潘越, 劉勇, 李壯, 朱峰

胰腺癌是世界上最具侵襲性和致命性的惡性腫瘤之一,預(yù)后極差,中位生存期不足6個(gè)月,然而目前胰腺癌的發(fā)病率仍在逐年上升[1-2]。胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDACs)是胰腺癌中最常見的病理類型(>90%)[3],其特點(diǎn)為起病隱匿,大部分患者確診時(shí)已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[4-5],并且治療效果極不理想,即使在歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家,患者5年生存率也僅為10%[5]。因此,深入探究與胰腺癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的分子及機(jī)制,為臨床治療以及新型抗癌藥的研發(fā)提供新的潛在靶點(diǎn)顯得尤為重要。

癌相關(guān)性成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)作為腫瘤微環(huán)境的重要組成部分,目前已有多項(xiàng)研究表明其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用,如參與腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)的建立與重塑[6],與癌細(xì)胞通過多種分泌方式相互對(duì)話[7],影響腫瘤細(xì)胞的增殖與侵襲[8],參與腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸及擴(kuò)散轉(zhuǎn)移等[9]。在胰腺癌中,CAFs也已被證實(shí)是癌癥進(jìn)展的主要因素之一,其參與胰腺癌的血管生成、淋巴管生成、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成等[10-11]。前列腺環(huán)素合成酶(prostacyclin synthase,PGIS/PTGIS)是一種膜結(jié)合性血紅素蛋白,有研究表明PGIS的高表達(dá)在肺癌[12]、乳腺癌[13]、卵巢癌[14]、結(jié)直腸癌[15]以及黑色素瘤[16]的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用,并與患者的不良預(yù)后相關(guān),但尚未見PGIS與胰腺癌或CAFs的相關(guān)作用研究報(bào)道。現(xiàn)有研究者通過生物信息學(xué)分析表明PGIS在胰腺癌中的表達(dá)水平明顯上調(diào)[16],提示可作為胰腺癌的潛在治療靶點(diǎn)之一。因此,本研究擬通過系列體內(nèi)外實(shí)驗(yàn),探究胰腺癌CAFs細(xì)胞中的PGIS在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的調(diào)控作用及相關(guān)作用機(jī)制,為胰腺癌的臨床診療提供新的思路及科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

人胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)spc-1、Bxpc-3、Capan-1、Panc-1、SW1990為南京醫(yī)科大學(xué)附屬逸夫醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室保存,人胰腺癌相關(guān)性成纖維細(xì)胞購(gòu)于上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司,人胰腺星狀細(xì)胞購(gòu)于湖南豐暉生物科技有限公司。胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素雙抗溶液均購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司,iCell原代成纖維細(xì)胞培養(yǎng)體系購(gòu)自上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司。TRIzol試劑購(gòu)自北京天根生化科技有限公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑購(gòu)自上海睿鉑賽生物科技有限公司,q-PCR定量試劑購(gòu)自上海翌圣生物科技股份有限公司。BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒、轉(zhuǎn)染試劑Lipo 8000購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。Transwell小室培養(yǎng)板購(gòu)自廣州潔特生物過濾股份有限公司,基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)Corning公司。CCK-8試劑盒購(gòu)自上海翌圣生物科技股份有限公司,結(jié)晶紫購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司。人PGIS過表達(dá)質(zhì)粒pLV3-CMV-PGIS-EF1a-CopGFP-Puro購(gòu)自武漢淼靈生物科技有限公司。siPGIS小干擾RNA、抗PGIS抗體、抗HIF-1α抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司,抗VEGFA抗體購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司,抗Akt抗體、抗p-Akt抗體、抗GAPDH抗體、山羊抗兔IgG(H+L)HRP和山羊抗小鼠IgG(H+R)HRP二抗均購(gòu)自武漢Proteintech公司。CoCl2購(gòu)自上海Sigma-Aldrich公司。qRT-PCR相關(guān)引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)庫(kù)分析 通過對(duì)GEPIA、Kaplan-Meier數(shù)據(jù)庫(kù)胰腺癌組織的相關(guān)數(shù)據(jù)分析,觀察PGIS在胰腺癌組織及正常胰腺組織中的表達(dá)差異,并進(jìn)一步分析其表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系,利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,對(duì)PGIS在胰腺癌中的表達(dá)差異預(yù)測(cè)結(jié)果及預(yù)后情況進(jìn)行描述,繪制出箱式圖及生存曲線。

