何銀，陳紅梅，陳晨，潘艷麗，米雪，胡志林*

1.石河子大學(xué) 藥學(xué)院，新疆植物藥資源利用教育部重點實驗室，新疆 石河子 832003

2.新疆華世丹藥業(yè)有限公司，新疆 烏魯木齊 830001

幽門螺桿菌（Hp）是一種微需氧革蘭陰性桿菌，主要定植于胃和十二指腸。Hp 在人群中主要通過口-口途徑傳播，目前全球Hp 感染率已超過50%，我國自然人群Hp 感染率在59%[1-2]。Hp 感染與多種人類上消化道疾病有關(guān)，感染的患者一般患有慢性活動性胃炎，其中10%～20%可發(fā)展為消化性潰瘍，50%可發(fā)展為胃黏膜萎縮，1%～3%甚至可發(fā)展為胃癌或胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤[3-4]。隨著Hp治療的廣泛開展，根除率逐漸降低，有效治療Hp 感染面臨著挑戰(zhàn)，Hp 耐藥性是導(dǎo)致幽門螺桿菌根除率越來越低的主要原因[5]。根除Hp 是消除慢性胃炎、預(yù)防和治愈消化性潰瘍、有效治療MALT 淋巴瘤、降低胃癌發(fā)病率最經(jīng)濟(jì)、有效的方法[6]。

大蒜是亞洲種植最廣泛的蔬菜作物之一，也是世界聞名的藥用植物。大蒜中至少含有33 種硫化物，硫化物是使大蒜產(chǎn)生刺激性氣味、發(fā)揮藥理作用的主要成分[7-9]。大蒜素是大蒜中的主要生物活性成分，具有抗癌、抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗血小板聚集、心肌保護(hù)、心血管保護(hù)、消化系統(tǒng)保護(hù)等生物學(xué)功能[10-13]。大蒜素具有較強(qiáng)的抗菌活性，抑制Hp 的生長，有效預(yù)防和減少Hp 的感染，還在臨床上對系統(tǒng)性真菌和細(xì)菌感染有良好的治療效果[14-16]。本研究將基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對接和體外抑菌試驗研究大蒜治療Hp 感染可能的活性成分、靶點和通路，探討其作用機(jī)制，為后續(xù)研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法

1.1.1 藥物活性成分靶點的收集 在HERB數(shù)據(jù)庫檢索“大蒜”并下載相關(guān)成分表，并通過相對分子質(zhì)量（MW）≤500，脂水分配系數(shù)（xlogp）≤5，氫鍵給體數(shù)目（H-bond donors）≤5，氫鍵受體數(shù)目（Hbond acceptors）≤10 篩選其活性成分，再通過PharmMapper、Swiss Target Prediction、BATMANTCM 數(shù)據(jù)庫（Score cutoff≥20，P＜0.05）收集大蒜活性成分相關(guān)靶點。利用Cytoscape 3.9.1 軟件制作“藥物-成分-潛在靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.1.2 疾病靶點收集 以“Helicobacterpyloriinfection”作為關(guān)鍵詞，在GeneCards（Relevance score≥5）、OMIM、DRUGBANK、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，將結(jié)果合并去重后得到Hp 感染相關(guān)靶點。將活性成分靶點與疾病靶點導(dǎo)入Venny 2.1 在線工具，獲取大蒜治療Hp 感染的潛在作用靶點。

1.1.3 構(gòu)建蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò) 將1.1.2 項下得到的潛在作用靶點導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫，設(shè)置物種為“Homo sapiens”，最小相互作用閾值設(shè)定為“highest confidence（0.900）”，即可得到PPI 網(wǎng)絡(luò)。將分析結(jié)果的tsv 文件導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件進(jìn)行可視化，得到最終的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，并篩選出degree值最大的前5 個節(jié)點，作為核心靶點。

1.1.4 基因本體論（GO）生物分析與京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析 將交集靶點導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO 功能富集分析及KEGG信號通路分析，將所得結(jié)果按P值升序排列（P＜0.05），然后通過微生信在線繪制工具，分別取生物功能（BP）、細(xì)胞成分（CC）、分子功能（MF）的前15 位繪制GO 功能富集柱狀圖，KEGG 信號通路富集結(jié)果取前30 位繪制KEGG 通路氣泡圖。

