王笑一　王欣宇　張雪寧　李敬

摘要：目的 探討硫化錸（ReS2）納米顆粒的能譜CT成像性能及其在乳腺癌細胞中的光熱治療效果。方法 采用一鍋法在室溫下合成ReS2納米顆粒；利用X射線光電子能譜、高分辨透射電鏡、紫外吸收光譜對ReS2納米顆粒進行材料學基本性質的表征。比較等效濃度的ReS2納米顆粒和碘海醇在不同能量下（60～140 keV）的能譜CT成像能力。通過測定不同質量濃度的ReS2納米顆粒水溶液（0、50、100、250和500 mg/L）在體外光熱升溫效果來評估納米顆粒的光熱轉換能力。取小鼠乳腺癌細胞4T1與不同質量濃度的ReS2納米顆粒水溶液（0、20、40、80和100 mg/L）共孵育，并通過MTT實驗評估納米顆粒的細胞毒性；通過細胞熒光染色法可視化觀察分析ReS2納米顆粒的光熱細胞殺傷效果。結果 高分辨透射電鏡觀察到制備的納米顆粒粒徑＜10 nm，紫外吸收光譜證實ReS2在808 nm處具有較強的吸收能力。當能量在60～140 keV時，等效濃度下ReS2納米顆粒的CT成像效果明顯優(yōu)于碘海醇溶液。在功率密度為3 W/cm2的808 nm激光照射下，500 mg/L ReS2溶液的溫度可提高44.90 °C±1.2 °C，而在相同條件下，純水的溫度僅提高了9.27 °C±0.74 °C。細胞學實驗表明，在無激光照射的情況下，40～100 mg/L的ReS2納米顆粒處理后，細胞存活率均＞85%；在激光照射下，ReS2納米顆粒濃度＞40 mg/L時，生存率已＜30%。結論 ReS2納米顆粒制備簡單，具有良好的生物相容性和光熱治療性能，且能譜CT成像效果顯著，極具臨床轉化潛力。

關鍵詞：造影劑；納米粒子；CT成像；硫化錸；光熱治療

中圖分類號：R817.12文獻標志碼：ADOI：10.11958/20230209

Study of rhenium sulfide nanoparticles in spectral CT imaging and photothermal therapy

WANG Xiaoyi WANG Xinyu ZHANG XueningLI Jing

1 Department of Ultrasound， the Second Hospital of Tianjin Medical University， Tianjin 300211， China; 2 Department of Radiology， Tianjin Key Laboratory of Functional Imaging， Tianjin Medical University General Hospital;

3 Department of Radiology， the Second Hospital of Tianjin Medical University

△Corresponding Author E-mail： luckyxn@126.com

Abstract： Objective To investigate the spectral CT imaging performance of Rhenium sulfide （ReS2） nanoparticles and their effect on photothermal therapy in breast cancer cells. Methods ReS2 nanoparticles were synthesized by one-pot method at room temperature. The basic materialistic properties of ReS2 nanoparticles were characterized by X-ray photoelectron spectroscopy， high-resolution transmission electron microscopy and UV absorption spectroscopy. The spectral CT imaging capability of ReS2 nanoparticles with the same molar concentration of iodine at different energies （60-140 keV） was compared. The photothermal conversion ability of nanoparticles was evaluated by measuring the in vitro photothermal warming of aqueous solutions of ReS2 nanoparticles with different mass concentrations （0、20、40、80 and 100 mg/L）. Mouse breast cancer cells 4T1 were co-incubated with different mass concentrations of ReS2 nanoparticle aqueous solution （0， 20， 40， 80 and 100 mg/L）. The cytotoxicity of nanoparticles was evaluated by MTT experiment and cell photothermal killing experiment. The photothermal cell killing effect of ReS2 nanoparticles was visually observed and analyzed by cytofluorescent staining. Results High-resolution transmission electron microscopy observed that the particle size of the prepared nanoparticles was less than 10 nm. The UV absorption spectrum confirmed the strong absorption of ReS2 at 808 nm. When the energy was in the range of 60-140 keV， the CT imaging effect of ReS2 nanoparticles at equivalent molar concentration was significantly better than that of iohexol solution. The temperature of 500 mg/L ReS2 solution could be increased by 44.90 °C ± 1.2 °C under 808 nm laser irradiation with a power density of 3 W/cm2， while the temperature of pure water was only increased by 9.27 °C ± 0.74 °C under the same conditions. Cellular experiments showed that in the absence of laser irradiation， the survival rate of 4T1 cells treated with ReS2 nanoparticles at concentrations of 40-100 mg/L were all greater than 85%. The cell survival rate was also reduced at ReS2 nanoparticle concentrations of 40-100 mg/L compared to the 0-40 mg/L case under laser irradiation， but the survival rate was already less than 30%. Conclusion ReS2 nanoparticles are simple to prepare， have good biocompatibility and photothermal therapeutic properties， and have strong killing effect on breast cancer cells under NIR laser irradiation， which have good clinical translation potential.