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查找人源PGIS、HIF-1α、VEGFA、FGF-2、α-SMA及MMP-9的mRNA序列,并依據(jù)Molloy等[17]的研究設(shè)計(jì)合成人源PGIS、HIF-1α特異性檢測(cè)引物,依據(jù)Wang等[18]的研究設(shè)計(jì)合成人源VEGFA特異性檢測(cè)引物,引物序列見表1。

表1 引物序列的設(shè)計(jì)與合成

1.2.3 CoCl2溶液的制備及細(xì)胞缺氧處理 在無菌蒸餾水中制備50 mmol/L CoCl2儲(chǔ)備溶液,并在培養(yǎng)基中進(jìn)一步稀釋,以獲得最終所需濃度。SW1990和CAFs細(xì)胞分別加適量10%FBS、1%青霉素/鏈霉素的DMEM和iCell培養(yǎng)基在標(biāo)準(zhǔn)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),孵育24 h后,用不同濃度的CoCl2處理胰腺癌細(xì)胞和CAFs細(xì)胞。

1.2.4 總RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR) 將細(xì)胞在TRIzol試劑中裂解,并根據(jù)制造商的方案,使用5×All-in-One RT MasterMix將提取的總RNA合成cDNA,用SYBR Green Master Mix進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。以GAPDH為內(nèi)參基因,qRT-PCR反應(yīng)體系為:2×SYBR Green Master Mix 5 μl,上下游引物各0.5 μl,cDNA 2 μl,無酶水補(bǔ)充至10 μl。每組設(shè)置3個(gè)平行復(fù)孔,采用相對(duì)定量法2-ΔΔCt分析mRNA的表達(dá)情況。

1.2.5 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 將細(xì)胞用PBS洗一遍后吸凈,加蛋白裂解液于冰上裂解5 min,12 000 rpm 4 ℃離心10 min,吸凈上清液,用BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后煮沸變性。以GAPDH為內(nèi)參,經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育過夜、洗膜、二抗孵育、洗膜后曝光,利用Image J軟件進(jìn)行蛋白條帶的定量分析。

1.2.6 小干擾RNA(siRNA)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 將CAFs細(xì)胞提前接種到6孔板(每個(gè)孔約2×105個(gè)細(xì)胞)中過夜,使用6 μl Lipo 8000及80 nM siRNA轉(zhuǎn)染,6 h后換液,48 h后收取細(xì)胞上清液并提取細(xì)胞RNA,通過q-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效率。

1.2.7 PGIS過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建 將293T細(xì)胞接種到6孔板(每個(gè)孔約6×105個(gè)細(xì)胞)中過夜,使用10 μl PEI(1 mg/ml)將2.5 μg核心質(zhì)粒(pLV3-CMV-EF1a-CopGFP-Puro及pLV3-CMV-PGIS-EF1a-CopGFP-Puro)、1 μg pMDLg/pRRE、0.4 μg pRSV-Rev和0.6 μg pMD2.G共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中。48 h后,收集細(xì)胞上清液并用0.45 μm濾器過濾后分裝凍于-80℃。將CAFs細(xì)胞接種到6孔板中(每孔約6×105個(gè)細(xì)胞)過夜,然后每孔分別加400 μl慢病毒感染48 h,之后再用1 μg/ml的嘌呤霉素篩選細(xì)胞,1周后驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。

1.2.8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將胰腺癌細(xì)胞系接種在96孔板中(每個(gè)孔2×103個(gè)細(xì)胞,100 μl重懸液),以過表達(dá)PGIS的CAFs細(xì)胞上清作為培養(yǎng)基,分別在第0、1、3和5天的時(shí)間點(diǎn),向該組的每個(gè)孔中加入10 μl CCK-8試劑,并在37 ℃下孵育1.5 h。孵育后,使用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)量吸光度值。

