夏震宇 龔思宇 王曉川 姜篤銀 單菲 趙潔

[摘要]目的：探究胎鼠真皮間充質(zhì)干細(xì)胞（Fetal mice dermal mesenchymal stem cells， FDMSCs）對M1/2型巨噬細(xì)胞極化的影響。方法：本研究提取FDMSCs，利用脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）、γ干擾素（Interferon-γ，IFN-γ）刺激RAW 264.7誘導(dǎo)為M1型巨噬細(xì)胞，利用白細(xì)胞介素4（Interleukin-4，IL-4）刺激RAW264.7誘導(dǎo)為M2型巨噬細(xì)胞，并建立了FDMSCs-RAW 264.7共培養(yǎng)體系。共培養(yǎng)24 h后，收集巨噬細(xì)胞，用實(shí)時定量PCR和流式細(xì)胞學(xué)檢測M1/2型巨噬細(xì)胞特征性因子白細(xì)胞介素6（Interleukin-6，IL-6）、誘導(dǎo)性一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase，iNOS）、CD86、白細(xì)胞介素10（Interleukin-10，IL-10）、精氨酸酶1（Arg-1）、CD206的表達(dá)變化。結(jié)果：FDMSCs使M1型巨噬細(xì)胞表達(dá)的IL-6、iNOS、CD86減少，IL-10、CD206增多；使M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)的IL-10、Arg-1、CD206表達(dá)增多，iNOS表達(dá)減少。結(jié)論：FDMSCs可以通過調(diào)控巨噬細(xì)胞極化來調(diào)控傷口愈合，對于探索FDMSCs在創(chuàng)面治療過程中的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制有積極意義。

[關(guān)鍵詞]胎鼠；真皮間充質(zhì)干細(xì)胞；巨噬細(xì)胞極化；M1/M2亞型；創(chuàng)面愈合；共培養(yǎng)

[中圖分類號]R751? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2023）09-0058-03

Effect of Fetal Dermal Mesenchymal Stem Cells on Mouse Macrophage Polarization

XIA Zhenyu1，GONG Siyu2，WANG Xiaochuan3，JIANG Duyin1，3，4，SHAN Fei4，ZHAO Jie4

（1.Cheeloo College of Medicine，Shandong University，Jinan 250012，School of Basic Medicine，Jining Medical College，Jining 272067，Shandong，China; 3.Department of Burns and Plastic Surgery，the Second Hospital of Shandong University，Jinan 250033，Shandong，China; 4.Department of Emergency，the Second Hospital of Shandong University，Jinan 250033，Shandong，China）

Abstract： Objective? To investigate the effect of FDMSCs on the polarisation of M1/2 type macrophages. Methods? In this study， RAW264.7 was induced into M1-type macrophages by stimulation with lipopolysaccharide （LPS） and gamma interferon （IFN-γ） and into M2-type macrophages by stimulation with interleukin 4 （IL-4）， and a FDMSCs-RAW264.7 co-culture system was established. After 24 hours of co-culture， macrophages were harvested and changes in the expression of the characteristic factors interleukin 6 （IL-6）， inducible nitric oxide synthase （iNOS）， CD86， interleukin 10 （IL-10）， arginase 1 （Arg-1） and CD206 in M1/2 type macrophages were detected by qRT-PCR and flow cytometry. Results? FDMSCs decreased the expression of IL-6， iNOS and CD86 and increased the expression of IL-10 and CD206 in M1 macrophages; increased the expression of IL-10， Arg-1 and CD206 and decreased the expression of iNOS in M2 macrophages. Conclusion? FDMSCs can regulate wound healing by modulating macrophage polarisation， which has positive implications for exploring the immunomodulatory mechanisms of FDMSCs in the process of wound treatment.

Key words： fetal mice; dermal mesenchymal stem cells; macrophage polarization; M1/M2 macrophage wound healing; coculture

