyathula capitata （Wall.） Moq. Bioinformatics software was used to analyze the biological characteristics of the gene and its encoding protein. The prokaryotic expression vector of CcTSK gene was constructed and transferred into E. coli BL21（DE3） competent strain， and induced by isopropyl β-D-thiogalactopyranoside （IPTG）， to investigate the sensitivity of strains expressing CcTSK-GST fusion protein to low concentration of antibiotics， and their own growth and cell survival rate under high concentration of antibiotics. Results The gDNA and CDS of CcTSK gene were 12613 bp and 3，855 bp， encoding 1，284 amino acids. CcTSK protein is a hydrophilic unstable protein with no transmembrane domain and belongs to a non-secretory protein lacking the ability to recognize signals. Subcellular localization predicts that it may be located in the nucleus and has nuclear localization signal， as well as two domains containing TPR repeats and LRR repeats. The main secondary structures were α -helix （53.89%）， random coil （32.79%）， extended chain （8.88%）， and β-rotation （4.44%）. Induced by IPTG， expression of CcTSK-GST fusion protein inhibited the growth of E. coli. The results of low concentration antibiotic test showed that CcTSK-GST expressing strain was the most sensitive to chloramphenicol （Cam）， and the antibacterial effect was significantly enhanced at higher concentration of antibiotic. Conclusions The full length of the coding gene and prokaryotic expression plasmid of CcTSK protein were successfully obtained， and the biological characteristics of the protein were analyzed and compared. The protein had high similarity with the TSK protein of Arabidopsis（AtTSK）. In addition， the expression of CcTSK-GST fusion protein could inhibit the proliferation of E. coli， and significantly enhanced the bacteriostatic phenomenon produced by antibiotics.

Key words Cyathula capitata （Wall.） Moq.; TONSOKU; Gene cloning; Bioinformatics; Bacteriostatic; Antibiotic; Enhancement effect

在藥用植物川牛膝（Cyathula officinalis Kuan.）及其偽品麻牛膝的分子鑒定中，田孟良等[1]基于RAPD標記篩選出分子標記SCAR_L2，利用川牛膝全基因測序技術(shù)將該分子標記定位到了TONSOKU基因。但在川牛膝與麻牛膝中，TONSOKU基因產(chǎn)生差異的原因，以及該基因?qū)εＯスδ艿挠绊懮形纯芍?/p>

麻牛膝為莧科植物頭花杯莧，目前有關研究主要圍繞如何鑒定麻牛膝與川牛膝，包括形態(tài)鑒定[2-4]、分子鑒定[1，5]、化學成分和藥理作用的比較[6-10]。在藥理作用比較中發(fā)現(xiàn)，麻牛膝根部水煎藥液具有更強的小鼠急性毒性、免疫抑制作用和抗炎作用[8-9]，且麻牛膝多糖能夠顯著降低豬小腸上皮細胞炎癥因子IL-6的表達[10]。麻牛膝更顯著的抗炎作用為其成為區(qū)別于川牛膝的中藥材提供了可能性。

而TONSOKU基因最初是為研究擬南芥頂端分生組織功能而被鑒定的[11]。TONSOKU不同位置突變造成的植株表型不同，故根據(jù)表型差異對該基因的突變體分別命名為MGOUN3[11] 、TONSOKU[12]、BRUSHY1[13]，其中TONSOKU較為常用。目前，關于TONSOKU的研究主要以模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）和煙草（Nicotiana tabacum）為材料，并關注于該基因?qū)χ参锷L發(fā)育本身的調(diào)控作用[11-15]。

本實驗以麻牛膝TONSOKU基因為研究對象，克隆編碼麻牛膝CcTSK蛋白的基因全長，對該基因及所編碼蛋白質(zhì)的生物學特征進行分析，為川、麻牛膝基于RAPD標記的SCAR分子標記技術(shù)鑒定方法提供進一步參考。另外與川牛膝相比，麻牛膝具備更顯著的抗炎作用[9]，本實驗通過抗生素敏感性實驗及細胞生長實驗，觀察CcTSK蛋白表達而表現(xiàn)的抑菌性，為該基因的功能研究提供新參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