1.2.9 Transwell細(xì)胞遷移及侵襲實(shí)驗(yàn) 將胰腺癌細(xì)胞系提前饑餓12 h后,使用200 μl無血清培養(yǎng)基將5×104個(gè)細(xì)胞重懸后接種在Transwell小室內(nèi)(侵襲實(shí)驗(yàn)需提前1 h于小室中加入35 μl基質(zhì)膠并置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育),在下室內(nèi)加入過表達(dá)PGIS的CAFs細(xì)胞上清600 μl。培養(yǎng)48 h后,使用4%多聚甲醛室溫下固定細(xì)胞20 min,并用0.1%結(jié)晶紫染色30 min后,洗去多余染料,用棉簽擦除上室表面細(xì)胞后拍照,利用Image J軟件進(jìn)行計(jì)數(shù)分析。

1.2.10 胰腺原位成瘤模型構(gòu)建 在NCG免疫缺陷鼠(雄性,4～6周齡)的胰尾部以1∶3的比例將control、過表達(dá)PGIS的CAFs細(xì)胞與胰腺癌細(xì)胞Aspc-1以100 μl PBS重懸后注射入小鼠胰腺(每只5×105CAFs,1.5×106Aspc-1)。8周后,對(duì)小鼠實(shí)施安樂死,解剖異種移植的腫瘤組織,剝離并稱量腫瘤的重量,用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤體積,計(jì)算公式為:腫瘤長(zhǎng)徑×腫瘤寬徑2/2。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均使用GraphPad Prism軟件進(jìn)行分析,并以平均值±SEM表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用Student’st檢驗(yàn)。P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PGIS在胰腺癌組織和正常胰腺組織中的差異表達(dá)

首先,為了探究PGIS在胰腺癌發(fā)展過程中的潛在作用,我們通過對(duì)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中的胰腺癌相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,觀察到PGIS在胰腺癌組織中的表達(dá)水平顯著上調(diào)(圖1A),并且表達(dá)量顯著高于正常胰腺組織(圖1B)。其次,我們利用Kaplan-Meier數(shù)據(jù)庫(kù)分析了PGIS表達(dá)水平對(duì)胰腺癌患者預(yù)后的影響,發(fā)現(xiàn)PGIS高表達(dá)患者的預(yù)后顯著低于PGIS低表達(dá)的患者(圖1C)。這些分析結(jié)果表明,PGIS對(duì)胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展可能具有促進(jìn)作用。

圖1 PGIS在胰腺癌組織和正常胰腺組織中的差異表達(dá)及預(yù)后 1A:PGIS在胰腺癌組織中的表達(dá)水平明顯上調(diào);1B:PGIS mRNA在胰腺癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常胰腺組織;1C:PGIS高表達(dá)患者的預(yù)后明顯劣于PGIS低表達(dá)患者;T:胰腺癌組織;N:正常胰腺組織

2.2 PGIS在胰腺癌相關(guān)性成纖維細(xì)胞和正常胰腺星狀細(xì)胞中的差異表達(dá)

有研究報(bào)道正常胰腺星狀細(xì)胞(HPSC)是胰腺癌相關(guān)性成纖維細(xì)胞(CAFs)的主要來源[19],因此為進(jìn)一步探究驗(yàn)證PGIS在原代細(xì)胞系中的表達(dá)差異,我們通過提取CAFs與HPSC的細(xì)胞RNA,通過q-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其PGIS的表達(dá)水平(圖2)。通過此實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們證實(shí)PGIS在CAFs中的表達(dá)水平顯著高于其在HPSC中的表達(dá)水平,與PGIS在胰腺癌組織中的表達(dá)水平顯著上調(diào)相符。

圖2 PGIS在胰腺癌相關(guān)性成纖維細(xì)胞和正常胰腺星狀細(xì)胞中的差異表達(dá) 注:PGIS mRNA在CAFs中的表達(dá)水平顯著高于HPSC;***:P<0.001

2.3 低氧條件下培養(yǎng)胰腺癌細(xì)胞模擬腫瘤微環(huán)境模型的構(gòu)建

通過上述結(jié)果,我們已經(jīng)明確PGIS在胰腺癌中表達(dá)顯著上調(diào),并與胰腺癌患者的不良預(yù)后有關(guān)。為進(jìn)一步驗(yàn)證其表達(dá)是否上調(diào),我們利用CoCl2化學(xué)誘導(dǎo)構(gòu)建腫瘤微環(huán)境缺氧模型,模擬胰腺癌發(fā)生、發(fā)展時(shí)的腫瘤微環(huán)境狀態(tài),以250 μM的終濃度加于胰腺癌細(xì)胞SW1990的完全培養(yǎng)基中,分別于0、4、8、12 h的時(shí)間點(diǎn)收取細(xì)胞蛋白,通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PGIS及HIF-1α的表達(dá)水平(圖3)。通過此實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們探究發(fā)現(xiàn)胰腺癌細(xì)胞在一定范圍內(nèi)隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng),PGIS及HIF-1α的表達(dá)水平均明顯上調(diào),與PGIS在胰腺癌組織中的表達(dá)水平顯著上調(diào)相符。