1.1.5 活性成分與核心靶點的分子對接 在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中獲取大蒜有效成分的MOL2 結(jié)構(gòu)文件，在Autodock Tools 1.5.7 軟件中加氫后導(dǎo)出為“pdbqt 文件”。然后在PDB 數(shù)據(jù)庫中根據(jù)物種、方法、分辨率、Macromolecule 篩選核心靶點蛋白結(jié)構(gòu)，保存其“pdb 格式文件”，并通過Pymol 軟件進(jìn)行去水分子、去配體，Autodock Tools 中加氫后導(dǎo)出“pdbqt 文件”。最后，將配體小分子和受體大分子一起導(dǎo)入Autodock Tools 軟件中，計算得到相應(yīng)的結(jié)合能數(shù)據(jù)。

1.2 體外抑菌實驗

1.2.1 實驗菌株 Hp 標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 700392（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院）；Hp 標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 43504（新疆華世丹藥業(yè)有限公司）；Hp 臨床菌株SS1（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院）

1.2.2 試劑與耗材 大蒜素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.22%，批號210517，江蘇正大清江制藥有限公司）；哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基（批號Cat.No.10106，青島日水生物技術(shù)有限公司）；布氏肉湯（批號Cat.No.10705，青島日水生物技術(shù)有限公司）；脫纖維山羊血（無菌）（批號TX0020，北京索萊寶科技有限公司）；胎牛血清（批號21100702，浙江天杭生物科技股份有限公司）；HP 尿素酶快速檢測試劑盒（干化學(xué)法）（批號20142400023，本溪泰斯特捷生物科技有限公司）；HP 試紙（化學(xué)反應(yīng)法）（批號20192400204，珠海市克迪科技開發(fā)有限公司）；日本三菱MGC 產(chǎn)氣袋（批號1198LJ-1，北京緣生化科技有限公司）。

1.2.3 儀器 BSC-1300II A/B3 生物安全柜（上海博訊實業(yè)有限公司）；SPX-250B-Z 生化培養(yǎng)箱（上海博訊實業(yè)有限公司）；KXQ.SG46.280 高壓滅菌鍋（上海佳騰實驗設(shè)備有限公司）；JM300/0.1 電子天平（余姚紀(jì)銘稱重校驗設(shè)備有限公司）。

1.2.4 菌株的培養(yǎng)及鑒定 取100 μL 菌液涂布于含有10%無菌脫纖維山羊血的哥倫比亞瓊脂平板上，倒置于厭氧菌培養(yǎng)盒內(nèi)（培養(yǎng)條件：5% O2、10% CO2、85% N2），將培養(yǎng)盒放入37 ℃細(xì)菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，經(jīng)革蘭氏染色和尿素酶實驗證實為Hp。取鑒定后菌株，采用接種環(huán)挑取1 CFU Hp 菌落接種于100 mL 含10%胎牛血清布氏肉湯培養(yǎng)基中，微需氧環(huán)境中培養(yǎng)3 d，取100 μL 細(xì)菌懸液重懸于10 mL 無菌水中，進(jìn)行麥?zhǔn)媳葷?，稀釋菌液濃度?.0×108CFU/mL，用于藥敏實驗。

1.2.5 最小抑菌濃度（MIC）的測定 采用液體倍比稀釋法測定大蒜素對Hp 的MIC 值，用布氏肉湯培養(yǎng)基配制成512 μg/mL 的大蒜素母液，取13 根10 mL 無菌試管，依次編號1～13。實驗組1～11 號管分別配制成濃度為0、1、2、4、8、16、32、64、128、256、512 μg/mL 的系列藥液，然后分別加入0.1 mL 1×108CFU/mL 菌懸液（試管中最終菌懸液濃度為1×106CFU/mL）。12 號管作為陽性對照管不加藥液，13 號管作為陰性對照管不加菌液，混勻后置于37 ℃細(xì)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。沒有細(xì)菌生長的最小藥物濃度為該藥的MIC 值。

