程占睿 林雨薇，3 鐘妍 張阿龍 徐海霞 田力△ 劉忠△

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院輸血研究所， 四川 成都 610052； 2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血不良反應(yīng)研究實(shí)驗(yàn)室；3.安徽醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院)

同種異基因造血干細(xì)胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)是目前治愈造血功能異常和血液系統(tǒng)惡性腫瘤的有效手段，據(jù)中國(guó)造血干細(xì)胞移植登記組報(bào)告，2019 年我國(guó)140 家單位實(shí)施allo-HSCT 近萬(wàn)例，占全球造血干細(xì)胞移植總例數(shù)的14.9%[1-3]。 Allo-HSCT 臨床應(yīng)用的同時(shí)，aGVHD 依舊是主要并發(fā)癥和死亡原因[4-5]。aGVHD 的機(jī)制研究表明:移植物中的供者T 細(xì)胞活化后錯(cuò)誤識(shí)別受者組織抗原，分化為細(xì)胞毒性T 細(xì)胞并且異常分泌多種淋巴因子，形成細(xì)胞因子風(fēng)暴，損傷宿主靶器官，造成包括肝、胃腸道、皮膚黏膜等的受累[6]。

預(yù)防aGVHD 發(fā)生的關(guān)鍵點(diǎn)在于抑制細(xì)胞因子風(fēng)暴的形成，最常見的方法是免疫抑制藥物的應(yīng)用，然而這些藥物抑制供者T 細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)非特異性降低全身免疫功能，導(dǎo)致感染和死亡的發(fā)生[5，7]。

ECP 是1 種基于白細(xì)胞分離技術(shù)的免疫調(diào)節(jié)療法，1987年由Edelson 等[8]發(fā)明并被美國(guó)FDA 批準(zhǔn)用于皮膚T 細(xì)胞淋巴瘤(Cutaneous T Cell lymphoma， CTCL)的治療。 ECP 程序包括患者外周血白細(xì)胞的分離，體外加入光敏劑和紫外線(ultraviolet radiation A，UVA)照射誘導(dǎo)白細(xì)胞的凋亡，最后將處理后的白細(xì)胞回輸給患者以達(dá)到治療目的[9]。 光敏劑8-甲氧基補(bǔ)骨脂素(8-Methoxypsoralen 8-MOP)，是1 種天然化合物，存在于多種草本植物中且毒性極低，可被UVA(波長(zhǎng):320-400nm)激活，產(chǎn)生活性氧損傷細(xì)胞DNA 和蛋白質(zhì)[10]，同時(shí)活化的8-MOP 也可以插入到DNA 之間，交聯(lián)嘧啶堿基，阻止細(xì)胞的增殖從而引起細(xì)胞凋亡[11]。 隨著研究的不斷進(jìn)展，人們發(fā)現(xiàn)ECP 不僅可以介導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的抗腫瘤效應(yīng)[12]，也可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫耐受[13-14]，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。 1993 年，首次有文獻(xiàn)報(bào)道ECP 具有治療GVHD 的作用[15]，隨后越來越多報(bào)道證實(shí)了ECP 臨床治療的有效性[16-18]，ECP 治療的安全性也成為了其最大的優(yōu)勢(shì)[19]。 1 項(xiàng)最新的RCT 研究表明血液系統(tǒng)惡性腫瘤的患者接受造血干細(xì)胞移植后馬上預(yù)防性進(jìn)行8 次ECP 治療后可以降低aGVHD 的發(fā)生率[20]，但其具體作用機(jī)制仍不明確。目前的研究重點(diǎn)在于ECP 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡如何介導(dǎo)免疫耐受[21]，隨著人們對(duì)凋亡的不斷研究，發(fā)現(xiàn)不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞有不同的免疫功能，早期凋亡的細(xì)胞可能會(huì)誘導(dǎo)免疫耐受的發(fā)生[22]。 而臨床觀察到ECP 的預(yù)防作用是否和早期凋亡細(xì)胞相關(guān)，這一部分目前仍不清楚，故本實(shí)驗(yàn)擬在體外探究ECP 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡情況，同時(shí)體外建立aGVHD 小鼠模型，觀察ECP 的預(yù)防效果，探討早期凋亡細(xì)胞在其中的作用機(jī)制，為臨床ECP 預(yù)防aGVHD 的開展奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6 ～8 周齡SPF 級(jí)雌性BALB/C 小鼠(H-2Kd)和8～10 周齡C57BL/6 小鼠(H-2Kd)，體重(22±2)g，由四川成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCKK(川)2020-0030。 于移植實(shí)驗(yàn)前1 周起給予BALB/C 受鼠抗生素飲食至實(shí)驗(yàn)全程，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房?jī)?nèi)12 h 晝夜交替，溫度22～26℃，濕度40%～60%，(5 ～6)只/籠，自由進(jìn)食與飲水，飼喂全價(jià)小鼠顆粒飼料。 所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均通過倫理審查及批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)過程遵循國(guó)家相關(guān)規(guī)定，小鼠使用經(jīng)頸椎脫臼法處死。

