司譽豪,馬 勇,尹 恒

0 引 言

外泌體是一類納米級(30～150 nm)內源性細胞囊泡,由不同類型的組織細胞分泌,廣泛分布于外周血液、尿液、關節(jié)液、腦脊液等生物體液中。外泌體能夠攜帶各種功能性生物分子,包括蛋白質、信號分子、mRNA、miRNA等[1]。供體細胞通過外泌體將遺傳信息和蛋白質傳遞給靶細胞,在細胞間通訊中起著至關重要的作用[2]。當前對于外泌體的研究涉及人體多組織細胞,其中,成骨細胞與破骨細胞的外泌體活性及其生物作用愈發(fā)引起關注,是骨質疏松癥領域的研究熱點之一[3]。

研究表明,成骨細胞來源外泌體對骨組織具有靶向作用,在骨微環(huán)境中與破骨細胞的相互作用,可載核因子κB受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)與二磷酸鹽等藥物對破骨細胞產生調控作用[4-5],在開發(fā)抗骨質疏松生物技術方面具有廣闊前景。破骨細胞源性外泌體含有多種關鍵骨調節(jié)蛋白,對骨感覺神經支配具有塑造和引導作用,可調節(jié)成骨細胞骨形成[6]?？梢?研究成骨與破骨細胞來源外泌體的特征以及生物作用對揭示成骨細胞-破骨細胞之間crosstalk機制意義重大[7]。然而,成骨與破骨細胞的培養(yǎng)需要加入胎牛血清,其中含有大量血清外泌體,對目標外泌體提取與分析等實驗結果會產生較大干擾[8]。部分研究在分離外泌體前會選擇短期使用無血清培養(yǎng)基以排除干擾,但會對細胞自身活性以及外泌體產出造成不利影響,因而目前研究主要以去外泌體血清來培養(yǎng)細胞。去外泌體血清制備方法較多,暫無統(tǒng)一標準,因此本文基于MISEV2018選取3種主流方法制備去外泌體血清[9],評估去除效果以及對成骨與破骨細胞生物活性的影響,為進一步獲取合格的成骨、破骨細胞來源外泌體用于骨質疏松癥領域的研究提供方法借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料用于分離原代成骨細胞的新生乳大鼠及分離破骨細胞的12周齡大鼠購買自南京市青龍山動物繁殖場,大鼠飼養(yǎng)溫度18～22 ℃,濕度40%～70%,光照12 h,晝夜交替。實驗動物許可證號:SCXK(浙)2019-0002。DMEM、澳洲胎牛血清、青霉素鏈霉素雙抗、PBS、胰蛋白酶、Ⅱ型膠原蛋白酶購買自美國Gibco公司,TSG101(ab125011)、CD63(ab134045)、CD9(ab236630)、Calnexin(ab133615)抗體購買自美國Abcam公司,去外泌體胎牛血清購買自上海逍鵬生物科技有限公司,堿性磷酸酶染色液購買自上海懋康生物有限公司,茜素紅s染色液購買自北京索萊寶科技有限公司,蘇木精染色試劑盒、BeyoClickTMEdU-555細胞增殖檢測試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購買自上海碧云天生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 去外泌體血清制備根據(jù)外泌體指南MISEV2018選取3種主流方法[9]。方法一:純胎牛血清以100 000×g,4 ℃離心18 h后取75%上清液;方法二:胎牛血清與細胞培養(yǎng)基以1∶4比例混合,以100 000×g,4 ℃離心18 h,取75%上清液;方法三:純胎牛血清超高離心力180 000×g離心3 h,取75%上清液。

1.2.2 納米顆粒測定使用納米顆粒追蹤分析技術(nanoparticle Tracking Analysis,NTA)檢測上述3種方法離心前后血清及商品化去外泌體血清中納米級顆粒濃度變化情況,并據(jù)此選出最佳方法制備去外泌體血清用于后續(xù)實驗。

1.2.3 Western blot檢測外泌體標志蛋白去外泌體血清設為Exo-free組,普通胎牛血清設為對照組。采用Western blot技術檢測兩組的外泌體標志蛋白:以超速離心110 000×g,4 ℃離心6 h提取各組去外泌體血清及市售商品化去外泌體血清中的外泌體,BCA法測定蛋白濃度,以每孔20 μg將5×SDS-PAGE上樣緩沖液和外泌體蛋白樣品以1∶4比例混合,在水浴鍋中加熱煮沸15 min,令蛋白充分變性,冷卻后放入超低溫冰箱備用。制備SDS-PAGE凝膠進行上樣、電泳與轉膜操作。TBST漂洗3次,每次5 min,加入5%脫脂牛奶里,置于搖床振蕩封閉2 h。TSG101、CD63、CD9、Actin抗體孵育過夜,TBST漂洗3次,繼續(xù)加入相應二抗,室溫孵育2 h,上機檢測。