圖3 低氧條件下培養(yǎng)胰腺癌細(xì)胞模擬腫瘤微環(huán)境模型的構(gòu)建 3A:Western blot檢測(cè)SW1990細(xì)胞的PGIS和HIF-α表達(dá)水平;3B:SW1990細(xì)胞的PGIS和HIF-1α蛋白灰度分析;***:P<0.001

2.4 低氧條件下培養(yǎng)CAFs模擬腫瘤微環(huán)境模型的構(gòu)建

由于CAFs在胰腺癌中發(fā)揮著十分重要的作用,為進(jìn)一步探究CAFs在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的具體作用及相關(guān)機(jī)制,我們首先通過利用CoCl2化學(xué)誘導(dǎo)構(gòu)建腫瘤微環(huán)境缺氧模型,模擬胰腺癌發(fā)生、發(fā)展時(shí)的腫瘤微環(huán)境狀態(tài),以500 μM的終濃度加于CAFs的完全培養(yǎng)基中,分別于0、2、4、6 h的時(shí)間點(diǎn)收取細(xì)胞RNA,通過q-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PGIS、HIF-1α及VEGFA的表達(dá)水平(圖4)。通過此實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)CAFs在一定范圍內(nèi)隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng),PGIS、HIF-1α及VEGFA的表達(dá)水平均明顯上調(diào),提示CAFs在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能具有促進(jìn)作用,并且與PGIS密切相關(guān)。

圖4 低氧條件下培養(yǎng)CAFs模擬腫瘤微環(huán)境模型的構(gòu)建注:q-PCR檢測(cè)CAFs細(xì)胞的PGIS、HIF-1α和VEGFA表達(dá)水平;*:P<0.05;***:P<0.001

2.5 構(gòu)建敲低和過表達(dá)PGIS的CAFs細(xì)胞模型

為繼續(xù)深入探究CAFs中的PGIS在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的明確作用及相關(guān)機(jī)制,我們通過利用siRNA轉(zhuǎn)染和慢病毒感染的方式構(gòu)建敲低和過表達(dá)PGIS的CAFs細(xì)胞,建立敲低和過表達(dá)PGIS的CAFs細(xì)胞模型,通過q-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其敲低及過表達(dá)效率(圖5)。通過以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過表達(dá)PGIS的CAFs細(xì)胞中PGIS蛋白和mRNA的表達(dá)水平均顯著上調(diào),敲低PGIS的CAFs細(xì)胞中PGIS的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào),表明我們已成功構(gòu)建出敲低及過表達(dá)PGIS的CAFs細(xì)胞模型并可以進(jìn)行后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)。

圖5 構(gòu)建敲低和過表達(dá)PGIS的CAFs細(xì)胞模型 5A:q-PCR檢測(cè)CAFs細(xì)胞中PGIS的敲低效率;5B:q-PCR檢測(cè)CAFs細(xì)胞中PGIS的過表達(dá)效率;5C:Western blot檢測(cè)CAFs細(xì)胞中PGIS的過表達(dá)效率;5D:CAFs細(xì)胞的過表達(dá)PGIS蛋白灰度分析;*:P<0.05;***:P<0.001

2.6 CAFs中的PGIS在體外促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖

為探究CAFs中的PGIS在胰腺癌中的具體功能,我們首先檢測(cè)了CAFs中的PGIS對(duì)胰腺癌細(xì)胞的增殖功能的影響。通過收取敲低和過表達(dá)PGIS的CAFs細(xì)胞培養(yǎng)上清,將其上清與胰腺癌細(xì)胞SW1990、Panc-1進(jìn)行共培養(yǎng),通過CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè),我們發(fā)現(xiàn)敲低CAFs中的PGIS可以明顯抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖速率,而過表達(dá)CAFs中的PGIS可以明顯促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖速率(圖6)。因此,通過以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們可以確定CAFs中的PGIS在體外促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖功能。