Key words： contrast media; nanoparticles; CT imaging; rhenium sulfide; photothermal therapy

利用碘基對比劑的CT增強成像已經有20余年的歷史，且迄今為止在臨床中仍未開發(fā)出可替代碘的新型CT對比劑［1-3］。然而，碘元素的低K-edge值（33.2 keV）導致了影像的信噪比不佳，這使得碘小分子和碘基成像對比劑不能滿足能譜CT的成像需求［4］。近幾年，研究人員將高原子序數的金屬元素作為基質，合成了新型的CT敏感型納米顆粒，并且成功應用于增強CT成像［5-6］。高原子序數使這些含金屬的納米顆粒在CT以及能譜CT成像中具有獨特的優(yōu)勢，并在較高的能量下仍保持較強的X射線吸收能力。但這類納米材料在臨床應用中仍存在巨大的生物安全問題［7］。因此，亟需開發(fā)具有高X線吸收能力和良好的生物安全性的新型能譜CT對比劑。硫化錸（ReS2）納米顆粒作為近年來新型的CT對比劑，因Re元素較高的原子序數（Z=75），故具有較強的X線吸收能力［8-9］。ReS2材料曾被用于與99Tcm配合進行前哨淋巴結檢測以及放射性滑膜切除術的臨床前研究，具有一定的生物安全性［10-12］。目前，ReS2納米顆粒在能譜CT成像及光熱治療領域鮮有研究。本研究旨在評估ReS2納米顆粒的能譜CT成像效果及光熱性能并初步探討其在乳腺癌細胞中的光熱殺傷作用。

1 材料與方法

1.1 材料

所用試劑均至少屬于分析級。高錸酸鈉（NaReO4）購自美國Thermo Scientific公司。硫代硫酸鈉（Na2S2O3·5H2O）、氫氧化鈉（NaOH）、鹽酸（HCl）、乙二醇（EG）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）和磷酸二氫鈉（NaH2PO4），噻唑藍（MTT）均購于上海阿拉丁試劑有限公司。鈣黃綠素乙酰氧基甲酯（Calcein-AM）碘化丙啶（PI）購自上海東仁化學科技有限公司。二甲基亞砜（DMSO）購自天津康科德科技有限公司。胰酶購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。DMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco公司。小鼠乳腺癌4T1細胞購自ATCC細胞庫。X射線光電子能譜儀（英國克雷斯托分析儀器公司，Axis Ultra DLD）；高分辨率透射電子顯微鏡（荷蘭飛利浦公司，Tecnai G2 F20）；紫外-可見-近紅外分光光度計（日本日立高新技術公司，UV-3600 plus）；紅外熱值相機（美國菲力爾公司，E50）；酶標儀（山東博科生物有限公司，BK-EL10C）；808 nm近紅外激光器（北京海特光電有限責任公司，LOS-BLD-808nm-15W-C/P）；能譜CT成像系統(tǒng)（德國西門子醫(yī)療系統(tǒng)有限公司，SOMATOM Force）。

