冷雨 李清山 何克 李善武

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是臨床常見的慢性退行性關(guān)節(jié)疾病,患者表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生退行性病變、纖維化、斷裂、缺損或者整個(gè)關(guān)節(jié)面的損傷[1,2]。現(xiàn)階段,OA是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致患者殘疾的主要疾病原因之一,且OA的發(fā)病率正在逐年攀升,顯著影響了患者的身體健康和生活質(zhì)量[3]。目前臨床治療OA主要依靠止痛藥或物理治療,但這些藥物的療效有限,且無法根治[4]。因此,尋找治療OA安全有效的治療藥物,對提高患者的生活質(zhì)量具有重要意義。瑞香素(Daphnetin,DAP)作為一種中藥,是香豆素的衍生物,藥理學(xué)研究表明DAP具有抗炎、抗腫瘤、抗凝、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)等藥理作用[5,6]。但關(guān)于DAP對OA患者關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的自噬和凋亡的影響還尚未有相關(guān)報(bào)道。自噬是細(xì)胞通過溶酶體途徑降解和清除體內(nèi)物質(zhì)的重要生物學(xué)過程,其廣泛存在于細(xì)胞的生長、增殖、分化、代謝等生理病理過程中,也與一些退行性疾病如OA等息息相關(guān)[7]。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路是自噬相關(guān)的信號通路之一,研究發(fā)現(xiàn)活化的AMPK可以激活A(yù)MPK/mTOR信號通路,從而激活細(xì)胞自噬[8]。本研究以大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞為研究對象,探究DAP對白介素-1β(interleukin,IL-1β)誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞購自寧波明舟生物科技有限公司。

1.2 主要試劑 DAP(純度≥98%)購自上海源葉生物科技有限公司;IL-1β、AMPK抑制劑Compound C購自美國Sigma公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司;胰蛋白酶購自上海鈺博生物科技有限公司;CCK-8試劑盒購自江蘇弘麒生物科技有限公司;Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司;Transwell小室購自Corning公司;Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京天根生化科技有限公司;BCA蛋白定量檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司;p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR、Bcl-2、Bax、Beclin-1、LC3、GAPDH一抗和相應(yīng)二抗購自美國Abcam公司。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所;單丹磺酰戊二胺(MDC)試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)在含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,在37℃、5%CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。每2～3天更換1次新鮮培養(yǎng)基。傳代3次后取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞分組與處理 取對數(shù)生長期的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞以1×104個(gè)/孔的密度接種于96孔板中,待細(xì)胞貼壁后隨機(jī)分為對照組(Control組,空白培養(yǎng)基處理)、模型組(Model組,10 ng/ml IL-1β[9])、低濃度DAP組(DAP-L組,30 mg/L DAP)、高濃度DAP組(DAP-H組,60 mg/L DAP[10])、高濃度DAP+AMPK抑制劑Compound C組(DAP-H+CC組,60 mg/L DAP+10 μmol/L CC[11])。其中DAP-L組、DAP-H組與DAP-H+CC組均需先加入IL-1β進(jìn)行預(yù)處理。分組后加入相應(yīng)濃度藥物進(jìn)行處理。

1.5 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性 取對數(shù)生長期的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞以1×104個(gè)/孔的密度接種于96孔板中,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔,按照1.4進(jìn)行相應(yīng)分組與處理。繼續(xù)置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h,在各時(shí)間點(diǎn)棄去培養(yǎng)基,PBS洗滌后分別加入CCK-8試劑10 μl,37℃繼續(xù)孵育2 h,用酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞在450 nm下的吸光度值(OD450)。

1.6 ELISA法檢測細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6水平 取對數(shù)生長期的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞以1×104個(gè)/孔的密度接種于96孔板中,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔,按照1.4進(jìn)行相應(yīng)分組與處理。繼續(xù)培養(yǎng)48 h,收集培養(yǎng)基上清液,根據(jù)TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒說明書,對細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6水平進(jìn)行檢測。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 將對數(shù)生長期的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞以3×104個(gè)/孔的密度接種于6孔板中,培養(yǎng)過夜后按1.4方法對細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,加入胰蛋白酶消化收集細(xì)胞,PBS洗滌2次后加入500 μl的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,加入Annexin V-FITC和PI各5 μl于室溫下避光反應(yīng)15 min。上流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測細(xì)胞中AMPK、mTOR mRNA的表達(dá) 將對數(shù)生長期的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞以3×104個(gè)/孔的密度接種于6孔板中,培養(yǎng)過夜后按1.4方法對細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞,加入Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)?95℃ 5 min,95℃ 15 s,60℃ 30 s,72℃ 30 s,共循環(huán)40次。以GAPDH為內(nèi)參,應(yīng)用2-ΔΔCt方法計(jì)算AMPK、mTOR mRNA的相對表達(dá)。見表1。