1.2 主要試劑 Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào)Q10216，北京全氏金生物)；8-MOP(批號(hào)1003333048，美國(guó)Sigma)；流式抗體APC-H2KB(批號(hào)17-5958-82)，PB450-H2Kd(批號(hào)17-5957-82)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific)；小鼠流式微球技術(shù)(Cytometric Bead Array， CBA)定量檢測(cè)試劑盒(批 號(hào)2140290)， 流 式 抗 體， PrECP-Cy5.5-CD45 (批 號(hào)2168091)，F(xiàn)ITC-CD3(批號(hào)1349586)，PE-CY7-CD4(批號(hào)2124924)，PE-IFN-γ(批號(hào)1277781)；紅細(xì)胞裂解液(批號(hào)2096595)(美國(guó)BD Biosciences Pharmingen)。

1.3 ECP 處理

1.3.1 小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞懸液制備 小鼠引頸脫臼處死，于超凈臺(tái)中無(wú)菌剪開脾臟包膜，置于200 目濾網(wǎng)上研磨，用含體積分?jǐn)?shù)2%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基沖洗濾網(wǎng)數(shù)次，收集過濾后的脾臟細(xì)胞懸液，22℃下1 200 rpm，120 g，離心10 min 收集細(xì)胞，紅細(xì)胞裂解液室溫裂解10 min，加入適量RPMI-1640 培養(yǎng)基終止裂解，離心去上清，PBS 洗滌2 次，最后用預(yù)溫的RPMI-1640 培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108/mL。

1.3.2 ECP 處理細(xì)胞 按上述方法獲得的小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞懸液加入50 ng/mL， 100 ng/mL， 200 ng/mL， 300 ng/mL， 600 ng/mL 的8-MOP 在CO2孵箱中孵育30 min。 將細(xì)胞培養(yǎng)皿置于Ⅰ代體外光化學(xué)處理儀(自制)中，UVA 光源照射364s，照射強(qiáng)度為2J/cm2，照射結(jié)束后，PBS 洗兩次，最后用PBS 調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108/mL。

1.3.3 Annexin V-FITC/PI 雙標(biāo)記聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ECP誘導(dǎo)凋亡率 將不同濃度8-MOP 處理過的脾臟單個(gè)核細(xì)胞懸液各取10 μL 加入流式管中，嚴(yán)格按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，使用100μL 預(yù)冷的Annexin V Binding Buffer 重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI 室溫避光孵育15 min，最后加入400 μL 預(yù)冷的Annexin V Binding Buffer，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，收集數(shù)據(jù)并使用FlowJo 軟件分析。

1.4 aGVHD 模型的建立

1.4.1 移植前處理及實(shí)驗(yàn)分組 移植前1 周喂食BALB/C小鼠含有125 mg/L 慶大霉素和100 mg/mL 紅霉素的無(wú)菌酸化水，移植當(dāng)天將小鼠置入RS2000 生物學(xué)X 射線輻照儀中，8Gy 一次性照射6 min，根據(jù)表1 的實(shí)驗(yàn)分組，照射4 h 后從BALB/C 小鼠的尾靜脈回輸不同細(xì)胞，建立aGVHD 模型。