1.2 ReS2納米顆粒的合成

采用一鍋法在室溫下合成ReS2納米顆粒。首先，將22 mg的NaReO4和64 mg的Na2S2O3·5H2O混合到8 mL的EG中，然后加入250 ?L的HCl（6 mol/L）。攪拌40 min，當淡黃色溶液變?yōu)楹谏珪r，用1 mol/L的NaOH溶液調節(jié)pH=7時終止反應，得到的ReS2納米顆粒水溶液在截流量3.5 kDa的透析袋中透析以去除未反應的試劑。純化后的ReS2納米顆粒于4 ℃環(huán)境下保存并用于后續(xù)研究。

1.2.1 ReS2納米顆粒的表征

（1）X射線光電子能譜（XPS）。將制備好的ReS2納米顆粒經凍干處理后研磨并制樣，然后上機測定其元素組成。（2）高分辨透射電鏡觀察。將制備好的ReS2納米顆粒稀釋并在銅網上制樣并上機觀察分布及粒徑。（3）紫外-可見-近紅外吸收光譜。將不同質量濃度的ReS2納米顆粒（10、20、50、80、100、200、250和500 mg/L）放入紫外-可見-近紅外光譜儀中，測定其在808 nm波長處的光密度（OD）值，并確定OD值與ReS2濃度的關系。

1.2.2 能譜CT成像效果分析

分別在1.5 mL離心管中加入ReS2納米顆粒的水溶液和碘海醇稀釋液（Re與I元素等濃度35 mmol/L），然后進行CT掃描。掃描參數：管電壓90/Sn150 kV，自適應管電流，視野范圍80 mm×80 mm。以高級建模迭代重建（ADMIRE）算法重建能譜CT影像（層厚0.5 mm，重建增量0.25 mm）。在60～140 keV的電子能量范圍內，以10 keV的增量重建了虛擬的單能量影像。并通過syngo.via軟件分析能譜CT影像和能譜CT的HU值。

1.2.3 光熱性能評估

利用808 nm激光以3 W/cm2的功率密度輻照不同質量濃度（0、50、100、250和500 mg/L）的ReS2納米顆粒的水溶液10 min，測量溶液溫度。熱值相機拍攝紅外熱值圖像。

1.2.4 細胞毒性評估及光熱殺傷效果評價

（1）MTT法評估ReS2納米顆粒的細胞毒性。將4T1細胞接種在96孔板中（5×104個細胞/孔），并在含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-鏈霉素和89%的DMEM中培養(yǎng)24 h。棄去原始培養(yǎng)基，加入0（對照）、20、40、80和100 mg/L的ReS2納米顆粒與細胞共孵育24 h。ReS2處理后的4T1細胞分為無激光照射組和激光照射組。無激光照射組正常培養(yǎng)，激光照射組使用功率密度為3 W/cm2的808 nm激光器照射10 min。照射結束后棄去細胞上清液，PBS洗滌后添加10 μL的MTT溶液共孵育4 h，之后添加120 μL的DMSO以溶解紫色晶體，在酶標儀上測量溶液在490 nm波長處的OD值。最后通過公式計算細胞存活率，細胞存活率=OD處理組/OD對照組×100%。每組實驗重復3次。

（2）細胞熒光染色法可視化評估光熱的細胞殺傷效果。無激光照射組和激光照射組細胞參照上述分組處理后加入Calcein AM/PI試劑，在37 ℃避光孵育30 min。孵育結束后，在避光環(huán)境下用熒光顯微鏡下觀察染色效果。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0軟件進行數據分析。符合正態(tài)分布的計量數據以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較用Bonferroni法校正。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ReS2納米顆粒的表征

ReS2納米顆粒外觀呈黑色，常溫常壓下性質穩(wěn)定，經過XPS表征，本實驗合成的ReS2納米顆粒的Re光譜在44.4 eV和42.1 eV處有2個明顯的峰，這2個峰分別對應Re 4f5/2和Re 4f7/2狀態(tài)，證明四價Re元素的形成，進一步說明ReS2納米結構的成功合成（圖1）。高分辨透射電鏡下可見ReS2納米顆粒粒徑分布均勻，粒徑均小于10 nm（圖2）。紫外吸收光譜結果顯示，ReS2納米顆粒在808 nm處的吸光度與ReS2納米顆粒濃度呈良好的線性關系，證實其具有較強且穩(wěn)定的近紅外吸收能力（圖3）。

