潘 駿,陳禹鑫,逯艷文,董 翔,楊海洋,張古田,甘衛(wèi)東,郭宏騫

(1.南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院泌尿外科,江蘇南京 210008;2．江蘇大學鼓樓臨床醫(yī)學院,江蘇鎮(zhèn)江 212000)

希佩爾·林道(Von Hippel Lindau,VHL)綜合征是一種常染色體顯性腫瘤,其特征是視網(wǎng)膜和中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管母細胞瘤、腎透明細胞癌(clear cell renal cell carcinomas,ccRCC)、嗜鉻細胞瘤(pheochromocytoma,PCC)、胰島腫瘤和內(nèi)淋巴囊腫瘤[1]。VHL基因突變是VHL綜合征的啟動因素[2],根據(jù)突變類型為體系還是胚系而分為散發(fā)性VHL突變型ccRCC和家族性VHL綜合征[3];文獻報道,家族性VHL綜合征的發(fā)病機理符合二次打擊理論[4],甲基化及雜合性缺失都是導致患者VHL失活的重要機制[5-6],其中甲基化屬于沉默抑癌基因的一種機制[7],雜合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)則在多階段致癌過程中可導致腫瘤抑制基因等位基因的丟失[8]。另外,單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNP)在患者發(fā)病中也起到了重要作用[9]。

本研究收集到一個家族性VHL綜合征患者的外周血及病理樣本,并提取DNA進行高通量基因檢測,研究該家族性VHL綜合征患者的胚系突變類型,并通過UCSCXena數(shù)據(jù)庫、甲基化特異性聚合酶鏈式反應法(methylation specific polymerase chain reaction,MSP)、微衛(wèi)星穩(wěn)定性檢測分別針對LOH、甲基化、突變及SNP進行實驗及驗證,分析患者可能的第二次打擊位點及相關致病因素。

1 資料與方法

1.1 一般資料患者(先證者)男性,52歲,因左側腰痛2月余于南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院就診,發(fā)現(xiàn)左腎腫瘤,遂收住入院行左腎腫瘤剜除術。患者2010年于當?shù)蒯t(yī)院行右腎腫瘤剜除術,術后病理提示ccRCC?；颊叻謩e于2013年10月、2014年2月于當?shù)蒯t(yī)院發(fā)現(xiàn)雙側腎上腺占位,并行雙側腎上腺切除術,術后病理提示PCC。2016年因右腎腫瘤復發(fā),于上海市長海醫(yī)院行右腎切除術,術后病理提示右腎ccRCC。

經(jīng)過患者本人及家屬同意后,對其家系中22人進行研究,其中8人患有多系統(tǒng)疾病,2人曾被考慮為VHL綜合征但并未行進一步病理診斷(圖1)?；疾≌叻謩e為:Ⅰ1(先證者的母親)患腎腫瘤、Ⅱ8(先證者)患雙側腎ccRCC合并雙側腎上腺PCC、Ⅱ2(先證者的哥哥)患單側腎腫瘤、Ⅱ4(先證者的哥哥)患視網(wǎng)膜血管母細胞瘤、Ⅱ9(先證者的姐姐)患單側腎腫瘤、Ⅲ1(先證者的侄女)患雙側腎上腺PCC、Ⅲ2(先證者的侄女)患顱內(nèi)血管腫瘤、Ⅲ7(先證者的侄子)患雙側腎ccRCC合并雙側腎上腺PCC。

圖1 VHL綜合征患者家族系譜圖

1.2 試驗方法

1.2.1高通量測序(next generation sequencing,NGS)[10]將患者腎腫瘤切除術后的病理白片送上海仁東醫(yī)學科技有限公司測序后進行序列分析,使用基于單分子聚合酶鏈式反應(single molecule-polymerase chain reaction,SM-PCR)技術的腫瘤基因突變檢測試劑盒富集血液樣本關于遺傳性腫瘤等642個相關基因區(qū)域的 ctDNA 片段,使用NextSeq CN500基因測序儀,對相關基因的全部外顯子區(qū)域進行捕獲測序,在DNA水平上分析相關基因的點突變、插入缺失、重排、拷貝數(shù)等突變形式。