表1 實(shí)驗(yàn)分組

1.4.2 骨髓有核細(xì)胞懸液的制備 小鼠引頸脫臼處死，于超凈臺(tái)中無(wú)菌取股骨和脛骨，注射器插入骨髓腔用含體積分?jǐn)?shù)2%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基沖出骨髓，收集沖出的骨髓細(xì)胞懸液，22℃下1 200 rpm，120 g，離心10 min 收集細(xì)胞，紅細(xì)胞裂解液室溫裂解10 min，加入適量RPMI-1640 培養(yǎng)基終止裂解，離心去上清，PBS 洗滌2 次，最后用預(yù)溫的RPMI-1640 培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108/mL。

1.4.3 尾靜脈輸注細(xì)胞懸液 根據(jù)表1 的實(shí)驗(yàn)分組將上述的細(xì)胞懸液混合后經(jīng)尾靜脈緩慢輸入。

1.5 小鼠預(yù)防效果評(píng)價(jià)

1.5.1 小鼠生存時(shí)間分析及aGVHD 癥狀評(píng)分 移植后每天觀察記錄小鼠生存情況，通過Kaplan-Meier 的方法繪制生存曲線，Long-rank 分析方法比較各組小鼠生存率之間的差異。同時(shí)觀察和記錄小鼠的一般情況，包括體重變化(每3 d 測(cè)量1 次，減少操作應(yīng)激對(duì)小鼠的影響)、皮毛、腹瀉、活動(dòng)度和食欲，判斷小鼠是否發(fā)生了aGVHD。 根據(jù)Cooke 等[23]的臨床aGVHD 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，見表2，在移植后d8 對(duì)各組小鼠的aGVHD 癥狀進(jìn)行評(píng)分。

表2 aGVHD 的臨床評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.5.2 嵌合分析 取移植后d7 aGVHD 組小鼠和健康對(duì)照組BALB/C 小鼠的骨髓細(xì)胞制備單個(gè)核細(xì)胞懸液，加入2 μL APC 標(biāo)記的H2KB 和PB450 標(biāo)記的H2Kd 抗體，30 min 后流式細(xì)胞儀檢測(cè)受鼠骨髓中供鼠細(xì)胞的植入情況，嵌合度＝(H-2KB＋細(xì)胞數(shù))/ (H-2KB＋細(xì)胞數(shù)＋H-2Kd＋細(xì)胞數(shù)) ×100%，移植后小鼠顯示供鼠組織相容性抗原H-2KB 大于90%以上表明骨髓移植成功。

1.5.3 CBA 細(xì)胞炎性因子定量檢測(cè) 取移植后d7 aGVHD組小鼠和ECP 預(yù)防組不含抗凝劑的外周血，4℃靜置2 h，4℃下3 000 g 離心20 min，取上清嚴(yán)格按照CBA 試劑盒說明書進(jìn)行操作，染色3 h 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組之間IFN-γ、IL-2、TNF、IL-4 和IL-6 細(xì)胞因子的分泌情況。

1.5.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th1 類反應(yīng) 取移植后d7 aGVHD組小鼠和ECP 預(yù)防組脾臟單個(gè)核細(xì)胞懸液，加入淋巴細(xì)胞刺激劑，8h 后收集細(xì)胞加入2μL PrECP-Cy5.5 標(biāo)記的CD45，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的CD3 和PE-CY7 標(biāo)記的CD4 進(jìn)行表面染色，而后加入破膜劑離心去上清，加入2 μL PE 標(biāo)記的IFN-γ 和APC 標(biāo)記的IL-4 進(jìn)行胞內(nèi)染色，最后重懸細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用Graph Prism9 進(jìn)行圖像處理，采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，事后比較采用Bonferroni 矯正，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的意義。

