趙亞玲

【摘要】? 目的? ? 探討多重實時熒光PCR法聯(lián)檢13種呼吸道病原體在呼吸道感染早期診斷中的價值。方法? ? 收集天水市第一人民醫(yī)院2021年8月—2022年4月共312例呼吸道疾病住院患者作為研究對象，同時采集咽拭子及深部痰液樣本，均接受呼吸道病原體核酸檢測，分析上呼吸道疾病及下呼吸道疾病病原體核酸檢測結(jié)果。結(jié)果? ? 在312份呼吸道樣本中有274份檢測到病原體，檢出率為87.82%，其中有59份（陽性占比21.53%）樣本中檢測到兩種及以上病原體。上呼吸道疾病共42例，檢測到病原體33例，檢出率為78.60%，病原體核酸檢出率前三位為乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人鼻病毒。下呼吸道疾病共270例，檢測到病原體241例，檢出率為89.30%，病原體核酸檢出率前三位為肺炎鏈球菌、呼吸道合胞病毒、流感嗜血桿菌。結(jié)論? ? 通過多重實時熒光PCR法對引起呼吸道疾病的常見病原體進(jìn)行核酸檢測，能輔助臨床快速定位病原體，確定感染類型，為呼吸道感染疾病的早期診斷提供實驗室依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】? 呼吸道感染；早期診斷；常見呼吸道病原體；PCR聯(lián)檢

The value of PCR in the early diagnosis of respiratory tract infection

Zhao Yaling. The First People's Hospital of Tianshui City，Tianshui，Gansu? ?741000

【Abstract】? Objective? ? To evaluate the value of multiple real-time PCR for detection of 13 respiratory pathogens in early diagnosis of respiratory tract infection. Methods? ? A total of 312 inpatients with respiratory diseases were collected from August 2021 to April 2022 in our hospital as the research subjects，and deep sputum samples and throat swab samples were collected，and nucleic acid test results of pathogens of upper and lower respiratory diseases were analyzed.Results? ? Pathogens were detected in 274 of 312 respiratory tract samples，with a detection rate of 87.82%，and two or more pathogens were detected in 59 samples（positive ratio 21.53%）.There were 42 cases of upper respiratory diseases，33 cases of pathogens were detected，and the detection rate was 78.60%.The top three pathogens in nucleic acid detection rate were influenza B virus，respiratory syncytial virus and human rhinovirus.There were 270 cases of lower respiratory tract diseases，and 241 cases of pathogens were detected，with a detection rate of 89.30%.The top three pathogens in nucleic acid detection rate were Streptococcus pneumoniae，respiratory syncytial virus and Haemophilus influenzae.Conclusion? ? Nucleic acid detection of common pathogens causing respiratory tract diseases by multiplex real-time fluorescence PCR can assist the clinical diagnosis of respiratory tract infectious diseases to quickly locate pathogens，determine the type of infection，and provide laboratory basis for the early diagnosis of respiratory tract infectious diseases.

【Key Words】? Respiratory infections；Early diagnosis；Common respiratory pathogens；Real-time PCR

中圖分類號：R446.5? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? 文章編號：1672-1721（2023）13-0065-04

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.13.021

呼吸道疾病是臨床高發(fā)疾病，尤其是幼兒及老年人等免疫力低下人群，發(fā)病率高、致死率高。其特點是不同的病原體可以引發(fā)相同的呼吸道癥狀，而不同的臨床癥狀也可能是由一種病原體引起的，且引起呼吸道疾病的病原體種類繁多，構(gòu)成復(fù)雜，而且時有多種病原體混合感染的情況[1]。致使臨床醫(yī)生難以鎖定病原體，造成診治困難，延誤治療，并且易帶來由于經(jīng)驗用藥或預(yù)防用藥引發(fā)的細(xì)菌耐藥性顯著增加及抗生素濫用問題[2-3]。美國衛(wèi)生計算與評估研究所（IHME）發(fā)布的報告當(dāng)中，2017年全球有4.7億人發(fā)生呼吸道感染，是一個非常高發(fā)的疾病，全球有390多萬人因呼吸道感染而死亡，中國占到101萬人，從死亡人群年齡分布上看，以70歲以上的老年人為主，占68.9%，5歲以下兒童也有很高的死亡率，占11.7%。引起呼吸道感染的病原體主要有細(xì)菌、真菌、病毒、支原體、衣原體，立克次體等[4]，而現(xiàn)階段實驗室檢測呼吸道病原體的方法主要是細(xì)菌培養(yǎng)法和血清學(xué)檢測抗原抗體法以及單一病原體核酸檢測法，它們或檢測周期長、陽性檢出率低，或窗口期長、假陰性率高，或檢測結(jié)果單一，一次只能鑒定一種病原體。臨床急需一種準(zhǔn)確率高、檢測周期短、涉及病原體種類較多的病原學(xué)檢測方法，能夠準(zhǔn)確且快速地定位病原體，較少臨床誤診及漏診。本研究通過多重實時熒光PCR技術(shù)，對13種常見呼吸道病原體靶基因進(jìn)行擴(kuò)增和檢測，同時收集患者臨床資料，結(jié)合臨床指標(biāo)綜合分析，評價其在呼吸道感染疾病早期診斷中的應(yīng)用價值。

