衛(wèi)浩 楊樹軍 王科 孫圣坤

器官移植仍然是大多數(shù)晚期器官衰竭患者唯一可靠的治療方法。等待器官移植的人數(shù)不斷增加，但同種供者極度缺少，異種移植為解決器官短缺、治療器官衰竭提供了可能[1]。隨著CRISPR/Cas9 等相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，經(jīng)過基因改造的供體豬漸漸成為人類可能的器官來源之一[2]。同時，免疫抑制藥的進(jìn)步也在推動移植領(lǐng)域的發(fā)展，但是開發(fā)更安全、有效的免疫抑制藥仍在進(jìn)行中[3]。共刺激信號通路在同種異體移植領(lǐng)域的作用越來越受到重視，因此，本文將綜述目前異種移植中共刺激信號通路的研究現(xiàn)狀及面臨的問題，旨在為異種移植中免疫抑制方案的優(yōu)化提供參考。

1 共刺激信號概述

T 細(xì)胞在調(diào)控針對異體移植物的免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵性作用，而T 細(xì)胞的活化增殖需要兩個信號的協(xié)同刺激[4]：第一信號是T 細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）和抗原提呈細(xì)胞（antigen-presenting cell，APC）上的主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）——抗原肽復(fù)合物，第二信號是共刺激信號，由APC 表面的共刺激分子和T 細(xì)胞表面的相應(yīng)受體相互作用后產(chǎn)生。共刺激分子能根據(jù)T細(xì)胞的生長、活化、分化過程和功能狀態(tài)在合適的時間和位置進(jìn)行表達(dá)，對T 細(xì)胞的分化和功能進(jìn)行正向或負(fù)向調(diào)控。阻斷正向共刺激信號，可以終止T 細(xì)胞活化，防止發(fā)生排斥反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)移植物長期存活和免疫耐受。此外，共刺激分子也可以提供抑制T 細(xì)胞活化、終止免疫應(yīng)答的“共抑制”信號，促進(jìn)激活該途徑的相關(guān)治療方案也可以促進(jìn)移植物的存活和免疫耐受[5-6]。研究者們致力于在移植模型中探究T 細(xì)胞共刺激信號對器官移植排斥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制，有研究表明共刺激信號可以作為誘導(dǎo)移植免疫耐受的靶點[7-8]。

2 共刺激信號通路與異種移植

CD28/細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞抗原（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen，CTLA）-4/B7 和CD40/CD40L 通路被認(rèn)為是主要的共刺激信號通路，與T 細(xì)胞和B 細(xì)胞的激活有關(guān)。筆者總結(jié)的目前異種移植中相關(guān)共刺激信號通路見圖1。

圖1 異種移植中的相關(guān)共刺激信號通路示意圖Figure 1 Schematic diagram of relevant costimulatory signaling pathways in xenotransplantation

2.1 CD28/CTLA-4/B7 通路

CD28 作為最早被發(fā)現(xiàn)的共刺激分子之一，它的阻斷已經(jīng)成為促進(jìn)移植免疫耐受治療策略發(fā)展的主要目標(biāo)之一[9]。CD28 表達(dá)在所有小鼠幼稚T 細(xì)胞表面以及人類約80%的CD4+T 細(xì)胞和50%的CD8+T 細(xì)胞上[10]。CD28 必須結(jié)合其配體CD80（B7-1）和CD86（B7-2）才能誘導(dǎo)T 細(xì)胞活化、增殖和存活，多種抗CD28 抗體已被研發(fā)。一些傳統(tǒng)的抗CD28 抗體已被證明可以有效地延長動物移植模型中的移植物存活時間，但仍殘留一些激動劑的特性?？笴D28 抗體在小鼠中可抑制皮膚移植排斥反應(yīng)[11]，抗CD28 抗體FR104 與他克莫司、嗎替麥考酚酯或西羅莫司（雷帕霉素）聯(lián)用，可以防止非人靈長類動物同種腎移植中的排斥反應(yīng)[12]。選擇性CD28 阻斷劑是一種很有潛力的替代藥物，可直接與CD28 結(jié)合而不阻礙CTLA-4介導(dǎo)的正常免疫抑制信號。如抗CD28 單克隆抗體不僅保留了CTLA-4 依賴的免疫調(diào)節(jié)能力，還可抑制心臟移植和腎移植排斥反應(yīng)[13]。但是選擇性CD28 阻斷劑在異種移植中的作用有待進(jìn)一步研究。