1.2.4 成骨細胞分離將新生乳鼠脫頸處死,置于灌滿75%乙醇燒杯浸泡5 min消毒,分離顱骨置于含有PBS的50 mL離心管內,將離心管于渦旋振蕩儀上振蕩2 min,將混有血絲的PBS棄掉,加入0.25%胰蛋白酶,將顱骨組織剪成約1 mm×1 mm大小的碎塊,放入培養(yǎng)箱內消化30 min。終止消化后離心去除上層消化液,加入0.1%Ⅱ型膠原酶,置于恒溫振蕩箱中消化4 h,終止消化后將懸液過100 μm細胞篩,離心獲得細胞沉淀,重懸。

1.2.5 成骨細胞生物活性檢測去外泌體血清設為Exo-free組,普通胎牛血清設為對照組。具體方法:①第7天時行堿性磷酸酶染色:多聚甲醛固定20 min,按照說明書配制ALP孵育液加入培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)皿放入濕盒中,常溫避光孵育20 min,棄液,漂洗,倒置顯微鏡下觀察拍照;②第21天時行茜素紅+蘇木精染色:多聚甲醛固定20 min,去離子水漂洗,加入茜素紅s染色液,常溫孵育30 min,棄液,再次漂洗,加入蘇木精染色液10 min,棄液漂洗后于倒置顯微鏡下觀察拍照。使用Image J半定量分析比較兩組ALP陽性與礦化結節(jié)區(qū)域面積。

1.2.6 破骨細胞分離與誘導取12周齡大鼠,分離出脛骨與股骨,兩端離斷后用1 mL注射器吸入足量血清,吹出骨髓,加入紅細胞裂解液去除紅細胞,離心棄沉淀獲得單核細胞懸液,置于培養(yǎng)皿中培養(yǎng),隔天半量換液。在確定細胞存活后,加入100 ng/mL RANKL與30 ng/mL M-CSF,每2天換液1次,誘導至第4天或第5天時觀察細胞是否融合。

1.2.7 破骨細胞生物活性檢測①TRAP染色鑒定:多聚甲醛固定10 min,漂洗,加入透膜液,室溫反應5 min,吸棄漂洗,加入說明書推薦比例的TRAP染色液,放于37 ℃培養(yǎng)箱內反應45 min,漂洗后加入蘇木精染色液反應3 min,漂洗后鏡下觀察,使用Image J半定量分析陽性區(qū)域;②骨吸收功能:在骨吸收板中誘導破骨細胞,第5天時吸棄培養(yǎng)液,無菌去離子水漂洗瀝干,置于倒置顯微鏡下觀察,每組100倍鏡下隨機選取3個視野內骨吸收陷窩數(shù)量記錄。

1.2.8 成骨細胞增殖活性檢測EdU法:常規(guī)固定、通透細胞,按照產品說明書配制Click反應液,每孔加入0.5 mL Click反應液,搖晃均勻使之充分接觸,室溫避光下孵育30 min,去離子水漂洗,DAPI染料對細胞核染色5 min,漂洗,置于熒光顯微鏡下觀察,所得圖像使用Image J進行半定量分析。

1.2.9 成骨細胞凋亡檢測吸棄培養(yǎng)液并漂洗,用細胞刮刀將細胞刮下,加入500 μL Binding Buffer與5 μL Annexin V-EGFP混勻后,再加入5 μL Propidium Iodide,4 ℃下避光反應10 min,上機檢測,Ideas軟件分析細胞凋亡率。

2 結 果

2.1 3種超速離心法與商品化去外泌體血清中納米顆粒數(shù)比較NTA結果顯示各組納米顆粒數(shù)分別為方法一:(6.3×108±0.16×108)個/mL;方法二:(5.2×109±1.25×109)個/mL;方法三:(9.10×109±2.08×109)個/mL;商品化去外泌體血清:(1.70×109±0.27×109)個/mL;普通胎牛血清:(9.1×1010)個/mL,單因素方差分析提示以上4組比較具有統(tǒng)計學差異(P<0. 01),其中,方法一去除效果最佳,外泌體清除率約達到99.31%,高于商品化血清的98.14%,SNK-q檢驗提示,方法一的納米顆粒數(shù)明顯低于商品化去外泌體血清,具有顯著統(tǒng)計學差異(P<0. 01),故選取方法一行后續(xù)實驗。

2.2 Western blot檢測胎牛血清去外泌體效果Western blot結果顯示Exo-free組外泌體標志蛋白CD63、CD9、TSG101表達相較于對照組明顯降低,表明方法一的血清外泌體清除效果顯著,見圖1。

圖1 Western blot檢測外泌體標志蛋白表達Figure 1 Western blot of exosome marker protein expression