1? ? 資料與方法

1.1? ? 一般資料? ? 選取2021年8月—2022年4月天水市第一人民醫(yī)院收治的312例呼吸道疾病住院患者為研究對象，臨床癥狀主要為發(fā)熱、咽喉痛、流涕、咳嗽咳痰、呼吸不暢，伴或不伴胸痛，胸部影像學(xué)檢查及臨床查體提示呼吸道感染。其中上呼吸道疾病42例，下呼吸道疾病270例。

1.2? ? 方法

1.2.1? ? 標(biāo)本采集? ? 咽拭子采集方法：無菌棉拭子拭取雙咽扁桃體及咽后壁，將拭子置入患者采樣液（無菌生理鹽水）的采樣管中，將試管塞緊后，密閉送檢。痰液收集方法：清晨漱口，咳深部痰于無菌痰盒中，蓋緊盒蓋，密閉送檢。

1.2.2? ? 儀器和試劑? ? 選用美國ABI7500實時定量PCR擴(kuò)增儀、SLAN-96P擴(kuò)增儀、全自動核酸提取儀，湖南圣湘生物科技有限公司七項呼吸道病原菌核酸檢測試劑盒、六項呼吸道病原體核酸檢測試劑盒。

1.2.3? ? 多重?zé)晒釶CR法聯(lián)檢? ? 采用多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR），六項呼吸道病原體核酸檢測是利用針對待檢測病原體核酸保守區(qū)設(shè)計的特異性引物、特異熒光探針，配以PCR反應(yīng)液等組分，在熒光定量PCR儀上，應(yīng)用多重實時熒光定量PCR檢測技術(shù)，通過熒光信號的變化實現(xiàn)對樣本中的呼吸道病原體核酸的快速檢測。七項呼吸道病原菌核酸檢測是基于Taq酶水解熒光探針產(chǎn)生熒光信號及帶熒光產(chǎn)物雜交產(chǎn)生熒光信號兩種技術(shù)原理，針對單色熒光通道中一個目標(biāo)靶點的檢測采用熒光探針，另一個目標(biāo)靶點的檢測采用溶解曲線的方式，從而實現(xiàn)在單色熒光通道中同時進(jìn)行兩個目標(biāo)靶點的檢測和分析。

1.3? ? 觀察指標(biāo)? ? 統(tǒng)計不同類型呼吸道感染疾病的病原體核酸檢測結(jié)果，觀察并總結(jié)差異，另外對引起上、下呼吸道疾病的多重感染病原體進(jìn)行分析。

2? ? 結(jié)果

在312份呼吸道樣本中有274份檢測到病原體，檢出率為87.82%，其中有59份（陽性占比21.53%）樣本中檢測到兩種及以上病原體。

2.1? ? 引起上呼吸道感染的病原體結(jié)果分析? ? 上呼吸道感染病例共42例，檢測到病原體的樣本為33例，檢出率為78.60%，其中有11例樣本中檢測到兩種病原體。病毒是引起上呼吸道感染的主要病原體，檢出率最高的是乙型流感病毒，呼吸道合胞病毒也占有較高的檢出比例，余檢出病原體依次為人鼻病毒、腺病毒、甲型流感病毒、肺炎支原體，見表1。

2.2? ? 引起下呼吸道感染的病原體結(jié)果分析? ? 下呼吸道感染病例共270例，檢測到病原體的樣本為241例，檢出率為 89.30%，其中有48例檢測到兩種及以上病原體。病毒和細(xì)菌均是引起下呼吸道感染的主要病原體，檢出率最高的細(xì)菌是肺炎鏈球菌，檢出率最高的病毒是呼吸道合胞病毒，余檢出病原體依次為流感嗜血桿菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、人鼻病毒、乙型流感病毒、腺病毒、銅綠假單胞菌、肺炎支原體，見表2。

