陳建春 思永玉 李元 李福全 蔣俊

心臟驟停(cardiac arrests,CA)屬于高發(fā)病率疾病[1],盡管心肺復(fù)蘇(cardiopulmonary resuscitation,CPR)技術(shù)和復(fù)蘇后護(hù)理在一定程度上提高了患者生存機(jī)會(huì),但腦損傷導(dǎo)致患者在恢復(fù)自然循環(huán)后仍有很高的死亡和殘疾率[2,3]。心肌功能障礙導(dǎo)致的低心排血量加重了器官功能障礙,并降低了心臟驟停幸存者的長(zhǎng)期神經(jīng)預(yù)后[4,5]。CA幸存者的后遺癥,包括缺氧腦損傷、心肌功能障礙和全身性缺血/再灌注反應(yīng),這被描述為心臟驟停后綜合征(PCA),在PCA的發(fā)展過(guò)程中,全身性缺血/再灌注反應(yīng)可引發(fā)全身性炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),這是其典型病理過(guò)程,并導(dǎo)致多器官功能障礙性疾病(MODS)的形成。這一過(guò)程類(lèi)似于全身炎性反應(yīng)綜合征(SIRS),因?yàn)榇傺滓蜃尤缒[瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)可被視為PCA的損傷生物標(biāo)志物[6]。核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB亞單位p65的激活導(dǎo)致炎性細(xì)胞增加其促炎因子的表達(dá)和合成[7, 8],在許多Toll樣受體(TLR)信號(hào)通路中,TLR4的激活被認(rèn)為是有害的,因?yàn)樗鼘?duì)炎癥信號(hào)通路有影響[9]。Gui等[10]證明,TLR4/NF-κB途徑的下調(diào)減少了心肌梗死的大小并改善了心臟功能。在本研究中,我們旨在探究烏司他丁對(duì)心肺復(fù)蘇大鼠的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 從查士利華醫(yī)藥技術(shù)(上海)有限公司[動(dòng)物許可SYXK(滬)2022-0001]獲得18只SPF級(jí)雄性Wistar大鼠,體重360～380 g,年齡12周。將動(dòng)物圈養(yǎng)在恒溫(23±1)℃環(huán)境中,光照/黑暗周期為12 h,自由進(jìn)食和飲水。

1.2 血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè) 大鼠(12周齡)通過(guò)腹腔注射戊巴比妥(30 mg/kg)進(jìn)行麻醉[21, 22]。用PE 200導(dǎo)管(angiocath,becton dickinson)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行氣管插管,并進(jìn)行機(jī)械通氣(Flexivent EC-VF-2,Scireq Scientific Respiratory Equipment Inc)。呼吸機(jī)設(shè)置:潮氣量0.8 ml/100 g,呼吸頻率90次/min, FiO2為1.0。通過(guò)右股動(dòng)脈插入一個(gè)充滿0.9%氯化鈉溶液的PE-50管來(lái)測(cè)量動(dòng)脈血壓。為了測(cè)量左心室壓力,通過(guò)右頸動(dòng)脈插入另一根充滿0.9%氯化鈉溶液的PE-50管,并推進(jìn)到左心室,進(jìn)行超聲心動(dòng)圖和左心室壓力波形檢測(cè)。液體和藥物通過(guò)右頸靜脈途徑給藥?；赑C數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)(ADI Instruments, Inc.)記錄血液動(dòng)力學(xué)參數(shù)。每小時(shí)測(cè)量1次血流動(dòng)力學(xué)參數(shù),并在心臟驟停前至自主循環(huán)恢復(fù)(ROSC)后第4小時(shí)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。使用Philips Sonos 5500彩色多普勒超聲心動(dòng)圖(Philips, Andover, MA, USA)測(cè)定左心室(LV)射血分?jǐn)?shù)(EF)。左心室收縮功能用左心室壓力為40 mm Hg時(shí)的dp/dt(dp/dt40)來(lái)表示。用于檢測(cè)血液溫度的熱導(dǎo)管通過(guò)左股動(dòng)脈放置,并通過(guò)固定長(zhǎng)度法推進(jìn)到胸主動(dòng)脈。用熱稀釋法測(cè)量心輸出量,然后用Cardio-Max Ⅱ系統(tǒng)(Columbus Instrument, Columbus, OH, USA)進(jìn)行分析。