本實驗所用麻牛膝植株采自四川省雅安市寶興縣蜂桶寨鄉(xiāng)（北緯30°東經(jīng)102°）中藥材種植基地（海拔約1400 m），經(jīng)四川農(nóng)業(yè)大學田孟良教授鑒定為莧科麻牛膝（Cyathula capitata（Wall.） Moq.）[16]。

表達載體pGEX-6t-1由四川農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院提供；大腸埃希菌BL21（DE3）菌株購自博邁德生物公司。

1.1.2 主要試劑盒及設備

EASYspin Plus Plant RNA Kit（北京艾德萊生物科技有限公司）、HiScript? Ⅲ RT SuperMix for qPCR （+gDNA wiper）（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）、FastPure? Gel DNA Extraction Mini Kit（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）、SMARTer@RACE5/3 Kit（日本TaKaRa公司）、One Step Cloning Kit（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）。

超微量濃度測定儀（德國Implen公司）、恒溫培養(yǎng)箱（鄭州生元儀器有限公司）、恒溫振蕩器（江蘇太倉市實驗設備廠）、低溫離心機（大龍興創(chuàng)實驗儀器股份公司）。

1.2 gDNA、RNA的提取與cDNA的合成

稱取麻牛膝健康幼嫩葉片0.1 g，使用CTAB法提取植物gDNA。再次稱取0.1 g葉片并使用試劑盒提取植物總RNA，經(jīng)濃度測定及瓊脂糖凝膠電泳檢測后，以RNA為模板合成cDNA。

1.3 麻牛膝CcTSK基因克隆和測序

依據(jù)川牛膝基因組從頭測序組裝拼接的川牛膝TSK基因（CoTSK）作為參考序列[17]，進行引物設計，對cDNA序列擴增，并進行膠回收，經(jīng)酶切檢測后，將目的片段送往擎科生物公司測序獲得核心序列。以核心序列為模板，使用試劑盒進行cDNA末端快速擴增克隆，并通過膠回收、測序、序列拼接獲得該基因完整cDNA序列。設計gDNA特異引物對，進行PCR反應擴增，再進行膠回收及測序，通過序列拼接得到完整gDNA序列。引物設計軟件為primer 3.0和DNAMAN（表1）[16]。

1.4 麻牛膝CcTSK基因的生物信息學分析

拼接后的基因序列開放閱讀框由ORF Finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）完成，氨基酸序列由ExPASy（http：//web.expasy.org/translate/）完成。信號肽分析由SignalP-6.0（https：//biolib.com/DTU/SignalP-6/）網(wǎng)站完成。蛋白的親水性與疏水性由ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）完成，并通過ProtParam（http：//web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam）在線預測其理化性質(zhì)。利用SMART網(wǎng)站（http：//smart.embl-heidelberg.de/）預測CcTSK蛋白結(jié)構(gòu)域，跨膜區(qū)域由TMHMM-2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）完成。CcTSK蛋白亞細胞定位預測通過WoLF PSORT Prediction（https：//wolfpsort.hgc.jp/），SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）進行三級結(jié)構(gòu)同源建模，核定位信號通過cNLS Mapper（https：//nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi），蛋白二級結(jié)構(gòu)分析通過SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/NPSA/npsa_sopma.html）。擬南芥AtTSK蛋白信息查詢網(wǎng)站為UniProt（https：//www.uniprot.org/）。