2.3? ? 不同部位多重病原體感染結(jié)果分析? ? 通過實驗檢測發(fā)現(xiàn)，在11例（陽性占比33.33%）診斷為上呼吸道感染的患者和48例（陽性占比19.92%）診斷為下呼吸道感染的患者中存在兩種及以上病原體的混合感染。最常見的多重感染包括呼吸道合胞病毒、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌和人鼻病毒，部分病例還涉及到腺病毒、金黃色葡萄球菌、肺炎支原體的混合感染，見表3。

3? ? 討論

呼吸道感染疾病是全球公共衛(wèi)生難題，感染人群龐大，治愈不易，嚴(yán)重者可致全身性膿毒血癥感染，預(yù)后差[5]。造成此現(xiàn)象一個非常重要的原因是不能在疾病初期準(zhǔn)確定位病原體，延誤甚至錯誤治療，從而導(dǎo)致疾病持續(xù)發(fā)展。與此同時，因為不能正確進(jìn)行針對性治療，就會采用經(jīng)驗性抗生素治療，從而又引發(fā)了另一個嚴(yán)重的全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題，即抗生素濫用，細(xì)菌耐藥與日俱增，藥物用無可用。因此，如何準(zhǔn)確且快速地找出病原體就顯得尤為重要。近幾年來隨著分子領(lǐng)域的快速發(fā)展，運用分子生物學(xué)技術(shù)，將高通量核酸檢測技術(shù)運用到呼吸道病原體檢測中，對呼吸道疾病的診療具有重要意義，可為臨床提供準(zhǔn)確的實驗室依據(jù)。

本研究選取有典型呼吸道臨床表現(xiàn)的患者312例，其中上呼吸道疾病42例，下呼吸道疾病270例。42例上呼吸道感染的病例中有33例檢測到病原體，檢出率為78.57%，檢出率最高的為甲型流感病毒，其余依次為呼吸道合胞病毒、肺炎支原體、乙型流感病毒、副流感病毒、腺病毒以及肺炎衣原體。270例下呼吸道感染的病例中有241例檢測到病原體，檢出率為89.26%，檢出率最高的為肺炎鏈球菌，其余依次為呼吸道合胞病毒、流感嗜血桿菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、人鼻病毒、乙型流感病毒、腺病毒、銅綠假單胞菌、肺炎支原體。本次研究中未檢測出嗜肺軍團(tuán)菌和百日咳桿菌，該兩種細(xì)菌是臨床中較難用常規(guī)細(xì)菌方法培養(yǎng)及鑒定的菌種，后續(xù)還需繼續(xù)擴(kuò)大研究樣本量，驗證實時熒光多重PCR方法對這兩種菌的檢出率，完善有關(guān)數(shù)據(jù)。

本研究數(shù)據(jù)顯示，該方法不僅對檢測病毒有很高的敏感性及檢出率，而且對細(xì)菌的檢出率也明顯高于傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)法，尤其是肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌等苛養(yǎng)菌的陽性率明顯高于培養(yǎng)法。但研究也存在一些弊端，細(xì)菌檢測種類較少，缺少臨床呼吸道感染中常見的一些致病菌，如鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌等。本研究發(fā)現(xiàn)上呼吸道感染的主要病原體為病毒，其同時也是下呼吸道感染的重要病原體，提示臨床對于肺炎的診斷應(yīng)考慮到病毒性肺炎的存在，選擇有效的檢查手段，合理使用抗生素，遏制細(xì)菌耐藥的產(chǎn)生。另外還發(fā)現(xiàn)在呼吸道疾病中存在較多的病原體混合感染情況（陽性占比21.53%），包括病毒和病毒、病毒和細(xì)菌、病毒和支原體的混合感染。值得注意的是，呼吸道合胞病毒在上、下呼吸道的混合感染中都占了較大的比例，與殷海珍的研究結(jié)果相似[6]。此病毒是引起嬰幼兒支氣管和肺部感染的重要病原體，也可引起成人呼吸道感染癥狀，有報道指出呼吸道合胞病毒感染能夠?qū)е潞粑牢⑸鷳B(tài)紊亂，菌落構(gòu)成改變，從而加重患者臨床癥狀[7]。腺病毒血清型多樣，可引發(fā)兒童肺部嚴(yán)重感染致呼吸衰竭，且該病毒還可見肺外臨床表現(xiàn)如肝腫大、腎病等，而現(xiàn)階段實驗室對此病毒抗原檢測的檢出率普遍較低，造成較多的臨床漏檢[8]。這也是和傳統(tǒng)檢測方法相比，多重核酸檢測技術(shù)的一大優(yōu)點，可以用最少的樣本量對多種病原體進(jìn)行聯(lián)合檢測，有效減少了樣本的用量，提高了檢測的便捷度與靈敏度，通過對多種常見病原體的同時檢測，縮短檢測周期，降低檢測成本，減輕了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，同時科室方面也加快了病床的周轉(zhuǎn)，可以服務(wù)于更多的患者。但由于受樣本采集質(zhì)量，正確轉(zhuǎn)運及存放條件對檢測CT值的影響[9]，病原體核酸檢測也可能存在假陰性的錯誤結(jié)果發(fā)生，對于和臨床癥狀不符、臨床高度懷疑感染的患者，可二次送檢。實驗室在盡可能抓好檢驗前質(zhì)量，提高核酸檢測準(zhǔn)確性的同時，臨床應(yīng)結(jié)合實驗室其他檢測手段，影像學(xué)檢查結(jié)果及患者的實際情況綜合分析，從而降低誤診率、漏診率。