1.3 窒息致心臟驟停動(dòng)物模型及研究設(shè)計(jì) 通過(guò)關(guān)閉呼吸機(jī)和夾住氣管內(nèi)導(dǎo)管誘發(fā)窒息的心臟停搏。窒息后不久出現(xiàn)心動(dòng)過(guò)緩和低血壓,隨后出現(xiàn)收縮期心律,血壓無(wú)法測(cè)量。心臟驟停被定義為平均股動(dòng)脈壓力<10 mm Hg。在9.5 min的窒息引起的心臟驟停后,72 h的存活率為50%[23]。窒息9.5 min后,通過(guò)靜脈注射腎上腺素(0.01 mg/100 g),并由同一研究人員對(duì)所有動(dòng)物以200次/min的速度用食指進(jìn)行胸部按壓以實(shí)施心肺復(fù)蘇。對(duì)胸外按壓進(jìn)行調(diào)整以提供監(jiān)測(cè)中看到的統(tǒng)一速率,并在復(fù)蘇過(guò)程中提供>20 mm Hg的目標(biāo)主動(dòng)脈舒張壓。通常在3 min內(nèi)達(dá)到ROSC,如果6 min內(nèi)不能獲得ROSC,則排除動(dòng)物。這是一項(xiàng)隨機(jī)的動(dòng)物研究,以調(diào)查UTI治療的效果(每組n=6,總n=18)。UTI治療組在ROSC后以100 mg/kg UTI (tianpu biochemistry and medicine corporation, Sichuan, China)靜脈注射[24]。對(duì)照組以等量的普通0.9%氯化鈉溶液輸注。在治療期間,體溫保持在36.5℃。

1.4 存活率 在有創(chuàng)監(jiān)測(cè)4 h后,從所有動(dòng)物身上拔出導(dǎo)管和氣管插管。動(dòng)物在拔管后1 h內(nèi)接受了1 ml 0.9%氯化鈉溶液的腹腔注射,并被送回籠子。每隔12 h對(duì)所有大鼠的健康狀況進(jìn)行仔細(xì)監(jiān)測(cè),記錄生存狀況,通過(guò)喪失自主呼吸運(yùn)動(dòng)和超過(guò)2 min無(wú)心跳來(lái)確認(rèn)死亡。對(duì)不同組間的存活率進(jìn)行比較。如果動(dòng)物達(dá)到人道的終點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn),包括體重與基線相比低于20%或持續(xù)發(fā)作超過(guò)10 min,立即實(shí)施安樂(lè)死。所有的動(dòng)物都在達(dá)到安樂(lè)死的標(biāo)準(zhǔn)之前死亡,因?yàn)樵谛呐K驟停和復(fù)蘇的實(shí)驗(yàn)中,動(dòng)物通常會(huì)突然死亡。

1.5 動(dòng)物分組 大鼠被隨機(jī)分配為3組:(1)sham組(n=6);(2)control組(心肺復(fù)蘇組,n=6);(3)UTI組(心肺復(fù)蘇聯(lián)合烏司他丁治療組,n=6)。根據(jù)組別設(shè)計(jì),每只大鼠的尾巴上都有不同顏色的標(biāo)記,籠子上標(biāo)有組別名稱。sham組大鼠經(jīng)歷了除心臟驟停和心肺復(fù)蘇以外的所有操作程序。UTI組進(jìn)行心肺復(fù)蘇,在恢復(fù)自發(fā)循環(huán)后,接受靜脈注射烏司他丁,control組的大鼠分別相同體積的鹽水。

1.6 神經(jīng)系統(tǒng)缺損的評(píng)估

1.6.1 神經(jīng)系統(tǒng)檢查:由對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)保密的調(diào)查員進(jìn)行的,使用的是神經(jīng)系統(tǒng)缺損評(píng)分(neurological deficit score, NDS),其范圍80(最佳)～0(腦死亡),包括一般行為缺損的子評(píng)分:意識(shí)正常、昏迷或無(wú)反應(yīng),睜眼喚醒和呼吸正常、異常(通氣不足或過(guò)度)或沒(méi)有呼吸。存活大鼠的NDS在心臟驟停/心肺復(fù)蘇(CA/CPR)后24、48和72 h被評(píng)估。