1.5 目的菌株構(gòu)建

以pGEX6t（F）-BamHI-TSK和pGEX6t（R）-XhoI-TSK為引物，擴增麻牛膝CcTSK基因CDS序列，通過引物序列，使得擴增產(chǎn)物兩端連上載體BamHI和XhoI酶切位點的堿基序列，再通過同源重組的方法，將其膠回收產(chǎn)物構(gòu)建到用BamHI和XhoI過夜酶切后的pGEX-6t-1載體上。連接產(chǎn)物及空載通過熱激法轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌BL21（DE3）感受態(tài)菌株中，挑選單克隆，用CcTSK基因特異引物3602F和H4389R進行PCR驗證，驗證成功后進行擴大培養(yǎng)，轉(zhuǎn)入含有50 μg/mL氨芐西林（ampicillin sodium salt， Amp）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 200 r/min過夜培養(yǎng)。挑選陽性菌落提取質(zhì)粒后進行酶切驗證，選擇驗證正確的片段送測序，將測序比對無誤的菌株進行保存[16]。

1.6 蛋白表達

將成功轉(zhuǎn)入重組載體的BL21（DE3）菌株培養(yǎng)至A600=0.5，加入0.1 mmol/L IPTG，37℃搖床誘導5 h。取1 mL菌液，加入15 μL三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA），混勻后液氮凍融2～3次（液氮與37℃熱水浴交替），再加入500 mL預冷的蛋白提取液（含有10% TCA與0.07% β-巰基乙醇的丙酮溶液），進行震蕩懸浮，于-20℃靜置過夜。4℃，12000 r/min離心20 min，向沉淀中加入1 mL含0.07% β-巰基乙醇的丙酮溶液，混勻后于-20℃靜置30 min，12000 r/min，離心20 min并干燥，最后加入50 μL蛋白裂解液（8 mmol/L尿素，0.07% β-巰基乙醇），搖勻加入15 μL十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-Polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）緩沖液煮沸10 min，4℃冷卻上樣并進行電泳。將電泳后的凝膠在考馬斯亮藍溶液中染色5 h，轉(zhuǎn)至蛋白洗脫液中脫色，條帶清晰后在凝膠電泳成像儀中照膠記錄[16]。

1.7 抗生素敏感性分析

選取0.5 μg/mL低濃度硫酸卡那霉素（kanamycin sulfate， Kan）、硫酸慶大霉素（gentamicin sulfate， Gen）、硫酸鏈霉素（streptomycin sulfate， Str）、利福平（rifampicin， Rif）和Cam進行試驗。將轉(zhuǎn)入pGEX-vector質(zhì)粒的BL21菌株（對照菌株）與轉(zhuǎn)入pGEX-CcTSK質(zhì)粒的BL21菌株（過表達菌株）37℃搖床200 r/min培養(yǎng)至A600=0.5，分別加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，誘導3 h后稀釋，將稀釋倍數(shù)為10-3、10-4、10-5和10-6的菌液在無抗生素和添加不同種類抗生素的平板上進行點板，并以無IPTG誘導的兩種菌株作為對照，37℃培養(yǎng)15 h后觀察各組對抗生素的敏感性。

根據(jù)文獻[18-20]，設置濃度為0、0.025、0.05、0.075和0.1 mmol/L的IPTG進行細菌生長試驗。將對照菌株與過表達菌株培養(yǎng)至A600=0.5后分別稀釋，設置稀釋倍數(shù)10-1～ 10-7的7個梯度，各梯度取2 μL菌液在含有不同濃度IPTG平板上點板，37℃培養(yǎng)12 h后，觀察菌株的生長情況。

選取50 μg/mL較高濃度頭孢噻肟鈉（cefotaxime sodium salt， Cef）、Kan、Str、Rif、Gen和Cam進行試驗。將對照菌株與過表達菌株培養(yǎng)至A600=0.5后，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG誘導3 h，再分別加入不同種類的較高濃度抗生素誘導5 h，然后進行稀釋，取稀釋倍數(shù)為10-3菌液進行涂板，同時以不加抗生素的菌液作為對照，37℃培養(yǎng)13 h后統(tǒng)計菌落數(shù)（CFU），并比較不同抗生素處理下的存活率。