本文所使用的多重實時熒光定量PCR檢測體系，引物由湖南圣湘生物科技有限公司提供，確保了引物的準(zhǔn)確性。操作者是持有PCR上崗證書且有多年的PCR工作經(jīng)驗，保證了試驗操作的準(zhǔn)確性。此方法能夠用一份標(biāo)本在3～4 h內(nèi)同時檢測13種常見呼吸道感染的病原體。與細(xì)菌培養(yǎng)、血清學(xué)抗體、單靶標(biāo)PCR方法等現(xiàn)階段實驗室用于檢測呼吸道病原體的手段相比，多重實時熒光PCR技術(shù)的檢測試劑盒因為其本身的方法學(xué)特點，操作較為簡便，在縮短檢測周期的同時，受外界干擾因素較小，病原體檢出率較傳統(tǒng)方法有較大的提高，為呼吸道感染疾病的病原體確定提供可靠的實驗室依據(jù)。

綜上所述，運用實時熒光多重PCR技術(shù)能夠在實驗室角度為臨床醫(yī)生提供呼吸道感染病原體的感染證據(jù)，輔助臨床診斷，促進(jìn)合理正確用藥。

參考文獻(xiàn)

[1]? ? 涂建華，肖光華，楊娜，等.遂寧兒童九項呼吸道感染病原體IgM抗體檢測分析[J].現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)，2019，4（45）：102-107.

[2]? ? 吳林杰，陳孟金.杭州地區(qū)2017年呼吸道感染2 337例病原體檢測結(jié)果分析[J].中國鄉(xiāng)村醫(yī)藥，2019，5（26）：56-57.

[3]? ? 許雪冉，孫強，陰佳，等.抗生素耐藥性全球治理的發(fā)展歷程及對中國的啟示[J].中國衛(wèi)生政策研究，2019，12（5）：38-43.

[4]? ? 秦笙，練立婷，王維亮，等.廣州地區(qū)下呼吸道感染老年患者非典型病原體與病毒檢測及臨床特征分析[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2017，14（13）：120-123.

[5]? ? KUMAR SURINDER.Mycoplasma pneumoniae：A significant but underrated pathogen in paediatric community-acquired lower respiratory tract infections[J].The Indian Journal of Medical ResearchVolume，2018，147（1）：23-31.

[6]? ? 殷海珍.南京地區(qū)小兒呼吸道感染的病原體檢測結(jié)果分析[J].醫(yī)學(xué)信息2021，34（21）：141-143.

[7]? ? 龍鑫，石珮入，羅征秀，等.上呼吸道肺炎鏈球菌定植對呼吸道合胞病毒感染患兒臨床表現(xiàn)的影響[J].中華兒科雜志，2022，60（7）：694-699.

[8]? ? 陳艷敏，王利軍，陳曉亮，等.316例患者呼吸道病原體多重實時熒光PCR檢測及分析[J/CD].臨床醫(yī)藥文獻(xiàn)電子雜志，2019，6（62）：62-64.

[9]? ? 王博文，李國凱，楊莉，等.不同樣本保存條件對鼻咽拭子呼吸道病原體核酸檢測的影響[J].臨床檢驗雜志，2021，39（11）：836-838.（收稿日期：2023-02-03）