1.2.2甲基化位點預測研究 UCSCXena數(shù)據(jù)庫(http://xena.ucsc.edu/)是一個基因組相關數(shù)據(jù)庫,匯集了約200個公共數(shù)據(jù)庫,包括癌癥基因組圖譜計劃(the cancer genome atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫、癌細胞百科全書(cancer cell line encyclopedia,CCLE)數(shù)據(jù)庫等。該數(shù)據(jù)庫可用于檢查拷貝數(shù)和甲基化、體細胞突變、基因表達、蛋白質表達和可視化,以及解釋癌癥基因組學數(shù)據(jù)可視化和解釋癌癥基因組學數(shù)據(jù)[11]。依據(jù)UCSCXena數(shù)據(jù)庫中包含的TCGA數(shù)據(jù)庫病例作為病例篩選的基本數(shù)據(jù),后根據(jù)VHL基因來添加數(shù)據(jù)集,選擇所需要的甲基化數(shù)據(jù)集,分別選擇僅包含啟動子的區(qū)域,含270 000個甲基化位點的模式,以及包含啟動子和基因內(nèi)部的區(qū)域,有450 000個位點的模式,最終獲得致病的甲基化突變位點。

1.2.3MSP檢測VHL基因甲基化[12]①采用200 μL新鮮血液提取基因組。②經(jīng)亞硫酸鹽轉化進行甲基化修飾:取已提取的DNA 50 μL,加入2 mol/L NaOH溶液5 μL。37 ℃條件下變性10 min。加入10 mmol/L對苯二酚30 μL、3 mol/L NaHSO3溶液520 μL。50 ℃水浴16 h進行甲基化修飾。③引物設計:針對VHL的轉錄起始位點上游2 000 bp至下游100 bp是啟動子區(qū)域,根據(jù)該區(qū)域設計甲基化與非甲基化的引物組。共設計出5組引物,每一組引物包括了上游引物及下游引物(MF:為甲基化的上游引物;MR:為甲基化的下游引物;UF:為非甲基化的上游引物;UR:為非甲基化的下游引物),同時從既往報道的VHL綜合征甲基化病例中引用另一對引物[13]。④MSP:參考JAMES及參考文獻等的方法[14],對轉化的DNA進行PCR擴增,PCR反應條件:95 ℃熱啟動5 min,95 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s共35個循環(huán):用含溴化乙啶染色的1%瓊脂以不同引物擴增的產(chǎn)物,凝膠成像自動分析系統(tǒng)觀察分析結果[15]。

表1 引物序列表

1.2.4微衛(wèi)星穩(wěn)定性檢測 患者行腎腫瘤切除術后其病理白片被送至上海仁東醫(yī)學科技有限公司,進行測序及序列分析,微衛(wèi)星-聚合酶鏈式反應(micro star international-polymerase chain reaction,MSI-PCR)技術的腫瘤基因微衛(wèi)星位點檢測試劑盒富集血液樣本,使用NextSeq CN500基因測序儀,針對642個相關基因區(qū)域的全部外顯子進行捕獲。

1.2.5SNP位點檢測 查閱參考文獻,找到與VHL綜合征相關的SNP位點,即rs1642742[16]、 rs779805[17],對所取樣本進行全外顯子捕獲測序(whole exome sequence,WES),并與參考基因組進行比較,確定SNP的發(fā)生位點。

2 結 果

2.1 家系資料分析結果通過對先證者及其家系進行病史分析,能夠發(fā)現(xiàn)該患者家系中的患者屬于典型VHL綜合征。根據(jù)既往研究可知,VHL綜合征的初始癥狀可發(fā)生于全身多處器官,以合并PCC最為常見,多合并腎惡性腫瘤的發(fā)生,好發(fā)于20～40歲人群,男性多見。在患者家系中發(fā)現(xiàn)有3名家系成員罹患腎惡性腫瘤,1名家系成員罹患腎上腺PCC,同時有2名家系成員罹患腎惡性腫瘤合并雙側腎上腺PCC,且該患者家系成員發(fā)病年齡滿足家族性VHL綜合征早發(fā)的特點,十分符合VHL綜合征的臨床特征。