CTLA-4 是CD28/CTLA-4/B7 通路中另一個重要的免疫調(diào)節(jié)分子[14-16]。CTLA-4 與CD28 具有同源性，這使與該通路有關(guān)的受體-配體相互作用更加復(fù)雜，如相互競爭配體CD80 和CD86[17-18]。與CD28和CD80/86 相比，CTLA-4 在T 細(xì)胞中的延遲表達(dá)及其更多的相互作用導(dǎo)致了其對T 細(xì)胞激活的調(diào)控作用，降低了活化的T 細(xì)胞數(shù)量和能力，同時保留了CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的發(fā)育和功能[18]。

CTLA-4-免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）由CTLA-4 的胞外結(jié)構(gòu)域與人IgG1 的Fc 區(qū)融合而成[19]。由于CTLA-4 與B7 分子的結(jié)合親和力遠(yuǎn)高于CD28，人們研發(fā)了CTLA-4-Ig，并將其作為CD28/B7 相互作用的競爭性抑制劑。美國食品與藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)第一代CTLA-4-Ig 阿巴西普（abatacept）用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和銀屑病[20-21]，但其抑制B7-2（CD86）的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如內(nèi)源性CTLA-4，導(dǎo)致體內(nèi)B7 介導(dǎo)的T 細(xì)胞活化不完全阻斷。在非人靈長類動物移植研究中，阿巴西普在延長同種異體移植物存活率方面效果不佳[22]。另一種CTLA-4 融合蛋白貝拉西普（belatacept）也因此被研發(fā)出來，它與阿巴西普的不同之處在于其配體結(jié)合域被兩個氨基酸取代，與B7-1（CD80）和B7-2（CD86）的結(jié)合更強(qiáng)，從而產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫抑制作用[19]。貝拉西普于2011 年6 月獲得FDA 批準(zhǔn)，同年4 月獲得歐洲藥品管理局批準(zhǔn)，在腎移植中可代替鈣調(diào)磷酸酶抑制劑[23]。與同種腎移植相比，貝拉西普在異種腎移植中的治療效果并未達(dá)到預(yù)期。非人靈長類動物異種腎移植實驗中，接受貝拉西普治療的受體在移植術(shù)后早期（2～3 周）發(fā)生了排斥反應(yīng)，組織學(xué)表現(xiàn)為抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)和細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)[24]。利用基因改造技術(shù)使供體豬產(chǎn)生CTLA-4-Ig 的效果也沒有達(dá)到預(yù)期，可能因為CTLA-4-Ig 在供體豬體內(nèi)產(chǎn)生過于廣泛，抑制了供體豬的自身免疫，導(dǎo)致其生長過程中感染的發(fā)生率較高，影響供體生存[25]。

2.2 CD40/CD40L 通路

CD40 是腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor，TNFR）超家族成員，也稱為TNFRSF5，主要由Ⅰ型跨膜蛋白組成，結(jié)構(gòu)相對保守，在B 細(xì)胞、單核細(xì)胞、血小板和巨噬細(xì)胞以及非造血細(xì)胞如肌成纖維細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)[26]。誘導(dǎo)CD40 可以刺激APC 介導(dǎo)的促炎因子和趨化因子的釋放。CD40 也會誘導(dǎo)CD80 和CD86 的上調(diào)，從而有助于CD28 介導(dǎo)的T 細(xì)胞活化與分化。此外，當(dāng)與T 細(xì)胞上的CD40L（CD154）連接時，B 細(xì)胞上的CD40 信號促進(jìn)其增殖、Ig 產(chǎn)生、同型轉(zhuǎn)換和記憶B 細(xì)胞生成[27]。與CD40 一樣，CD154 也是TNFR 超家族成員，以生物活性的可溶性形式存在，由蛋白水解裂解產(chǎn)生。CD154 主要在活化的T 細(xì)胞、B 細(xì)胞和血小板上表達(dá)，在單核細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞上也可誘導(dǎo)其表達(dá)。