表1 引物設(shè)計(jì)序列

1.9 Western Blot檢測細(xì)胞AMPK/mTOR信號通路、自噬和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 取對數(shù)生長期的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞按1.4處理。收集細(xì)胞,加入RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒對總蛋白濃度進(jìn)行定量。經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,4℃封閉2 h。加入AMPK(1∶1 000)、p-AMPK(1∶1 000)、mTOR(1∶1 000)、p-mTOR(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、Beclin-1(1∶2 000)、LC3Ⅱ/Ⅰ(1∶1 000)一抗于4℃下孵育過夜。次日,洗膜后加入相應(yīng)二抗(1∶5 000)于室溫?fù)u床下孵育2 h,加入ECL試劑進(jìn)行顯影,以GAPDH蛋白作為內(nèi)參。在凝膠成像儀下進(jìn)行曝光,采用Image Lab軟件對目標(biāo)蛋白的灰度值進(jìn)行分析。

1.10 MDC染色觀察細(xì)胞自噬 將對數(shù)生長期的大鼠軟骨細(xì)胞接種在24孔板中,并按1.4處理。待細(xì)胞生長至80%時(shí),棄去培養(yǎng)基,使用Wash buffer清洗2次后,在每孔中加入MDC染色液100 μl,室溫下避光孵育45 min,棄去染色液,Wash buffer清洗2次,在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的自噬囊泡,計(jì)算陽性細(xì)胞的比例。

2 結(jié)果

2.1 DAP對細(xì)胞增殖活性的影響 與Control組比較,Model組細(xì)胞OD450值(48、72 h)顯著下降(P<0.05);與Model組比較,DAP-H組細(xì)胞OD450值(48、72 h)顯著上升(P<0.05),DAP-L組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與DAP-L組比較,DAP-H組細(xì)胞OD450值(48、72 h)顯著上升(P<0.05)。與DAP-H組相比,DAP-H+CC組細(xì)胞OD450值(48、72 h)顯著下降(P<0.05)。見表2。

表2 5組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖活性比較 n=6,

2.2 DAP對細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6水平的影響 與Control組比較,Model組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6水平顯著升高(P<0.05);與Model組比較,DAP-H組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6水平顯著下降(P<0.05),DAP-L組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與DAP-L組比較,DAP-H組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6水平顯著下降(P<0.05)。與DAP-H組比較,DAP-H+CC組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6水平顯著上升(P<0.05)。見表3。

表3 5組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6水平比較 n=6,pg/mL,

2.3 DAP對細(xì)胞凋亡率的影響 與Control組比較,Model組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05);與Model組比較,DAP-H組細(xì)胞凋亡率顯著下降(P<0.05),DAP-L組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與DAP-L組比較,DAP-H組細(xì)胞凋亡率顯著下降(P<0.05)。與DAP-H組比較,DAP-H+CC組細(xì)胞凋亡率顯著上升(P<0.05)。見圖1,表4。

表4 各組細(xì)胞凋亡率的比較 n=6,%,

2.4 DAP對細(xì)胞中AMPK、mTOR mRNA表達(dá)的影響 與Control組相比,Model組細(xì)胞中AMPK mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05),mTOR mRNA水平顯著升高(P<0.05)。與Model組相比,DAP-H組細(xì)胞中AMPK mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05),mTOR mRNA水平顯著降低(P<0.05),DAP-L組無顯著性差異(P>0.05)。與DAP-L組相比,DAP-H組細(xì)胞中AMPK mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05),mTOR mRNA水平顯著降低(P<0.05)。與DAP-H組相比,DAP-H+CC組細(xì)胞中AMPK mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05),mTOR mRNA水平顯著升高(P<0.05)。見表5。

表5 5組細(xì)胞中AMPK、mTOR mRNA表達(dá)比較 n=6,

2.5 DAP對細(xì)胞中自噬的影響 與Control組比較,Model組MDC陽性細(xì)胞比例顯著下降(P<0.05);與Model組比較,DAP-H組MDC陽性細(xì)胞比例顯著上升(P<0.05),DAP-L組差異無統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05);與DAP-L組比較,DAP-H組MDC陽性細(xì)胞比例顯著上升(P<0.05);與DAP-H組比較,DAP-H+CC組MDC陽性細(xì)胞比例顯著下降(P<0.05)。見圖2,表6。

圖2 大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞MDC熒光染色圖(比例尺=100 μm)

表6 5組陽性細(xì)胞比例比較 n=6,%,

2.6 DAP對細(xì)胞中AMPK/mTOR信號通路、自噬、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與Control組比較,Model組細(xì)胞中AMPK磷酸化水平、Bcl-2、Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05),mTOR磷酸化水平、Bax蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。與Model組比較,DAP-H組細(xì)胞中AMPK磷酸化水平、Bcl-2、Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05),mTOR磷酸化水平、Bax蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05),DAP-L組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與DAP-L組比較,DAP-H組細(xì)胞中AMPK磷酸化水平、Bcl-2、Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05),mTOR磷酸化水平、Bax蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。與DAP-H組比較,DAP-H+CC組細(xì)胞中AMPK磷酸化水平、Bcl-2、Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05),mTOR磷酸化水平、Bax蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見圖3,表7。