1.6.2 腦干功能評(píng)估:①嗅覺(jué):對(duì)食物氣味的反應(yīng);②視覺(jué):頭部對(duì)光的運(yùn)動(dòng);③瞳孔光反射;④角膜反射;⑤驚嚇?lè)瓷?⑥對(duì)胡須刺激的反應(yīng);⑦對(duì)液體或固體的吞咽。

1.6.3 運(yùn)動(dòng)評(píng)估的子分?jǐn)?shù):包括力量測(cè)試正常、異常(僵硬或無(wú)力)和沒(méi)有運(yùn)動(dòng)。運(yùn)動(dòng)行為子得分是根據(jù)步態(tài)協(xié)調(diào)來(lái)評(píng)估的,分為正常、異?；驘o(wú)。如果大鼠能穿過(guò)離地面0.5 m高的2 cm寬和1 m長(zhǎng)的橫梁,則判斷其在橫梁上的平衡是正常的;如果大鼠嘗試過(guò)但沒(méi)有繼續(xù),或暫時(shí)停留而跌倒,則判斷為異常。如果大鼠放在橫梁上后立即掉下來(lái),則評(píng)估結(jié)果為無(wú)。

1.6.4 感覺(jué)評(píng)估的子分?jǐn)?shù):包括對(duì)肢體擠壓的反應(yīng)為輕快的退出、弱或異常的反應(yīng)(伸展或彎曲的姿勢(shì))和無(wú)反應(yīng)。

1.6.5 其他評(píng)估的行為反射分值:①扶正反射(動(dòng)物仰臥,并能糾正到直立位置);②轉(zhuǎn)彎小巷(使動(dòng)物在15 cm×0.5 m的小巷盡頭行走并轉(zhuǎn)回);③視覺(jué)放置(動(dòng)物被抬起,并能在視覺(jué)上確定物體和深度);④負(fù)地軸(將動(dòng)物仰臥在傾斜45°的平面上,動(dòng)物能自我糾正并在斜面向上移動(dòng))。最后一個(gè)分項(xiàng)評(píng)估了癲癇發(fā)作(抽搐或非抽搐)的發(fā)生情況。

1.7 轉(zhuǎn)棒疲勞實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)棒疲勞實(shí)驗(yàn)評(píng)估大鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)和平衡能力。它包括適應(yīng)性訓(xùn)練和測(cè)試過(guò)程。在CA手術(shù)前,每組大鼠都要連續(xù)訓(xùn)練3 d。旋轉(zhuǎn)棒疲勞計(jì)被設(shè)置為4 r/min。動(dòng)物每天訓(xùn)練3次,每次至少15 min,2次訓(xùn)練的間隔時(shí)間至少15 min。最后的測(cè)試在ROSC后5 d進(jìn)行。將所有存活的大鼠單獨(dú)放在旋轉(zhuǎn)桿上,在260 s內(nèi)將旋轉(zhuǎn)速度從4 r/min提高到40 r/min,并記錄大鼠從開(kāi)始到跌倒的時(shí)間。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,最后以摔倒前的平均時(shí)間作為結(jié)果。

1.8 血清炎性因子水平 ROSC 48 h后采集眶后血樣(0.8～1.2 ml),通過(guò)12 000 g離心10 min分離血清,儲(chǔ)存在-80℃直至分析。使用商用ELISA試劑盒(R&D system)分析IL-1β、TNF-α、IL-6的水平。