圖6 CAFs中的PGIS在體外促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖 6A:敲低PGIS的CAFs對(duì)SW1990細(xì)胞增殖的影響;6B:敲低PGIS的CAFs對(duì)Panc-1細(xì)胞增殖的影響;6C:過表達(dá)PGIS的CAFs對(duì)SW1990細(xì)胞增殖的影響;6D:過表達(dá)PGIS的CAFs對(duì)Panc-1細(xì)胞增殖的影響;**:P<0.01

2.7 CAFs中的PGIS在體外促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的遷移與侵襲能力

其次,我們探究了CAFs中的PGIS對(duì)胰腺癌細(xì)胞的遷移與侵襲能力的影響。通過收取敲低和過表達(dá)PGIS的CAFs細(xì)胞培養(yǎng)上清,將其上清作為胰腺癌細(xì)胞Bxpc-3、SW1990、Panc-1的下室培養(yǎng)液,通過Transwell遷移實(shí)驗(yàn)探究,我們發(fā)現(xiàn)敲低CAFs中的PGIS后胰腺癌細(xì)胞的遷移數(shù)量明顯減少,而過表達(dá)CAFs中的PGIS后胰腺癌細(xì)胞的遷移數(shù)量明顯增多(圖7A～7E);將收取的敲低和過表達(dá)PGIS的CAFs細(xì)胞培養(yǎng)上清作為胰腺癌細(xì)胞Aspc-1、Bxpc-3、Capan-1的下室培養(yǎng)液,通過Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)探究,我們發(fā)現(xiàn)敲低CAFs中的PGIS后胰腺癌細(xì)胞穿過基質(zhì)膠的數(shù)量明顯減少,而過表達(dá)CAFs中的PGIS后胰腺癌細(xì)胞穿過基質(zhì)膠的數(shù)量明顯增多(圖7F～7J)。因此,通過以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們可以確定CAFs中的PGIS在體外促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的遷移與侵襲能力。

圖7 CAFs中的PGIS在體外促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的遷移與侵襲能力 7A:敲低PGIS的CAFs對(duì)Aspc-1遷移能力的影響(×10);7B:敲低PGIS的CAFs對(duì)Bxpc-3遷移能力的影響(×10);7C:敲低PGIS的CAFs對(duì)Aspc-1侵襲能力的影響(×10);7D:敲低PGIS的CAFs對(duì)Bxpc-3侵襲能力的影響(×10);7E:敲低PGIS的CAFs對(duì)胰腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的定量統(tǒng)計(jì)分析;7F:過表達(dá)PGIS的CAFs對(duì)SW1990遷移能力的影響(×10);7G:過表達(dá)PGIS的CAFs對(duì)Panc-1遷移能力的影響(×10);7H:過表達(dá)PGIS的CAFs對(duì)Aspc-1侵襲能力的影響(×10);7I:過表達(dá)PGIS的CAFs對(duì)Capan-1侵襲能力的影響(×10);7J:過表達(dá)PGIS的CAFs對(duì)胰腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的定量統(tǒng)計(jì)分析;**:P<0.01;***:P<0.001

2.8 過表達(dá)PGIS的CAFs在體內(nèi)促進(jìn)胰腺腫瘤的生長(zhǎng)

為進(jìn)一步探究CAFs中的PGIS在體內(nèi)對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖能力的影響,我們構(gòu)建了胰腺原位荷瘤模型,以1∶3的比例將過表達(dá)PGIS的CAFs細(xì)胞與胰腺癌細(xì)胞Aspc-1共注射于NCG小鼠,8周后解剖取腫瘤,實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,過表達(dá)PGIS的CAFs可以明顯促進(jìn)胰腺腫瘤的形成能力(圖8)。通過此實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們證實(shí)了過表達(dá)PGIS的CAFs在體內(nèi)同樣具有促進(jìn)胰腺腫瘤生長(zhǎng)的能力。