間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）是一種具有多向分化能力和自我更新能力的祖細(xì)胞，可以從骨髓、脂肪、臍帶血等多種組織中分離得到[1]。大量研究表明，MSCs具有強(qiáng)大的修復(fù)能力，既可以遷移至受損部位，通過自身的分化能力修復(fù)損傷；又可以通過釋放參與創(chuàng)面愈合的細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子等協(xié)助修復(fù)[1]。除分化功能外，MSCs還具有免疫調(diào)節(jié)功能，特別是對巨噬細(xì)胞表型和功能的調(diào)控。因此，MSCs成為治療創(chuàng)面不良愈合、自身免疫和炎癥相關(guān)疾病的潛在工具[2]。FDMSCs是從孕15 d胎鼠真皮組織中提取的一種間充質(zhì)干細(xì)胞，與其他成人間充質(zhì)干細(xì)胞相比，具有更強(qiáng)的多向分化能力和更低的免疫原性，并且與胎兒期皮膚的無瘢痕愈合密切相關(guān)。課題組前期研究結(jié)果證實(shí)FDMSCs在促進(jìn)創(chuàng)面愈合，血管再生方面都發(fā)揮著顯著作用[3]。但有關(guān)FDMSCs在免疫調(diào)控方面的作用尚未見探索。巨噬細(xì)胞作為人體免疫細(xì)胞的重要組成部分，在傷口愈合的炎癥、增殖和重塑期都發(fā)揮著關(guān)鍵作用，這種作用是通過由炎癥型M1型巨噬細(xì)胞至抗炎型M2型巨噬細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換實(shí)現(xiàn)的[4]。在一些難以愈合的慢性傷口中，M1型巨噬細(xì)胞群占據(jù)優(yōu)勢，導(dǎo)致創(chuàng)面長期處于炎癥期，進(jìn)而影響組織修復(fù)與重塑[5]。本次實(shí)驗(yàn)擬探究FDMSCs對巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控作用以及對創(chuàng)面愈合的影響，對于進(jìn)一步探索FDMSCs在創(chuàng)面治療中的作用有著積極意義。

1? 材料和方法

1.1 細(xì)胞提取和培養(yǎng)：FDMSCs提取自孕15 d BAL B/C小鼠背部真皮。孕鼠購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司。孕鼠購回后，按手術(shù)無菌操作取出胎鼠并切取背部皮膚。先用中性蛋白酶分離表皮與真皮，后用Ⅰ型膠原酶消化真皮組織，用70μm濾網(wǎng)濾出FDMSCs，與含有10%FBS的DMEM低糖培養(yǎng)基于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行傳代培養(yǎng)。RAW264.7（蘇州海星生物公司）培養(yǎng)采用高糖DMEM培養(yǎng)基。傳代培養(yǎng)3次后取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于試驗(yàn)。

1.2 培養(yǎng)細(xì)胞鑒定

1.2.1 FDMSCs：課題組早期已完成FDMSCs的提取及鑒定，本次FDMSCs的提取與前期研究步驟相同[6]。

1.2.2 巨噬細(xì)胞：RAW 264.7為小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞，源自BAL B/c小鼠由Abelson鼠科白血病病毒誘導(dǎo)的腫瘤。購回后按常規(guī)方法，分別使用LPS、IFN-γ與IL-4將RAW 264.7誘導(dǎo)為M1，M2型巨噬細(xì)胞[7-8]。

1.3 FDMSCs與M1/M2型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)：使用0.4 μm小孔的transwell小室進(jìn)行共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。M1/2型巨噬細(xì)胞接種于下室，F(xiàn)DMSCs接種于上室。檢測前共培養(yǎng)24 h。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)：流式細(xì)胞術(shù)檢測FDMSCs與RAW264.7的表面標(biāo)志物。收集5×105個細(xì)胞并用PBS緩沖液重新懸浮，在黑暗中與特異性抗體孵育15 min。之后用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞，并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.5 實(shí)時定量PCR：按試劑盒說明書要求從細(xì)胞中提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用SYBR Green探針檢測mRNA的相對表達(dá)。通過ΔΔCt的方法計(jì)算mRNA表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：使用GraphPad Prism 8進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對每個結(jié)果進(jìn)行3次或多次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，并計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，行單因素方差分析或t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：提取的FDMSCs貼壁生長，細(xì)胞細(xì)長，呈現(xiàn)梭形或紡錘形（見圖1A）。巨噬細(xì)胞RAW 264.7購回后，細(xì)胞貼壁生長，呈小卵圓形，折光性強(qiáng)，呈團(tuán)簇狀生長（見圖1B）。用LPS和IFN-γ將RAW 264.7極化為M1表型。M1型巨噬細(xì)胞伸出特征性的偽足，呈棒狀和放射狀，細(xì)胞折光性減弱（見圖1C）；用IL-4將巨噬細(xì)胞極化為M2表型，M2型巨噬細(xì)胞體積增大呈橢圓形，胞質(zhì)豐富（見圖1D）。

2.2 FDMSCs促進(jìn)RAW 264.7由M1型向M2型轉(zhuǎn)換：將FDMSCs與M1型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后，放射狀、棒狀巨噬細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞變圓，胞質(zhì)增多（見圖2A）。隨后應(yīng)用熒光定量PCR檢測M1型巨噬細(xì)胞的特征促炎因子iNOS和IL-6的基因表達(dá)。結(jié)果表明，與對照組相比，與FDMSCs共培養(yǎng)的M1型巨噬細(xì)胞特征性因子iNOS與IL-6表達(dá)均顯著降低，抗炎細(xì)胞因子IL-10升高（見圖2B）。最后，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD86和CD206兩種細(xì)胞標(biāo)記物，結(jié)果顯示代表M1極化水平的CD86表達(dá)降低，代表M2極化水平的CD206表達(dá)升高（見圖2C、D）。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)DMSCs可以降低M1型巨噬細(xì)胞的極化水平，降低促炎因子IL-6和iNOS的表達(dá)水平，從而使巨噬細(xì)胞調(diào)控的炎癥反應(yīng)水平下降；同時FDMSCs可以促進(jìn)IL-10表達(dá)水平的升高，促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞向M2型的表型轉(zhuǎn)換。