1.9 Western blotting ROSC后第5天,解剖雙側(cè)前額葉皮層,將左側(cè)皮層組織勻漿用于Western blotting。使用裂解緩沖液(Thermo Scientific,Rockford,IL,USA)制備總蛋白裂解物,所述裂解緩沖液含有蛋白酶抑制劑混合物(Sigma-Aldrich)和磷酸酯磷酸酶抑制劑混合物(Roche,Nutley,NJ,USA)。BCA分析試劑盒(Thermo Fisher Scientific,USA)用于測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。通過(guò)SDS-PAGE分離每個(gè)泳道包含20 μg總蛋白的樣品,然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下用5%脫脂牛奶封閉膜約1 h,并在4℃下與下列初級(jí)抗體一起孵育過(guò)夜:兔多克隆抗TLR-4抗體(1∶1 000;Abcam,USA);兔多克隆抗p65抗體(1∶1 000,Abcam,USA);兔多克隆抗p-p65抗體(1∶1 000,Abcam,USA);GAPDH (1∶5 000; Abcam,USA)。在與第二抗體孵育后,使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑(Pierce,IL,USA)顯現(xiàn)免疫反應(yīng)條帶,并使用GeneSnap軟件7.08版可視化。使用Image J軟件對(duì)蛋白量進(jìn)行定量,并根據(jù)同一樣品中GAPDH的密度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

2 結(jié)果

2.1 烏司他丁治療提高大鼠存活率,改善心臟驟停后的心功能 sham組的6只大鼠全部存活,control組和UTI組大鼠的存活率分別為50%和66.7%,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.2432)。誘導(dǎo)心臟驟停前(Pre-PR)和ROSC時(shí)的血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)在3組間無(wú)顯著差異。與control組比較,UTI組在ROSC后1～4 h內(nèi)的左心室射血分?jǐn)?shù)上升。搶救后第1小時(shí),UTI組心率較低,然而2組心率在搶救后的整個(gè)時(shí)期內(nèi)無(wú)差異,以dp/dt40表示的左心室收縮功能在心臟驟停和復(fù)蘇后2組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 3組左心室射血分?jǐn)?shù)、心率和左心室收縮功能比較 n=6,

2.2 烏司他丁改善心肺復(fù)蘇后大鼠神經(jīng)認(rèn)知功能、運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)和平衡 在sham組,NDS評(píng)分在所有時(shí)間點(diǎn)都接近80分。CA后,對(duì)照組的神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯低于sham組,UTI治療顯著減輕了神經(jīng)功能缺損評(píng)分。CA/CPR后,control組存活的大鼠平均速度,大鼠行走總時(shí)間,大鼠下落時(shí)轉(zhuǎn)棒速度和總行走距離,而UTI的應(yīng)用有效地減弱了CA/CPR帶來(lái)的神經(jīng)系統(tǒng)損傷及運(yùn)動(dòng)失調(diào)(P<0.01)。見(jiàn)表2、3。

表2 在ROSC后24、48和72小時(shí)評(píng)估的神經(jīng)功能缺損評(píng)分 n=6,分,

表3 烏司他丁改善運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)和平衡 n=6,

2.3 烏司他丁降低心臟驟停/心肺復(fù)蘇后促炎因子的表達(dá) 與sham組比較,心肺復(fù)蘇后2 h,血清IL-1β、TNF-α、IL-6的水平顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。然而,復(fù)蘇后應(yīng)用烏司他丁減少了IL-1β、TNF-α、IL-6的產(chǎn)生,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表4。

表4 3組大鼠血清IL-1β、TNF-α和IL-6水平比較 n=6,

2.4 烏司他丁抑制TLR4/NF-κB通路活性 Western blotting結(jié)果顯示,與sham組比較,control組TLR4蛋白表達(dá)及p-p65/p65表達(dá)水平顯著上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而在施用烏司他丁后,TLR4蛋白及p-p65/p65表達(dá)水平顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表5,圖1。

圖1 烏司他丁抑制TLR4/NF-κB通路活性

表5 Western blotting檢測(cè)ROSC第5天后大鼠大腦皮層TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平 n=6,