圖8 過表達(dá)PGIS的CAFs在體內(nèi)促進(jìn)胰腺腫瘤的生長(zhǎng) 8A:過表達(dá)PGIS的CAFs在體內(nèi)對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖的影響;8B:小鼠腫瘤重量的定量統(tǒng)計(jì)分析;8C:小鼠腫瘤體積的定量統(tǒng)計(jì)分析;*:P<0.05

2.9 PGIS促進(jìn)CAFs正調(diào)控VEGFA因子的表達(dá)

通過以上實(shí)驗(yàn),我們已經(jīng)確定CAFs中的PGIS可以促進(jìn)胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展,然而其調(diào)控胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制仍需進(jìn)一步探索研究。我們通過提取過表達(dá)PGIS的CAFs細(xì)胞蛋白,利用Western blot實(shí)驗(yàn)探究檢測(cè)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PGIS后可明顯提高CAFs對(duì)VEGFA因子的表達(dá)水平(圖9)。通過此實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)CAFs中的PGIS對(duì)正調(diào)控VEGFA因子的表達(dá)具有重要作用。

圖9 PGIS促進(jìn)CAFs正調(diào)控VEGFA因子的表達(dá) 9A:Western blot檢測(cè)過表達(dá)PGIS的CAFs細(xì)胞的VEGFA表達(dá)水平;9B:CAFs細(xì)胞的PGIS和VEGFA蛋白灰度分析;***:P<0.001

2.10 PGIS在CAFs中通過正調(diào)控PI3K/Akt通路促進(jìn)胰腺癌發(fā)展

為進(jìn)一步探究CAFs中的PGIS促進(jìn)胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的具體機(jī)制及相關(guān)通路,我們將收取的過表達(dá)PGIS的CAFs細(xì)胞培養(yǎng)上清與胰腺癌細(xì)胞Aspc-1進(jìn)行共培養(yǎng),48 h后提取細(xì)胞蛋白,通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)CAFs中的PGIS后Aspc-1的Akt磷酸化水平呈現(xiàn)出明顯升高趨勢(shì)(圖10)。通過以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)在胰腺癌中,CAFs中的PGIS可以促進(jìn)Akt磷酸化,正向調(diào)控Akt信號(hào)通路的激活。

圖10 PGIS在CAFs中通過正調(diào)控PI3K/Akt通路促進(jìn)胰腺癌發(fā)展 10A:Western blot檢測(cè)Aspc-1細(xì)胞的Akt蛋白及其活化形式p-Akt蛋白的表達(dá)水平;10B:p-Akt蛋白的灰度分析;***:P<0.001

2.11 PGIS促進(jìn)CAFs正調(diào)控FGF-2、α-SMA及MMP-9等因子的表達(dá)

最后,我們通過提取過表達(dá)PGIS的CAFs細(xì)胞RNA,利用q-PCR實(shí)驗(yàn)探究檢測(cè)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PGIS后可明顯提高CAFs對(duì)FGF-2、α-SMA、MMP-9等因子的表達(dá)水平(圖11)。通過此實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)CAFs中的PGIS可以正調(diào)控FGF-2、α-SMA、MMP-9等因子的表達(dá),可能對(duì)促進(jìn)胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展具有重要作用。

圖11 PGIS促進(jìn)CAFs正調(diào)控FGF-2、α-SMA及MMP-9等因子的表達(dá) 11A:q-PCR檢測(cè)過表達(dá)PGIS的CAFs細(xì)胞FGF-2的表達(dá)水平;11B:q-PCR檢測(cè)過表達(dá)PGIS的CAFs細(xì)胞α-SMA的表達(dá)水平;11C:q-PCR檢測(cè)過表達(dá)PGIS的CAFs細(xì)胞MMP-9的表達(dá)水平;**:P<0.01;***:P<0.001