2.3 去外泌體血清對成骨細胞成熟與礦化的影響第7天兩組均見成骨細胞貼壁生長,形態(tài)不規(guī)則,當細胞量接近90%時呈現(xiàn)“鵝卵石樣”排布,生長狀態(tài)良好;ALP染色后兩組細胞均呈現(xiàn)紫色陽性區(qū)域,提示細胞成熟;第21天兩組細胞均連接成片,形成礦化結節(jié),茜素紅染色后結節(jié)呈紅色。Image J半定量分析表明Exo-free組細胞ALP陽性面積(2 390 229±191 425)、礦化結節(jié)面積(5 723 563±505 532)較對對照組(2 637 895±271 639、6 637 895±181 396)差異無顯著統(tǒng)計學意義(P>0.05),提示去外泌體血清未明顯影響成骨細胞成熟與礦化,見圖2。

a:成骨細胞形態(tài)學觀察;b:ALP染色( ×100);c:茜素紅、蘇木精染色( ×100)圖2 成骨細胞形態(tài)、ALP及茜素紅染色Figure 2 Osteoblast morphology, ALP and alizarin red staining

2.4 去外泌體血清對破骨細胞分化與骨吸收功能的影響對照組用普通胎牛血清培養(yǎng),Exo-free組用方法一去外泌體血清培養(yǎng)。兩組在誘導第5天時均可見細胞明顯融合,TRAP染色結果顯示兩組骨髓單核細胞均可在M-CSF及RANKL的誘導下融合為破骨細胞,Exo-free組融合面積(293 563±15 417)較對照組(304 561±42 250)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。此外,Exo-free組在骨吸收板上形成明顯骨吸收陷窩數(shù)量[(178.7±16.7) 個)]較對照組[(185.7±14.8) 個)] 差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。上述結果表明去外泌體血清并不會影響骨髓單核細胞向破骨細胞的分化與破骨細胞骨吸收功能,見圖3。

a:破骨細胞TRAP染色( ×100);b:骨吸收陷窩( ×100)圖3 破骨細胞TRAP染色、骨吸收陷窩及Image J半定量分析Figure 3 osteoclasts TRAP staining and bone resorption lacunae

2.5 去外泌體血清對成骨細胞增殖的影響EdU結果顯示24 h與48 h的Exo-free組成骨細胞增殖活性均略低于對照組,但兩者差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),提示成骨細胞增殖并未明顯受到去外泌體血清的限制,見圖4。

圖4 EdU法檢測成骨細胞增殖活性Figure 4 Proliferative activity of osteoblasts detected by the EdU method

2.6 去外泌體血清對成骨細胞凋亡的影響使用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒染色成骨細胞后用流式細胞儀進行分析,結果顯示無論48 h或96 h,Exo-free組早期或晚期凋亡率均略高于對照組,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),表明去外泌體血清未明顯改變成骨細胞的凋亡情況。見表1,圖5。

表1 各組成骨細胞早期與晚期凋亡率比較Table 1 Comparison of early and late apoptosis rates of osteoblasts in two groups

圖5 流式細胞儀檢測成骨細胞凋亡結果Figure 5 Flow cytometry results of osteoblast apoptosis

3 討 論

外泌體是細胞間通訊的重要媒介,參與多種正常生理過程和病理進展。外泌體可通過胞吞作用或膜融合內化,將其內容物釋放到受體細胞中[10-11],包括各類蛋白質、糖類、脂類及DNA、mRNA等,這些物質受到限制膜保護,不受細胞外的蛋白酶與核酸酶的影響,使得外泌體在細胞微環(huán)境中穩(wěn)定傳輸生物信息[12]。成骨細胞與破骨細胞之間的信號交流目前有3種已知的機制[13]:①細胞直接接觸,通過細胞膜表面的受體-配體結合,激活細胞內信號通路,完成信息傳遞;②旁分泌機制,分泌水溶性旁分泌因子傳遞細胞信號;③分泌細胞因子沉淀于骨基質中,通過骨基質調節(jié)骨重建。近年來的研究表明,旁分泌機制在維持骨穩(wěn)態(tài)的過程中發(fā)揮了關鍵的作用,成骨細胞與破骨細胞外泌體均參與調節(jié)骨重建過程,因而在骨質疏松癥相關研究中備受關注[7, 14-15]。在骨重建的微環(huán)境中,外泌體可向成骨細胞傳遞特異性蛋白(如Sema4D、tenascin C)、miRNA以及生長因子(如BMP7、TGF/β)以調節(jié)骨形成[4, 16]。外泌體也能向破骨細胞遞送miRNA、RANK以及RANKL等細胞因子調節(jié)骨吸收過程[7, 16-17]。此外,外泌體包裹生物活性分子,可作為骨質疏松癥診斷和預后的生物標志物[18]。同時,相較于干細胞注射治療,外泌體易通過生物屏障,在膜完整的情況下不會引起免疫反應,具備全身特異性遞送的可行性,對開發(fā)骨質疏松癥靶向藥物具有重要意義[19],因此,進一步研究成骨與破骨細胞來源外泌體的生物特性與功能十分必要。