2 結(jié)果

2.1 TONSOKU基因克隆

提取麻牛膝總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。設計引物進行RACE反應，電泳檢測5'RACE和3'RACE擴增條帶（圖1A和B），經(jīng)測序分析，確定麻牛膝CcTSK基因5'UTR的149 bp序列和3'UTR的178 bp序列。設計特異引物，進行PCR反應擴增。通過瓊脂糖電泳、膠回收及生物公司測序，確定麻牛膝CcTSK基因CDS全長3855 bp（圖1C），基因登錄號為OP858787。提取麻牛膝gDNA，設計引物，進行PCR反應，經(jīng)瓊脂糖電泳、膠回收及生物公司測序，確定麻牛膝CcTSK基因全長12613 bp。

2.2 麻牛膝TONSOKU蛋白的理化性質(zhì)分析

利用ORF Finder查找CcTSK基因的開放閱讀框，并通過ExPASy在線工具將其轉(zhuǎn)換為氨基酸序列，在ProtParam軟件平臺分析蛋白理化性質(zhì)，預測結(jié)果顯示CcTSK蛋白（C6207H10050N1742O2003S64）總分子質(zhì)量為143.18 kDa，含有1284個氨基酸，是不穩(wěn)定蛋白（表2）。ProtScale在線平臺分析其在一級結(jié)構(gòu)上的親疏水性，結(jié)果顯示在一級氨基酸結(jié)構(gòu)上CcTSK蛋白表現(xiàn)為親水性，其中第315位氨基酸分值最低為-3.044，該位置親水性最強，第1084位氨基酸分值最高為2.522，該位置疏水性最強；AtTSK蛋白同樣表現(xiàn)為親水性，其中第607位氨基酸分值最低為-2.644，該位置親水性最強，第1140與1142位氨基酸分值最高為2.311，該位置疏水性最強（圖2），理化性質(zhì)上CcTSK與AtTSK蛋白具有較高相似性。

2.3 麻牛膝TONSOKU蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽預測

在TMHMM-2.0網(wǎng)站預測CcTSK蛋白的跨膜區(qū)域，該蛋白沒有跨膜區(qū)域，為膜外蛋白（圖3A）。新合成的多肽鏈進行跨膜轉(zhuǎn)移或定位常常需要信號肽的指引，使用SignalP-6.0對CcTSK蛋白進行信號肽預測發(fā)現(xiàn)該蛋白沒有信號肽結(jié)構(gòu)，屬于沒有信號識別功能的非分泌蛋白（圖3B），與AtTSK蛋白一致。

2.4 CcTSK蛋白結(jié)構(gòu)域分析

使用SMART在線網(wǎng)站對CcTSK蛋白進行結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果顯示CcTSK蛋白主要由2個分別含有TPR重復序列和LRR重復序列的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，TPR重復序列包含5個TPR基序和2個TPR-like基序，LRR重復序列含有5個LRR基序，這與擬南芥AtTSK蛋白結(jié)構(gòu)具有較高相似性[13]（圖4）。

2.5 CcTSK蛋白亞細胞定位預測

使用WoLF PSORT Prediction在線網(wǎng)站對CcTSK蛋白的亞細胞定位進行預測，該蛋白定位于細胞核的評分為11，定位于細胞質(zhì)的評分為3，該蛋白位置最可能在細胞核中。再利用cNLS Mapper對CcTSK蛋白進行NLS預測，結(jié)果表明從N端起第595～603個氨基酸（VGRKRSRLV）構(gòu)成該蛋白核定位信號，該結(jié)果評分為5。

2.6 CcTSK蛋白結(jié)構(gòu)分析

利用SOPMA對麻牛膝CcTSK氨基酸序列進行二級結(jié)構(gòu)預測分析。結(jié)果表明，麻牛膝CcTSK二級結(jié)構(gòu)主要有β-轉(zhuǎn)角（beta turn 4.44%）、α-螺旋（alpha helix 53.89%）、無規(guī)卷曲（random coil 32.79%）和延伸鏈（extended strand 8.88%）（圖5A），與擬南芥AtTSK二級結(jié)構(gòu)構(gòu)成比例相近[21]。