2 結(jié)果

2.1 ECP 處理中200～300 ng/mL 的8-MOP 誘導(dǎo)小鼠脾臟細(xì)胞早期凋亡效率最高 通過Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ECP 處理中不同濃度8-MOP(50 ng/mL， 100 ng/mL， 200 ng/mL，300 ng/mL，600 ng/mL)的C57BL/6 小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞的凋亡率。 Annexin V-/PI-標(biāo)記的細(xì)胞是未凋亡細(xì)胞，Annexin V＋/PI-標(biāo)記的細(xì)胞是早期凋亡的細(xì)胞，Annexin V＋/PI＋標(biāo)記的細(xì)胞是晚期凋亡細(xì)胞。 FlowJo 軟件分析流式細(xì)胞儀測(cè)得的不同濃度8-MOP 的ECP 處理后小鼠脾臟細(xì)胞的早期凋亡率(%):14.18±0.865vs16.76±0.407vs18.83±0.404vs19.27±0.404vs14.5±0.529。 發(fā)現(xiàn)50 ng/mL，100 ng/mL 和600 ng/mL 的8-MOP 早期凋亡率均顯著低于200 ng/mL 和300 ng/mL 的8-MOP(P＜0.000 1，P＜0.01，P＜0.000 1，圖1)，而200 ng/mL 和300 ng/mL 的8-MOP 早期凋亡率不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖1)。 故誘導(dǎo)小鼠脾臟細(xì)胞早期凋亡效率最高的8-MOP 濃度在200 ～300 ng/mL 之間，考慮到8-MOP 的低毒性本實(shí)驗(yàn)后續(xù)研究選取的8-MOP 濃度均為200 ng/mL。

圖1 ECP 處理中不同濃度8-MOP 的小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞的凋亡率

2.2 aGVHD 小鼠模型的建立 如表1 所示構(gòu)建各組小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，從臨床癥狀來看，單純照射組小鼠從d4 開始出現(xiàn)死亡，到d7 全部死亡，體重一直下降(圖2A，B，C)，小鼠不僅食欲下降而且活動(dòng)明顯減少，但是未出現(xiàn)典型的aGVHD 表現(xiàn)。所有同基因骨髓移植組小鼠在移植后健康存活，異基因骨髓移植小鼠也只在d6 死亡1 只，其余均健康存活，無(wú)aGVHD癥狀。 aGVHD 組小鼠在移植后d7 開始陸續(xù)死亡，至移植后12 d 無(wú)存活，存活率顯著低于同基因和異基因骨髓移植組小鼠(P＜0.01，P＜0.01，圖2B)。 而且aGVHD 組小鼠在移植后d4～d5 開始出現(xiàn)典型的aGVHD 的臨床表現(xiàn):弓背、立毛、腹瀉、活動(dòng)度下降和禿毛等癥狀(圖2A)；而其它組別小鼠無(wú)上述表現(xiàn)。 所有組別小鼠在移植后4 d 內(nèi)體重急劇下滑，但隨后同基因和異基因骨髓移植組小鼠體重逐漸恢復(fù)，而與aGVHD 組小鼠相比其體重則持續(xù)下降(P＜0.01，P＜0.01，圖2C)。

圖2 aGVHD 小鼠臨床癥狀和移植后各組小鼠生存時(shí)間和體重變化

為了進(jìn)一步明確移植后供者小鼠骨髓細(xì)胞是否嵌合成功，在移植后d7 取移植小鼠與健康對(duì)照BALB/C 小鼠的骨髓細(xì)胞進(jìn)行流式染色分析，結(jié)果顯示對(duì)照小鼠骨髓細(xì)胞未檢測(cè)到H-2Kb 表達(dá)(圖3A)，移植小鼠則高表達(dá)H-2Kd 且嵌合度大于90%表明骨髓移植成功(圖3B)。 以上數(shù)據(jù)說明異基因造血干細(xì)胞移植后骨髓細(xì)胞和供者淋巴細(xì)胞混合輸注可成功誘導(dǎo)小鼠aGVHD 模型。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)移植后小鼠的嵌合度