2.3 FDMSCs使M2型巨噬細(xì)胞進(jìn)一步活化：將FDMSCs與M2型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后，M2型巨噬細(xì)胞形態(tài)變化不明顯（見圖3A）。隨后，通過熒光定量PCR檢測代表M2型巨噬細(xì)胞極化水平的特征性細(xì)胞因子IL-10和Arg-1，與對照組相比，F(xiàn)DMSCs干預(yù)后的M2型巨噬細(xì)胞IL-10和Arg-1的基因表達(dá)升高（見圖3B）。最后，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD86和CD206兩種細(xì)胞標(biāo)記物，結(jié)果顯示，相較于對照組，實(shí)驗(yàn)組中CD86表達(dá)降低，CD206表達(dá)升高（見圖3C、D）。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)DMSCs可以增強(qiáng)M2型巨噬細(xì)胞的極化，增加M2型巨噬細(xì)胞特征性細(xì)胞因子IL-10和Arg-1的基因表達(dá)，進(jìn)一步增強(qiáng)M2型巨噬細(xì)胞的抗炎作用。

3? 討論

在傷口愈合初期，具有促炎表型的（M1型）巨噬細(xì)胞表達(dá)高水平的CD86和PD-L1，分泌iNOS、TNF-α、IL-1β、IL-6等多種炎癥介質(zhì)參與炎癥反應(yīng)。隨著組織修復(fù)階段的開始，巨噬細(xì)胞群轉(zhuǎn)換為抗炎表型（M2）型，表達(dá)高水平的CD206、Arg-1、FIZZ1，分泌TGF-β、IL-1受體拮抗IL-10等抗炎細(xì)胞因子[10]。在組織重塑階段，巨噬細(xì)胞還可以釋放基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）以分解臨時細(xì)胞外基質(zhì)，并在成纖維細(xì)胞的參與下共同推動基質(zhì)的重塑和膠原沉積，這一過程在傷口閉合后還會持續(xù)一段時間[9]。在愈合過程中，MSCs與巨噬細(xì)胞共同定位于傷口附近，并將巨噬細(xì)胞極化為M2表型，從而發(fā)揮促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用。例如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，可以通過減少炎癥細(xì)胞的浸潤，減少IL-6和TNF-α的表達(dá)，增加IL-10的表達(dá)，以達(dá)到促進(jìn)創(chuàng)面愈合的效果。有研究證實(shí)了MSCs通過調(diào)控巨噬細(xì)胞的極化，在心肌修復(fù)和減輕急性腎損傷后的纖維化都發(fā)揮著關(guān)鍵作用[11-12]。

作為一種從胎鼠真皮中提取的間充質(zhì)干細(xì)胞，F(xiàn)DMSCs具有較低的免疫原性和較好的生物相容性；其來源于真皮，在皮膚創(chuàng)面修復(fù)過程中可能更好的發(fā)揮原位作用；還是參與無瘢痕愈合的關(guān)鍵細(xì)胞。前期研究結(jié)果已證實(shí)了FDMSCs在血管再生、創(chuàng)面修復(fù)、治療瘢痕疙瘩方面都有著積極作用。然而，F(xiàn)DMSCs對于巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)控作用還沒有相關(guān)研究。

本研究利用Transwell共培養(yǎng)體系，通過熒光定量PCR和流式細(xì)胞學(xué)檢測，發(fā)現(xiàn)在FDMSCs干預(yù)下，M1型巨噬細(xì)胞特征性因子IL-6和iNOS表達(dá)降低，M2型巨噬細(xì)胞特征性因子IL-10和Arg-1表達(dá)升高；M1/2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物CD86表達(dá)降低，CD206表達(dá)升高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明FDMSCs在誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化方面可以促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)換，并使M2型巨噬細(xì)胞進(jìn)一步活化，從而在傷口愈合早期發(fā)揮對炎癥的抑制作用以及后期促進(jìn)組織修復(fù)的作用，為進(jìn)一步研究FDMSCs通過對巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)進(jìn)行創(chuàng)面治療奠定了基礎(chǔ)。

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[收稿日期]2023-02-21

本文引用格式：夏震宇，龔思宇，王曉川，等.胎鼠真皮間充質(zhì)干細(xì)胞對小鼠巨噬細(xì)胞極化的影響[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2023，32（9）：58-60，77.