利用在線軟件SWISS-MODEL蛋白質(zhì)3D結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫對CcTSK蛋白質(zhì)進行三級結(jié)構(gòu)建模，選擇編號為4peq.1牛核糖核酸酶抑制因子序列為模板，其QMEAN值為0.17（圖5B）。

2.7 過表達菌株與抗生素抑菌作用產(chǎn)生增強效應

與川牛膝相比，麻牛膝具備更顯著的抗炎作用[9]，因此為了探究CcTSK基因的表達對細菌生長的影響，本試驗選擇了5種抗生素進行研究。將構(gòu)建成功的pGEX-CcTSK重組載體轉(zhuǎn)入大腸埃希菌BL21菌株體內(nèi)，在0.1 mmol/L的IPTG誘導下，通過SDS-PAGE電泳檢測分析重組蛋白表達。結(jié)果顯示，GST蛋白表達的對照菌株成功表達26 kDa的GST標簽蛋白，CcTSK-GST融合蛋白的過表達菌株在150 kDa左右出現(xiàn)明顯的誘導條帶，與CcTSK-GST融合蛋白預測分子量169.18 kDa一致（圖6B）。

將成功進行蛋白表達的對照菌株與過表達菌株進行抗生素處理。培養(yǎng)15 h后結(jié)果顯示，當未添加抗生素時，對照菌株與過表達菌株生長狀況沒有顯著差異。當添加終濃度為0.5 μg/mL抗生素后，與對照菌株相比，在未經(jīng)IPTG誘導時，過表達菌株生長均未受到顯著抑制；在IPTG誘導3 h后，過表達菌株的生長僅在添加氯霉素的平板上受到顯著抑制，說明經(jīng)IPTG誘導后，在長時間低濃度抗生素處理下，CcTSK-GST融合蛋白的表達使得大腸埃希菌對氯霉素更為敏感（圖7A）。

此外，通過上述實驗可以發(fā)現(xiàn)IPTG誘導表達的CcTSK-GST融合蛋白對細菌生長產(chǎn)生了一定影響，為進一步探究其作用機制，在不同濃度的IPTG誘導下分析CcTSK-GST融合蛋白表達與細菌生長的關系。對照菌株在不同濃度IPTG誘導處理下其細菌生長未表現(xiàn)出顯著差異，而過表達菌株生長顯著受到IPTG濃度的影響，其生長受抑制情況隨IPTG濃度增加而加劇，說明CcTSK-GST融合蛋白的表達對大腸埃希菌的生長產(chǎn)生了抑制作用（圖7B）。

為了考察CcTSK蛋白的表達對細菌增殖的抑制性，和對抗生素敏感性的內(nèi)在關聯(lián)，對不同抗生素處理下，過表達菌株的存活率進行了分析。結(jié)果顯示，加入終濃度為50 μg/mL抗生素處理5 h后，對照菌株的存活率均低于60%，且除頭孢外，過表達菌株的生長相較于對照菌株均表現(xiàn)出更明顯的抑制，說明CcTSK-GST融合蛋白的表達與較高濃度抗生素的疊加處理，使得抑菌現(xiàn)象更加顯著（圖7C）。