3 討論

CA/CPR誘導(dǎo)全身缺血再灌注(I/R)損傷,激活免疫系統(tǒng),引起全身炎性反應(yīng)。在CA/CPR過(guò)程中,白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和組織常駐免疫細(xì)胞識(shí)別損傷并釋放主要細(xì)胞因子,進(jìn)而誘導(dǎo)白細(xì)胞的募集和活化,放大炎性反應(yīng)[25]。作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的重要常駐免疫細(xì)胞,小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)各種細(xì)胞因子受體,識(shí)別IL-1β和TNF-α等。因此,小膠質(zhì)細(xì)胞在I/R損傷后會(huì)過(guò)度活化,釋放過(guò)量的促炎細(xì)胞因子,損害神經(jīng)功能[26]。炎癥對(duì)于CA/CPR后神經(jīng)功能缺損的發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要[27, 28]。IL-6是另一種眾所周知的細(xì)胞因子,它在腦缺血后被上調(diào),IL-6的血清水平與腦梗死體積相關(guān),并且是早期神經(jīng)惡化的有力預(yù)測(cè)因子[29]。

烏司他丁(ulinastatin)于20世紀(jì)80年代首次在人類(lèi)血液、尿液和其他組織中發(fā)現(xiàn)[10],對(duì)多種蛋白酶有抑制作用[11],已經(jīng)顯示出對(duì)大腦缺血-再灌注損傷的器官保護(hù)作用[12]。烏司他丁通過(guò)抑制JNK/NF-kappaB信號(hào)通路和PI3K/Akt/Nrf2通路來(lái)減輕炎癥和抵抗氧化應(yīng)激[13,14]。此外,烏司他丁可以通過(guò)激活Nrf-2/HO-1信號(hào)通路,對(duì)緩解腦缺血再灌注損傷提供一定程度的保護(hù),并可能通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路改善心肌缺血再灌注損傷[15,16]。此外,作為一種天然的抗炎分子,烏司他丁在內(nèi)鏡逆行胰腺造影術(shù)后胰腺炎的藥物預(yù)防和嚴(yán)重減壓病的治療,甚至在SARS-CoV-2感染的治療中都有很好的前景[17-19]。在亞洲地區(qū),UTI被用作治療急性炎癥性疾病的基本藥物,包括胰腺炎、敗血癥和休克[20]。

一些研究者分析了烏司他丁在心肌缺血再灌注損傷(MIRI)的保護(hù)作用機(jī)制,Kawamura等[30]報(bào)道,UTI通過(guò)抑制IL-8和IL-6的釋放,在與體外循環(huán)心內(nèi)直視手術(shù)相關(guān)的MIRI中發(fā)揮心臟保護(hù)作用。Yang等[30]提出,烏司他丁可以通過(guò)下調(diào)TNF-α的表達(dá)和抑制由c-Jun N-末端激酶(JNK)和P38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路誘導(dǎo)的MIRI來(lái)保護(hù)心臟功能。本研究發(fā)現(xiàn)心肺復(fù)蘇組ROSC后血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高,而烏司他丁治療減弱了促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的升高,改善了神經(jīng)功能預(yù)后。并且,轉(zhuǎn)棒疲勞實(shí)驗(yàn)顯示烏司他丁有效改善心臟驟停/心肺復(fù)蘇后大鼠神經(jīng)認(rèn)知功能、運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)和平衡。TLR4作為一種模式識(shí)別受體,參與I/R損傷誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)[31],TLR4缺陷型小鼠在心肌I/R損傷后經(jīng)歷了心肌梗死面積的減小,這是由炎性信號(hào)通路活性的降低介導(dǎo)的,如多形核嗜中性粒細(xì)胞的積聚和氧化應(yīng)激的激活[32]。NF-κB是一個(gè)重要的促炎癥轉(zhuǎn)錄因子[33],TLR4的激活與促炎癥細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)的表達(dá)以及幾種細(xì)胞類(lèi)型中NF-κB信號(hào)途徑的激活有關(guān)[34, 35]。在本研究中,與sham組相比,control組TLR4/NF-κB信號(hào)通路活性被激活,而在施用烏司他丁治療后,大鼠大腦皮層TLR4、p-p65/p65水平顯著下降,表明TLR4/NF-κB通路活性被抑制。

我們的研究有一些局限性。首先,這項(xiàng)研究是在沒(méi)有任何與心臟驟停相關(guān)的潛在疾病的動(dòng)物中進(jìn)行的;第二,可處理的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量有限。在未來(lái)的研究中,我們將在更大樣本量的動(dòng)物中對(duì)該機(jī)制進(jìn)行驗(yàn)證。