2 結(jié)果

2.1 大蒜活性成分收集

共得到大蒜活性成分共36 個，見表1。在PharmMapper、Swiss Target Prediction、BATMANTCM 數(shù)據(jù)庫共獲取大蒜活性成分潛在靶點1 170個，將大蒜對應(yīng)的活性成分以及潛在靶點、藥物構(gòu)建“藥物-成分-潛在靶點”網(wǎng)絡(luò)，見圖1。網(wǎng)絡(luò)中共含有節(jié)點1 207 個，邊線6 833 條。所有活性成分節(jié)點中degree 值最大的前10 位是二烯丙基二硫醚、對羥基苯甲酸乙酯、山柰酚、芹菜素、二烯丙基四硫醚、烯丙基甲基四硫醚、香葉醇、大蒜素、香橙醛、二烯丙基三硫醚，是大蒜治療Hp 感染主要活性成分，其中二烯丙基二硫醚、二烯丙基四硫醚、二烯丙基三硫醚是大蒜素中的活性成分。

圖1 “藥物-成分-潛在靶點”網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Network of “drugs-components-potential targets”

表1 大蒜活性成分基本信息Table 1 Basic information of Allium sativum active ingredients

2.2 大蒜治療Hp 感染的潛在靶點

Genecards、OMIM、DRUGBANK、DisGeNET數(shù)據(jù)庫篩選獲得1 584 個疾病靶點，將這些疾病靶點與藥物活性成分靶點取交集，共獲得291 個大蒜治療Hp 感染的潛在作用靶點，見圖2。

圖2 藥物靶點與疾病靶點韋恩圖Fig.2 Venn diagram of drug target and disease target

2.3 潛在靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

PPI 網(wǎng)絡(luò)見圖3。網(wǎng)絡(luò)中共含有節(jié)點246 個，節(jié)點面積越大，顏色越深，代表該節(jié)點的degree 值越大；1 416 邊線條，代表靶點蛋白之間的相互關(guān)聯(lián)。根據(jù)degree 值篩選前5 個節(jié)點為腫瘤蛋白p53（TP53）、酪氨酸蛋白激酶（SRC）、信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（STAT3）、熱休克蛋白90α 家族A 類成員 1（HSP90AA1）、絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK3），這5 個靶點被認(rèn)為是大蒜治療Hp 感染的核心靶點，見圖4。

圖3 PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Network interaction map of PPI

圖4 核心靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.4 Network interaction map of core targets

2.4 GO 和KEGG 通路富集結(jié)果

GO 富集分析結(jié)果表明，BP 分析富集影響較顯著的有對藥物的反應(yīng)、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、基因表達(dá)的正調(diào)控、對外源化合物刺激的反應(yīng)、蛋白質(zhì)磷酸化等；CC 分析富集影響較顯著的有細(xì)胞溶質(zhì)、細(xì)胞外間隙、細(xì)胞質(zhì)、大分子復(fù)合物、胞外區(qū)等；MF分析富集影響較顯著的是相同的蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合、蛋白激酶活性、蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等，見圖5。KEGG 通路分析結(jié)果表明，大蒜治療Hp 感染與磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）、叉頭框蛋白O（FoxO）、MAPK、低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）等多條信號通路密切相關(guān)，揭示大蒜可能通過靶向作用于這些通路介導(dǎo)Hp 感染過程，見圖6。

圖5 GO 富集分析Fig.5 GO enrichment analysis

圖6 KEGG 通路分析Fig.6 KEGG pathway analysis

2.5 分子對接分析結(jié)果

將大蒜的活性成分分別與核心靶點進(jìn)行分子對接，對接結(jié)果見表2。分子對接的結(jié)合能越小，提示活性物質(zhì)與蛋白質(zhì)之間結(jié)合越牢固，其數(shù)值小于-1.2 kcal/mol（1 kcal＝4.184 kJ）時表示活性物質(zhì)與蛋白質(zhì)之間有較好的結(jié)合活性[17]。結(jié)果表明，大蒜degree 值前10 位的活性成分與核心靶點的結(jié)合能均具有較好的結(jié)合活性，而且結(jié)合體構(gòu)象穩(wěn)定。

表2 分子對接結(jié)果Table 2 Molecular docking results

2.6 體外抑菌實驗結(jié)果

對大蒜素進(jìn)行體外抗Hp 活性檢測，大蒜素對3 株Hp 菌等抑制能力不同，對Hp ATCC 43504 的MIC 值為2.0 mg/mL，對Hp SS1 和Hp ATCC 700392的MIC 值均為4.0 mg/mL，表明大蒜素對Hp 菌株具有抑制作用，其MIC 值越小說明抗菌活性越強(qiáng)。