3 討論

TONSOKU基因是為研究頂端分生組織功能而從分生異常的擬南芥突變體中分離出來[11]，該基因主要在模式植物擬南芥和煙草中進行研究。在生信分析中發(fā)現(xiàn)，麻牛膝CcTSK蛋白與擬南芥AtTSK蛋白具有較高相似性，并且二者具有相同TPR和LRR保守結(jié)構(gòu)域，推測二者具有相似的基因功能，現(xiàn)有研究已知擬南芥AtTSK蛋白在維持植物正常形態(tài)建成[14]、促進DNA損傷修復、細胞有絲分裂調(diào)控[21]、維持轉(zhuǎn)錄水平基因沉默[22]以及維護染色體結(jié)構(gòu)[23]中發(fā)揮作用。最新研究發(fā)現(xiàn)，植物TONSOKU蛋白能夠通過TPR結(jié)構(gòu)域特異結(jié)合組蛋白H3.1變體，維護DNA復制過程中基因組的穩(wěn)定性，并且這種特異性結(jié)合在動物同源TONSL蛋白中也是保守的[24]，使得對TPR結(jié)構(gòu)域的功能有了進一步發(fā)現(xiàn)。亞細胞定位顯示CcTSK蛋白位于細胞核，AtTSK的分析中同樣預測到了核定位信號肽，并在煙草細胞核中檢測到了AtTSK-GFP信號，證實了這一預測[13]。此外本研究發(fā)現(xiàn)IPTG誘導CcTSK蛋白表達后，對大腸埃希菌生長產(chǎn)生了抑制作用，而對照菌株并沒有明顯影響，這可能是因為CcTSK蛋白同樣具有維持轉(zhuǎn)錄水平基因沉默的功能，過表達后抑制了大腸埃希菌體內(nèi)一些正常蛋白的表達，從而阻礙了細菌生長。另外通過抗生素敏感性實驗發(fā)現(xiàn)，低濃度抗生素和IPTG對對照菌株并沒有明顯影響，而對過表達菌株來說，僅當氯霉素和IPTG同時加入時，大腸埃希菌生長受抑制現(xiàn)象加劇。王友如[25]、張海峰等[26]和陳緒美等[27]提出氯霉素能夠擴增大腸埃希菌質(zhì)粒，在低濃度氯霉素作用下，CcTSK基因得到擴增，并被IPTG誘導表達，從而阻礙了細菌生長。最后在較高濃度抗生素處理下，通過對菌株存活率的檢測發(fā)現(xiàn)，CcTSK-GST融合蛋白的表達與較高濃度抗生素的疊加處理，使得抑菌現(xiàn)象更加顯著，進一步提供了CcTSK蛋白在抑菌功能上的可能性，說明麻牛膝除多糖等活性成分，還可能通過抑菌方式幫助抗炎，同時這也補充了植物TONSOKU同源基因的生物學功能研究。

4 結(jié)論

本研究從麻牛膝嫩葉中成功克隆得到CcTSK的gDNA和CDS序列，并對其進行生物信息學分析。CcTSK基因的gDNA為12613 bp，CDS為3855 bp，共編碼1284個氨基酸。CcTSK蛋白為親水性不穩(wěn)定蛋白，沒有跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于沒有信號識別功能的非分泌蛋白，亞細胞定位預測該蛋白最可能處于核內(nèi)，并且具有核定位信號。該蛋白含有TPR重復序列和LRR重復序列的兩個結(jié)構(gòu)域，二級結(jié)構(gòu)主要有α-螺旋（占53.89%）、無規(guī)卷曲（占32.79%）、延伸鏈（占8.88%）和β-轉(zhuǎn)角（占4.44%），生物學特征比較分析發(fā)現(xiàn)，CcTSK蛋白與AtTSK蛋白具有較高相似性。此外，通過抗生素敏感性實驗發(fā)現(xiàn)，在低濃度抗生素處理下，CcTSK基因過表達后對氯霉素最敏感。而在細胞生長實驗中發(fā)現(xiàn)，CcTSK-GST融合蛋白的表達對大腸埃希菌的生長產(chǎn)生了抑制作用，且隨IPTG濃度的增加，抑制現(xiàn)象越明顯。另外，當CcTSK-GST融合蛋白的表達與較高濃度抗生素疊加處理時，抑菌現(xiàn)象更加顯著，這為CcTSK蛋白在抑菌功能上的研究提供了參考，但CcTSK蛋白與抗生素的抑菌作用之間的關聯(lián)機制，還有待進一步研究確定。

參 考 文 獻

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