3 討論

胰腺癌是最具侵襲性的惡性腫瘤之一,世界上發(fā)病率最高的地區(qū)為北美、歐洲和澳大利亞[2]。胰腺癌在歐洲最常見的癌癥中排名第14位,但卻是繼肺癌、結(jié)直腸癌和乳腺癌之后第4位導(dǎo)致患者死亡的癌癥相關(guān)原因[20],可見胰腺癌預(yù)后之差及惡性程度之高。目前手術(shù)治療仍是根治胰腺癌的唯一方法,但即使在接受手術(shù)治療的患者中,術(shù)后5年生存率也僅為15～25%[2]。因此,深入探索研究胰腺癌發(fā)生、發(fā)展以及侵襲、轉(zhuǎn)移的具體相關(guān)機(jī)制顯得尤為迫切。CAFs是腫瘤微環(huán)境中含量最豐富、最主要的成分[10],在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著十分重要的作用,目前研究已證實(shí)CAFs可通過旁分泌和細(xì)胞外基質(zhì)重塑等多種方式促進(jìn)腫瘤進(jìn)展,產(chǎn)生治療耐藥和介導(dǎo)免疫抑制等[21-23]。近些年來,CAFs在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用越來越受到重視,然而CAFs與胰腺癌進(jìn)展的相互作用機(jī)制研究尚不足,尤其是探究CAFs中相關(guān)基因或分子的表達(dá)水平對(duì)胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的作用機(jī)制研究有較大空缺。

PGIS為前列環(huán)素合成酶,是CYP450家族的成員之一,其可以催化PGH2轉(zhuǎn)化為PGI2[24]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PGIS在肺癌、乳腺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌以及黑色素瘤等多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào),并且與患者預(yù)后不良有關(guān)[12-16]。在本研究中,我們利用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)PGIS在胰腺癌組織中的表達(dá)水平明顯上調(diào),并與患者的不良預(yù)后相關(guān),我們通過構(gòu)建敲低及過表達(dá)PGIS的CAFs細(xì)胞,將收集的CAFs細(xì)胞培養(yǎng)上清與胰腺癌細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng),并且將過表達(dá)PGIS的CAFs細(xì)胞與胰腺癌細(xì)胞共注射入小鼠胰尾部構(gòu)建胰腺原位成瘤模型,進(jìn)而探究CAFs細(xì)胞中的PGIS在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的調(diào)控作用以及相關(guān)作用機(jī)制。我們首次證明敲低CAFs中的PGIS后可明顯抑制胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移及侵襲,而過表達(dá)CAFs中的PGIS后又可明顯促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移及侵襲,在胰腺癌中具有促癌作用,可能是胰腺癌的潛在治療靶點(diǎn)之一。

在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)在過表達(dá)PGIS的CAFs細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)在整個(gè)培養(yǎng)期間顯著上調(diào)。研究表明VEGFA是調(diào)節(jié)病理性血管生長(zhǎng)和維持的關(guān)鍵介質(zhì),也是一種有效的血管通透性誘導(dǎo)劑[4]。PI3K/Akt通路是一條經(jīng)典信號(hào)通路,已有多項(xiàng)研究證實(shí)胰腺癌可通過PI3K/Akt通路促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[25-27]。我們將CAFs細(xì)胞培養(yǎng)上清與胰腺癌細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng),收取細(xì)胞蛋白,通過Western blot實(shí)驗(yàn)探究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)CAFs中的PGIS后可以明顯上調(diào)磷酸化Akt的蛋白水平,正向調(diào)控Akt信號(hào)通路的激活,表明PGIS可通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)胰腺癌的進(jìn)展。最后,我們還通過q-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),過表達(dá)CAFs中的PGIS后可促進(jìn)CAFs細(xì)胞對(duì)FGF-2、α-SMA及MMP-9等因子的表達(dá),可能對(duì)促進(jìn)胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展具有一定的作用。

綜上所述,我們通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探究證實(shí)了過表達(dá)PGIS的CAFs細(xì)胞可以通過PI3K/Akt信號(hào)通路正向調(diào)控VEGFA的表達(dá)上調(diào),進(jìn)而促進(jìn)胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展,明確了CAFs中的PGIS在胰腺癌進(jìn)展中發(fā)揮的重要調(diào)控作用,可能為胰腺癌的潛在治療靶點(diǎn)之一。然而,PGIS、VEGFA及Akt信號(hào)通路之間發(fā)揮作用聯(lián)系的具體分子機(jī)制尚未闡明,后續(xù)我們將繼續(xù)深入探究CAFs中的PGIS調(diào)控胰腺癌的具體機(jī)制,并通過收集相關(guān)臨床標(biāo)本及患者資料進(jìn)一步檢測(cè)證實(shí)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,為胰腺癌的臨床診療以及新型抗癌藥的研發(fā)提供新的理論依據(jù)。