3 討論

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接，對大蒜治療Hp 感染的機(jī)制進(jìn)行分析?！八幬?成分-潛在靶點”網(wǎng)絡(luò)分析得到，degree 值前10 位的大蒜活性成分為二烯丙基二硫醚、對羥基苯甲酸乙酯、山柰酚、芹菜素、二烯丙基四硫醚、烯丙基甲基四硫醚、香葉醇、蒜辣素、香橙醛、二烯丙基三硫醚。其中二烯丙基二硫醚、二烯丙基四硫醚、二烯丙基三硫醚是大蒜素中的活性成分，二烯丙基三硫醚為大蒜素的主要活性成分。二烯丙基二硫醚是大蒜中degree值最高的一種活性成分，可以同時抑制敏感和耐藥的Hp[18]。二烯丙基三硫醚可以破壞Hp 生物膜結(jié)構(gòu)，起到殺菌作用，且隨著藥物濃度的提高，殺菌效果逐漸增強(qiáng)，而且二烯丙基三硫醚比二烯丙基二硫具有更高的抗Hp 活性[19-20]。因此，對大蒜素進(jìn)行了體外抑菌試驗，發(fā)現(xiàn)大蒜素對三株幽門螺桿菌均具有抑菌作用，最小抑菌濃度為2.0 mg/mL。

通過PPI 網(wǎng)絡(luò)分析可知，TP53、SRC、STAT3、HSP90AA1、MAPK3 是大蒜對抗Hp 感染的核心靶點。TP53 是一種與腫瘤的增殖、分化等過程密切相關(guān)的抑癌基因，TP53 突變可引起p53 核蓄積，與Hp 感染誘發(fā)的胃黏膜AID 異常表達(dá)密切相關(guān)，且TP53 基因Pro/Pro 基因型可增加Hp 感染者胃癌發(fā)生的風(fēng)險[21-22]。STAT3 是許多細(xì)胞因子和生長因子的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，可誘導(dǎo)HIF-1α 表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞遷移、侵襲和腫瘤形成[23-24]。

KEGG 通路富集分析表明，大蒜抗Hp 感染與PI3K-Akt、FoxO、MAPK、HIF-1 等信號通路密切相關(guān)。Hp 可以通過激活PI3K-Akt 信號通路來調(diào)節(jié)Hp 誘發(fā)的細(xì)胞遷移，與宿主細(xì)胞cag 分泌系統(tǒng)和肽聚糖以及表皮生長因子受體（EGFR）反式激活和SRC 活化有關(guān)[25]。FoxO 與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯、氧化應(yīng)激等密切相關(guān)，F(xiàn)oxO3a 可通過調(diào)控其下游物靶基因參與Hp 所致胃黏膜相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展過程，且FoxO1/3a 是Hp 誘導(dǎo)的PI3K/Akt 細(xì)胞生存信號通路的新型核底物，該信號通路可控制白細(xì)胞介素-8（IL-8）的產(chǎn)生[26-27]。MAPK 通路在炎癥、氧化應(yīng)激、細(xì)胞增殖等生理病理過程和應(yīng)激反應(yīng)中起到重要作用，Hp 感染后引起的胃黏膜炎性損傷可通過MAPKs 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路完成[28-29]。HIF-1 是一種缺氧誘導(dǎo)因子，Hp 可通過上調(diào)HIF-1α 和STAT3 的表達(dá)可促進(jìn)胃上皮細(xì)胞GES-1 的增殖、侵襲和遷移[30]。

通過分子對接發(fā)現(xiàn)，大蒜degree 值前10 位的活性成分與核心靶點的結(jié)合能均具有較好的結(jié)合活性，而且結(jié)合體構(gòu)象穩(wěn)定。提示大蒜中的這些成分可能通過調(diào)控核心靶點參與Hp 感染相關(guān)過程。

綜上所述，大蒜治療Hp 感染的機(jī)制可能是通過二烯丙基二硫、二烯丙基三硫醚等烯丙基硫醚類化合物作用于TP53、SRC、STAT3、HSP90AA1、MAPK3 等核心靶點，與PI3K-Akt、FoxO、MAPK、HIF-1 等信號通路有關(guān)。通過初步抑菌試驗，驗證了大蒜素抗Hp 的活性，為后續(xù)研究提供理論依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突