CD40/CD40L 通路在T 細(xì)胞介導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的激活以及T 細(xì)胞依賴的體液免疫應(yīng)答中起著至關(guān)重要的作用[28-29]。抑制CD40/CD40L 之間的相互作用將抑制B 細(xì)胞和APC 激活以及隨后的T 細(xì)胞活化與分化[30]。在實體器官移植的臨床前模型中對CD40/CD40L 通路的阻斷證實了這一觀點，阻斷CD40/CD154 通路將會延長同種異體移植物的存活時間[31]。相反，刺激CD40/CD154 通路可能有利于腫瘤免疫治療[32]。阻斷CD40/CD154 通路已經(jīng)證明了其在豬到非人靈長類動物移植臨床前模型中延長異種移植物無排斥反應(yīng)存活時間的潛力[33]。

2000 年，Bühler 等[34]在豬到狒狒的造血祖細(xì)胞移植模型中，證實了基于環(huán)孢素的常規(guī)免疫抑制治療不能抑制機(jī)體對移植物的免疫排斥反應(yīng)，需要應(yīng)用共刺激阻斷劑抗CD154 單克隆抗體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)T 細(xì)胞共刺激阻斷可能促進(jìn)移植受體對豬器官和組織的免疫耐受。Mohiuddin 等[35]在異種心臟移植中使用抗CD40 單克隆抗體3A8 和2C10R4，同樣阻斷了共刺激通路，受體存活時間分別為27 d 和146 d。在基因編輯豬到非人靈長類的心臟、腎臟、角膜和胰島移植實驗中也證實了阻斷CD40/CD154 通路在免疫抑制治療中的有效性[36-40]。阻斷CD40/CD154 共刺激通路，聯(lián)合使用雷帕霉素（或霉酚酸酯）和糖皮質(zhì)激素等作為維持治療，延長了異種心臟、腎臟等器官移植的術(shù)后存活時間[41-43]。將基因編輯豬腎移植到狒狒體內(nèi)，經(jīng)過早期的免疫誘導(dǎo)治療后，維持治療階段僅給予抗CD40 單克隆抗體和促紅細(xì)胞生成素，受體存活數(shù)月，Cooper 等[44]認(rèn)為單獨阻斷CD40/CD154 共刺激通路就足以作為異種器官移植中的維持治療。需要指出的是，共刺激藥物并不能替代異種移植早期抗胸腺細(xì)胞球蛋白和抗CD20 單克隆抗體（利妥昔單抗）等免疫抑制藥的應(yīng)用[42]。