圖3 Western Blot檢測細(xì)胞中AMPK/mTOR信號

表7 5組細(xì)胞中AMPK/mTOR信號通路、自噬、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較n=6,

3 討論

OA是在力學(xué)或者生物學(xué)的影響因素下,導(dǎo)致軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、軟骨下骨三者降解和合成正常耦聯(lián)失衡的結(jié)果[12]。其中,65歲以上人群的患病率男性為60%,女性為70%,且隨著人口老齡化的進(jìn)程、生活方式的變化等因素,OA的發(fā)病率正在逐年攀升[13]。OA的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,且尚未闡明,研究者發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞在OA的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。軟骨細(xì)胞具有能夠維持機(jī)體軟骨完整程度,并使關(guān)節(jié)軟骨獲得充分負(fù)重的能力[14]。因此,探究關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的生物學(xué)活動(dòng)將為OA的發(fā)病機(jī)制闡明與治療方法的新發(fā)現(xiàn)帶來幫助。IL-1β是常見的體外誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞模型的誘導(dǎo)因子,本研究采用IL-1β誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞建立OA體外模型,結(jié)果顯示,與Control組比較,Model組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞OD450值(48 h、72 h)、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下降,細(xì)胞凋亡率、炎性因子TNF-α、IL-6水平、Bax蛋白表達(dá)顯著上升。這些結(jié)果說明OA的體外模型構(gòu)建成功。

已有研究發(fā)現(xiàn),DAP作為一種血液化瘀劑,能夠用于心血管病的治療[15]?，F(xiàn)階段,也有研究者發(fā)現(xiàn),DAP也可以用于炎癥類疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、癌癥等治療過程中。Zhang等[16]研究發(fā)現(xiàn)DAP可能通過抑制PI3K/AKT、MAPK和NF-κB信號通路和凋亡相關(guān)因子,對體外和體內(nèi)的OA模型均起到保護(hù)作用。Vinayagam等[17]研究發(fā)現(xiàn)DAP可以保護(hù)INS-1胰腺β細(xì)胞免受鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,表明DAP有望成為治療糖尿病的候選藥物。代嬋等[18]研究發(fā)現(xiàn)DAP可以降低NF-κB信號通路中p65的磷酸化水平,調(diào)節(jié)相關(guān)炎性因子分泌,減輕類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的炎性反應(yīng)。自噬是Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡過程,研究發(fā)現(xiàn)保持高水平的自噬可能對軟骨細(xì)胞具有保護(hù)作用[19]。在自噬激活過程中,Beclin-1表達(dá)上調(diào),且LC3Ⅱ/Ⅰ的水平與自噬水平成正比。本研究結(jié)果顯示,與Model組相比,DAP-H組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞OD450值(48、72 h)、Bcl-2、Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)、MDC陽性細(xì)胞比例顯著上升,細(xì)胞凋亡率、炎性因子TNF-α、IL-6水平、Bax蛋白表達(dá)顯著下降。這說明DAP能促進(jìn)IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬,抑制細(xì)胞凋亡。

AMPK/mTOR信號通路是自噬相關(guān)信號通路之一,AMPK通過磷酸化被激活,并降低mTOR的磷酸化水平,從而激活自噬過程[20]。Hwang等[21]研究發(fā)現(xiàn)抗抑郁藥物舍曲林能夠通過激活A(yù)MPK,抑制mTOR來啟動(dòng)自噬,從而治療自噬相關(guān)疾病。張哲等[22]研究發(fā)現(xiàn)利拉魯肽能夠通過激活A(yù)MPK/mTOR信號通路激活自噬,減輕2型糖尿病大鼠的心肌炎癥和氧化應(yīng)激損傷。本研究結(jié)果顯示,與Control組比較,Model組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的AMPK mRNA表達(dá)和蛋白磷酸化水平顯著降低,mTOR mRNA水平和蛋白磷酸化水平顯著升高。與Model組比較,DAP-H組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的AMPK mRNA表達(dá)和蛋白磷酸化水平顯著升高,mTOR mRNA水平和蛋白磷酸化水平顯著降低。這說明DAP可能通過激活A(yù)MPK/mTOR信號通路促進(jìn)IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬,抑制細(xì)胞凋亡。為了驗(yàn)證此猜想,筆者用AMPK抑制劑Compound C來干預(yù)高濃度的DAP組,結(jié)果發(fā)現(xiàn),Compound C減弱了DAP對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬的促進(jìn)作用,促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。

綜上所述,DAP可能通過激活A(yù)MPK/mTOR信號通路促進(jìn)IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬,抑制細(xì)胞凋亡。本研究為闡明OA的發(fā)病機(jī)制和探尋治療OA的新藥物提供了科學(xué)的依據(jù)和參考。然而本研究還存在不足之處,本研究只在細(xì)胞水平上進(jìn)行了探究,后續(xù)還需進(jìn)一步在體內(nèi)水平上進(jìn)行驗(yàn)證。