2.2 ReS2納米顆粒的能譜CT成像效果

通過CT體外成像顯示，當能量從60 keV增加到140 keV時，相較于碘海醇溶液的CT影像亮度隨著能量的增加而急劇變暗，ReS2的CT影像亮度隨著能量的增加其變暗幅度較?。▓D4）。等效濃度下ReS2納米顆粒與碘海醇溶液之間的CT值差異越來越明顯（圖5）。

2.3 ReS2納米顆粒的光熱性能評估

在功率密度為3 W/cm2的808 nm激光照射下，500 mg/L的ReS2溶液的溫度升高了44.90 ℃±1.2 ℃，而在相同條件下，純水的溫度提高了9.27 ℃±0.74 ℃，見圖6。

2.4 ReS2納米顆粒的細胞毒性和光熱殺傷效果

無激光照射組ReS2納米顆粒濃度≥40 mg/L時，4T1細胞存活率較0 mg/L下降，但細胞存活率均＞85%。激光照射組ReS2納米顆粒濃度＞40 mg/L時，4T1細胞存活率亦較0 mg/L下降，但存活率已小于30%，見表1。細胞熒光染色結果亦顯示，只有將ReS2納米顆粒孵育和激光照射相結合才能造成破壞性的細胞消融，見圖7。

3 討論

近年來，研究人員通過對納米材料的設計和合成將目前臨床上診斷和治療兩個功能集成于一個納米載體，能夠實時、精確診斷病情并同步進行治療，而且在治療過程中能夠監(jiān)控療效并隨時調整給藥方案，有利于達到最佳治療效果，并減少不良反應［13-15］。在CT成像方面，相對于常用的碘對比劑，高原子序數對比劑能夠在高能量下呈現穩(wěn)定的成像效果，進而有著對病變進行更清晰的成像潛力［16］。

本研究通過一鍋法制備ReS2納米顆粒，方法簡單，制備的ReS2納米顆粒粒徑較小且分布均勻，通過紫外吸收光譜證實其具有較強且穩(wěn)定的近紅外吸收能力。為了探究ReS2作為能譜CT成像對比劑的可行性，本研究將ReS2與等效摩爾濃度的碘海醇進行能譜CT成像效果的對比，結果表明，在60 keV的能量水平下，碘海醇的成像效果與ReS2相近，而隨著能量的升高，碘海醇的成像效果遠不如與相同元素摩爾濃度的ReS2，提示ReS2納米顆粒在高能量下的CT成像能力優(yōu)于等效摩爾濃度的碘海醇。細胞毒性結果顯示，100 mg/L的ReS2濃度下4T1細胞仍有較高的細胞存活率（>85%），證實ReS2納米顆粒有較低的細胞毒性和較好的生物安全性?；赗eS2良好的生物安全性，本研究進一步探究其光熱治療的應用前景。細胞實驗結果表明，在單純應用激光照射或單純ReS2干預的情況下，4T1細胞的存活率仍然較高，均未達到明顯的殺滅腫瘤細胞效果。當ReS2與用激光照射聯合使用時，激光激發(fā)ReS2后產生的熱量明顯抑制了4T1細胞的存活，ReS2濃度達到80 mg/L時，絕大部分腫瘤細胞被有效抑制；ReS2濃度達到100 mg/L時，腫瘤細胞被有效殺傷，肉眼見不到任何細胞存活。上述結果證實ReS2溶液吸收近紅外激光的能量后將光能轉化為熱能，升高的溶液溫度殺死了4T1乳腺癌細胞，殺滅效果顯著，效果持續(xù)時間較長，實現了基于ReS2的腫瘤細胞光熱殺傷療法。

綜上所述，ReS2納米顆粒制備方法簡便，生物安全性較好，具有優(yōu)秀的能譜CT成像效果和光熱治療潛力。這為腫瘤性病變的診療一體化提供了新的途徑，具有臨床轉化及應用價值。

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（2023-02-21收稿 2023-03-28修回）

（本文編輯 胡小寧）