目前已知CD154 不僅在T、B 細(xì)胞上表達(dá)，而且也在活化的血小板上表達(dá)，阻斷CD40L 可導(dǎo)致受體出現(xiàn)血栓栓塞[45-46]。在非人靈長類動物的臨床前研究中，HU5C8 和ABI793 這兩種抗CD40L 單克隆抗體已經(jīng)在非人靈長類動物的臨床前研究中發(fā)現(xiàn)了血栓形成[27,47]。此外，治療狼瘡和腎移植排斥反應(yīng)的Ⅱ期臨床試驗中，同樣觀察到HU5C8 可導(dǎo)致血栓栓塞性并發(fā)癥[27]。雖然可以同時使用非甾體抗炎藥來預(yù)防血栓形成，但這類抗CD40L 單克隆抗體的臨床應(yīng)用還是受到影響。目前認(rèn)為血栓形成與抗CD154 抗體的Fc 段有關(guān)[48-49]。最近，新型抗CD154 抗體TNX-1500 可避免這些不良反應(yīng)，TNX-1500 是通過設(shè)計Fc段，減少了與Fc-γ 受體Ⅱa 的結(jié)合。在非人靈長類同種腎移植模型中，給予TNX-1500 可以有效阻斷CD40/CD154 通路，顯著延長同種異體移植物的存活時間，而無血栓栓塞性事件發(fā)生[50]。在異種移植中，TNX-1500 也發(fā)揮了較好的作用，受體長期存活[51]。研發(fā)不會引起血栓的抗CD154 抗體對于異種移植的發(fā)展十分重要，自2000 年以來，幾乎所有成功的異種移植免疫抑制方案都是以阻斷CD40/CD154 共刺激信號通路為基礎(chǔ)的，包括ch5D12、3A8、Chi220 和2C10R4 等。不過越來越多的臨床前證據(jù)表明，在異種移植中，抗CD154 抗體在延長移植物存活時間方面優(yōu)于抗CD40 抗體[52]。

共刺激阻斷藥物在豬到非人靈長類動物的異種移植實驗中取得良好的效果，受體移植術(shù)后存活時間遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過6 個月，達(dá)到了臨床異種移植試驗的規(guī)定時間門檻，臨床異種移植也因此得以積極開展。2022 年1 月Griffith 等[53]在美國馬里蘭大學(xué)醫(yī)學(xué)中心為1 例57 歲的終末期心臟病患者實施了世界首例基因編輯豬-人心臟移植，免疫抑制方案包括使用新型人源化單克隆抗體（KPL-404），用于阻斷CD40 共刺激通路，患者術(shù)后存活59 d。臨床異種腎移植也在積極開展，2021 年，美國阿拉巴馬大學(xué)和紐約大學(xué)朗格尼移植研究所的兩支研究團(tuán)隊分別開展了臨床級異種腎移植試驗，前者將經(jīng)過基因編輯的豬腎臟植入1 例腦死亡男性體內(nèi)，在74 h 內(nèi)，移植的豬腎臟保持活力并產(chǎn)生尿液，沒有明顯的超急性排斥反應(yīng)，后者則是進(jìn)行2 例豬-人異種腎移植，將經(jīng)過基因編輯的豬腎臟與1 例腦死亡供者在體外相連，試驗進(jìn)行了54 h，并且未顯示超急性排斥反應(yīng)或抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)[54-55]。2023 年，美國阿拉巴馬大學(xué)團(tuán)隊證實基因編輯豬的腎臟移植到腦死亡患者體內(nèi)可以正常發(fā)揮腎功能至少1 周，維持患者的基本生命體征[56]。截止至目前，由于FDA 尚未批準(zhǔn)抗CD40 單克隆抗體和抗CD154 單克隆抗體在人體的使用，因此上述異種腎移植臨床試驗暫未使用這兩種抗體。雖然異種移植中的共刺激阻斷免疫療法主要在豬到非人靈長類動物移植模型中使用，不過依舊可以看到共刺激通路阻斷在豬到人異種移植中的巨大潛力。

3 小結(jié)與展望

綜上所述，共刺激阻斷劑在異種腎移植中的作用十分關(guān)鍵且或?qū)⒃谖磥砼R床試驗中使用。目前解決異種移植模型中排斥反應(yīng)的方案包括共刺激阻斷劑和抗CD20 抗體、嗎替麥考酚酯等藥物聯(lián)合使用。有許多新的藥物通過阻斷CD40/CD154 通路延長了異種移植物在受體體內(nèi)的存活時間。短期內(nèi)的臨床前研究和較少的臨床試驗并不足以表明共刺激阻斷劑在臨床異種移植中的可靠性，抗CD154 抗體及抗CD40 抗體的效果仍需要驗證。因此，對新的共刺激或共抑制靶點的研究，以及對臨床異種移植中更可靠的共刺激藥物的研發(fā)可能會成為未來研究的熱點方向。