2.2 NGS高通量檢測結果通過對患者基因點突變、插入缺失、重排、拷貝數(shù)等突變形式的分析,未發(fā)現(xiàn)明確的插入缺失、重排、拷貝數(shù)變化。存在2種胚系突變基因,分別是在第500位堿基處由G堿基變?yōu)锳堿基的p.R167Q突變型VHL,位于第1 420位堿基的由C堿基變?yōu)門堿基的MUTYH,以及一種體系突變:位于第12 752位堿基的由C堿基變?yōu)門堿基的KMT2D。目前在已發(fā)現(xiàn)的突變中僅有VHL基因突變存在明確臨床意義。

2.3 甲基化位點預測結果通過UCSCXena數(shù)據(jù)庫驗證ccRCC中VHL的DNA甲基化水平(圖2A)。結果顯示VHL的基因表達和DNA甲基化相關,可見3個與VHL相關的甲基化位點,數(shù)據(jù)庫中包含二次打擊位點非甲基化患者,因1號位點在所有數(shù)據(jù)庫病例患者中均為高表達,遂予以排除。故致病甲基化位點分別為:cg20916523和cg25539131。為此我們根據(jù)甲基化數(shù)據(jù)庫中所提供的2個甲基化位點進行MSP數(shù)據(jù)研究(圖2B)。結果發(fā)現(xiàn)cg20916523在該患者中并未出現(xiàn),cg25539131位于非CPG島處的外顯子處,而該位置中的甲基化意義并不明確,且一般并不影響基因的表達量[18],所以予以排除。同時,根據(jù)甲基化引物設計數(shù)據(jù)庫設計5組引物行PCR研究,甲基化引物并未擴增出目的條帶(圖2C),所以在該VHL患者的基因上無甲基化證明,因此該患者第二次打擊位點并非甲基化。

A:根據(jù)UCSCxena數(shù)據(jù)庫結果,排除非VHL基因范圍內(nèi)的基因位點,留下3個位點,1號位點在所有樣本中都高表達而排除,2號位點和3號位點為篩選出的甲基化位點;B:MSP中針對數(shù)據(jù)庫提供的位點設立位點F1-5及R1-5,檢測DNA組中甲基化的可能性;C:基因組熒光染色圖,在染色圖中未見明確甲基化位點。

2.4 SNP及雜合性缺失檢測結果基于二代測序,我們通過MSI-PCR在VHL基因的相應片段中發(fā)現(xiàn)存在微衛(wèi)星不穩(wěn)定區(qū)域共91個,對此我們進行了微衛(wèi)星狀態(tài)分析,結果提示該患者微衛(wèi)星穩(wěn)定,可判斷患者第二次打擊位點并非LOH。依據(jù)WES結果,我們發(fā)現(xiàn)在rs779805處存在SNP,位于第183位核苷酸,密碼子61 C/G。

3 討 論

VHL綜合征是一種罕見的家族遺傳性疾病,能夠累及全身多個臟器,臨床表現(xiàn)異質性大[19-20]。根據(jù)表型特征,VHL綜合征可分為4類:1型、2A型、2B型和2C型。1型中不存在PCC,2A型和2B型可能表現(xiàn)為PCC,并通過伴隨的ccRCC額外風險進行區(qū)分,而2C型僅呈現(xiàn)ccRCC[21]。遺傳性VHL疾病中最常見的突變R167Q屬于2B型突變,發(fā)生此類突變易患ccRCC[22]。VHL綜合征的致病基因即VHL基因為抑癌基因,定位于3號染色體短臂,含有3個外顯子,編碼pVHL蛋白質[23]。pVHL和缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor,HIF)結合,引起HIF降解。當缺失或者變異導致pVHL合成減少時HIF積累,將可能引起下游基因持續(xù)激活而導致腫瘤的發(fā)生發(fā)展[24]。