目前一些高質量外泌體研究主要使用去外泌體血清培養(yǎng)細胞[20-22],然而無論是用外泌體分離試劑盒或是超速離心法分離目標細胞外泌體,都需要首先提取細胞上清液,而血清是維持細胞生長的必需品,如直接用含血清細胞上清分離外泌體勢必會導致所得外泌體摻雜大量牛源性外泌體,對后續(xù)實驗結果造成干擾。不僅如此,胎牛血清外泌體對某些細胞功能也存在影響。如血清外泌體能促進乳腺癌細胞的錨定非依賴性生長[23],還能夠誘導A549從生殖表型轉向遷移表性,加重惡化程度[24]。此外,Chang等[25]發(fā)現(xiàn)在臍帶間充質干細胞注射治療骨關節(jié)炎中,使用去外泌體血清培養(yǎng)的臍帶間充質干細胞具有更強的成軟骨能力,并且能夠減少軟骨破壞。雖然去外泌體血清已廣泛用于多種細胞培養(yǎng),但有學者發(fā)現(xiàn)去外泌體血清存在抑制細胞增殖率和分化能力的缺點[26]。因此,研究成骨與破骨細胞來源外泌體的前提是需要選擇最優(yōu)去外泌體血清制備方法并評估對細胞的影響。

本研究通過NTA技術將商品化血清與3種超速離心法所得去外泌體血清比較發(fā)現(xiàn),方法一用純FBS以100 000×g、4 ℃超速離心18 h后取75%上清液獲取的血清樣本去除效果最佳,納米顆粒清除率可達99%以上,外泌體蛋白標志物CD9、CD63與TSG101均明顯下降,佐證了去除效果,此結果與Tian等[8]的外泌體98%清除率一致,并且高于商品化去外泌體血清清除率。市場上存在一部分商品化去外泌體血清,但價格高昂并且可能對一些特定細胞的生長和功能產生不利影響[27],相比之下,方法一制備去外泌體血清具有經濟、簡便、去除效果佳的優(yōu)勢,因而我們用其培養(yǎng)成骨與破骨細胞,進一步分析對細胞增殖分化與生物活性的影響。在成骨細胞實驗中,Exo-free組與對照組的ALP染色、礦化結節(jié)染色結果基本一致。EdU結果提示成骨細胞增殖率略低于對照組,其原因可能是胎牛血清外泌體對成骨細胞增殖具有促進作用[28];流式細胞技術發(fā)現(xiàn)Exo-free組早期與晚期凋亡率均略高于對照組,但上述差異均無顯著統(tǒng)計學差異(P>0.05),表明成骨細胞能夠正常成熟與形成礦化結節(jié),且增殖與凋亡未發(fā)生明顯改變,此結果與去外泌體血清培養(yǎng)脂肪干細胞及胃癌細胞的結果相一致[29]。在破骨細胞部分,骨髓單核巨噬細胞在去外泌體血清培養(yǎng)下經M-CSF與RANKL誘導在第5天可正常融合成破骨細胞,且能在骨吸收板上形成陷窩,Exo-free組在破骨細胞誘導天數(shù)、骨陷窩數(shù)量、TRAP陽性面積與對照組均不存在顯著統(tǒng)計學差異(P>0.05),表明破骨細胞分化與骨吸收功能同樣未受到顯著影響。綜上,方法一所得去外泌體血清不僅外泌體去除效果更好,并且對成骨、破骨細胞的增殖分化與生物活性無明顯影響。因此,我們認為方法一超速離心法經濟高效,可明顯降低后續(xù)實驗干擾,獲得更為純凈的成骨與破骨細胞來源外泌體,有助于從旁分泌機制的角度深入研究骨質疏松癥的發(fā)病機制。

本研究也存在一些局限性,例如有研究報道饑餓培養(yǎng)法能更好排除外泌體污染,但也會造成細胞應激反應[23]。又例如商品化去外泌體血清可能會改變細胞的體內活性及外泌體的效應[27],而我們并未探究超離法去外泌體血清對成骨、破骨細胞外泌體產量、膜完整性與內容物等是否具有影響,未來可進一步運用透射電鏡、高通量測序等手段進一步分析,改進現(xiàn)有方案,為建立系統(tǒng)的成骨、破骨細胞來源外泌體分離和儲存流程提供前期技術支持。