根據(jù)Knudson的二次打擊假設,通過對兒童視網(wǎng)膜母細胞瘤發(fā)病率的分析,認為該疾病的發(fā)生是二次突變的結果。家族型者第1次突變發(fā)生于生殖細胞,第2次突變發(fā)生于出生后體細胞,腫瘤的發(fā)生是由于腫瘤抑癌基因的雙等位基因丟失,大量分子生物學研究已證實了這種由統(tǒng)計學分析提出的“二次打擊”學說[25]。MAHER等[26]通過對收集到的VHL綜合征患者進行相關性分析證實,VHL綜合征的致病特點類似于視網(wǎng)膜母細胞瘤,符合二次打擊學說,VHL疾病中的小腦血管母細胞瘤和腎細胞癌均發(fā)生在相同的突變模型,同時在腎細胞癌中第二次打擊的原因以LOH、甲基化、基因突變等多見。

我們通過家系調(diào)查及對先證者外周血及病理組織采用NGS發(fā)現(xiàn)其為VHL綜合征,VHL第3外顯子發(fā)生病理性胚系錯義突變,該突變類型為VHL綜合征中最具特點的R167Q突變,目前已有通過下調(diào)HIF-2α來調(diào)節(jié)R167Q突變造成的缺氧、干擾可塑性調(diào)節(jié)的相關研究[22]。同時,我們針對第二次打擊位點類型進行研究,采用數(shù)據(jù)庫檢索、MSP實驗、微衛(wèi)星穩(wěn)定性研究及MSI-PCR等方法,發(fā)現(xiàn)該患者無甲基化、LOH、突變的情況,僅存在SNP。VHL突變的位點及類型眾多,我們的研究不僅是對VHL綜合征的進一步探索,同時也是對二次打擊理論的進一步認識[27]。

SNP是導致患者腫瘤發(fā)生的重要機制之一,研究SNP能夠對VHL綜合征的發(fā)生發(fā)展有著更深刻的認識。目前對于SNP引起VHL綜合征的機制尚不明確,但是既往研究認為SNP可能通過影響VHL基因的功能進而影響疾病易感性或者是通過促進LOH、甲基化的發(fā)生來產(chǎn)生作用,同時,疾病相關的SNP可能作為轉錄增強子,與轉錄因子相互作用,調(diào)節(jié)靶基因的表達[28],因此,對于SNP導致VHL綜合征發(fā)生、發(fā)展的機制需要更進一步的研究與探討。

VHL綜合征有家族型和散發(fā)型之分,本研究中先證者患者確診為VHL綜合征,其發(fā)病的家系成員臨床考慮為VHL綜合征,且家族性惡性腫瘤病史伴有腎上腺惡性腫瘤疾病的家系成員數(shù)名,符合家族性VHL綜合征診斷指征,因此均可臨床確診為VHL綜合征[29],該家族也可初步判斷為家族性VHL綜合征。根據(jù)患者及其家系的發(fā)病年齡,發(fā)現(xiàn)患者與其家系其余患有腎癌者的發(fā)病年齡均早于40歲,符合家族性腎癌早發(fā)的臨床特點[30],同時該患者家系中起初發(fā)病的位點并不一致以及易產(chǎn)生新的病灶,也符合該家族性腫瘤累及范圍廣、發(fā)展快的特點[31]。目前已知R167Q的突變均發(fā)生于胚系突變中,而R167Q突變導致VHL基因功能喪失,影響下游HIF-2特別是 HIF-2α 的組成性穩(wěn)定,可能是促進其發(fā)展及多處轉移的重要原因[22]。

綜上所述,對于患者基因的不同層面,包括DNA、RNA、蛋白質層面的研究,有利于我們研究VHL綜合征腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機制。對于VHL綜合征二次打擊的研究能夠對我們研究如何發(fā)現(xiàn)以及治療提供了一個方向。同時,進行患者數(shù)據(jù)庫基因甲基化研究對于幫助篩選患者甲基化等情況有著十分重要的作用,對符合二次打擊學說的腫瘤有著很好的篩選作用。