2.3 ECP 預(yù)防aGVHD 的發(fā)展 比較aGVHD 組小鼠和ECP預(yù)防組小鼠的生存曲線可以發(fā)現(xiàn)，ECP 預(yù)防處理明顯延長(zhǎng)了aGVHD 小鼠的生存周期(P＜0.05，圖4A)。 移植后兩組小鼠體重均在4 d 內(nèi)出現(xiàn)急劇下降，ECP 預(yù)防組小鼠體重略高于aGVHD 組小鼠，但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4B)。 骨髓移植后d5 開始，aGVHD 組小鼠開始出現(xiàn)典型的aGVHD 的臨床癥狀:弓背、立毛、腹瀉、活動(dòng)度下降和禿毛，ECP 預(yù)防組雖然也有上述表現(xiàn)，但是相比之下癥狀較輕微，且沒有進(jìn)一步惡化，其臨床評(píng)分顯著低于aGVHD 組(P＜0.05，圖4C)。

圖4 移植后ECP 預(yù)防組和aGVHD 組小鼠生存時(shí)間、體重和臨床評(píng)分的變化

2.4 ECP 降低aGVHD 小鼠體內(nèi)炎癥，抑制Th1 類反應(yīng) 移植后7 d，取aGVHD 組和ECP 預(yù)防組小鼠的外周血，用CBA法檢測(cè)血清中Th1/Th2 細(xì)胞因子的濃度變化，可見ECP 預(yù)防組小鼠血清中Th1 類細(xì)胞因子(IFN-γ，IL-2 和TNF)濃度較aGVHD 組顯著下降(P＜0.05，圖5A)，而Th2 類細(xì)胞因子(IL-4 和IL-6)濃度兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖5B)。

圖5 ECP 預(yù)防組和aGVHD 組小鼠外周血Th1/Th2 細(xì)胞因子濃度比較

取各組小鼠移植后7 d 的脾臟行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4＋T 淋巴細(xì)胞中Th1 類細(xì)胞占比，計(jì)算Th1 類細(xì)胞絕對(duì)數(shù)(每1萬(wàn)個(gè)脾臟有核細(xì)胞中的數(shù)量)，可見ECP 預(yù)防組中Th1 類淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)＜aGVHD 組(P＜0.05，圖6A、B、C)。

圖6 ECP 降低了aGVHD 組小鼠體內(nèi)Th1 類反應(yīng)

3 討論

aGVHD 是造血干細(xì)胞移植是否治愈以及決定患者移植后長(zhǎng)期生存的重要因素[24]。 然而，傳統(tǒng)藥物在有效緩解排異癥狀的同時(shí)不可避免地降低了機(jī)體的免疫功能，導(dǎo)致部分患者出現(xiàn)嚴(yán)重感染，甚至原有疾病復(fù)發(fā)[3，25]。 近年來細(xì)胞療法作為1 種新興手段，在aGVHD 的動(dòng)物模型和臨床研究上已有很多成功的探索與實(shí)踐，多種細(xì)胞在調(diào)控aGVHD 發(fā)生與發(fā)展的過程中更有特異性，相較傳統(tǒng)藥物療法更具有安全性[26-28]。

ECP 不僅僅是1 種細(xì)胞療法，同時(shí)也是aGVHD 患者臨床治療的重要二線方案和潛在的一線治療手段[29]，治療的有效性和安全性是其最大的優(yōu)勢(shì)。 美國(guó)單采協(xié)會(huì)(AmeriCAn SoCieTy for Apheresis，AFSA)收集了近年來臨床ECP 治療aGVHD 的臨床數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)患者的部分緩解率約為65%，顯著延長(zhǎng)了患者的生存周期，雖然不同的治療方案、不同部位的受累器官和aGVHD 嚴(yán)重程度導(dǎo)致ECP 的療效差異較大，但患者均未出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)[30]。 但是ECP 對(duì)機(jī)體免疫功能的影響，在不同疾病和不同患者中是十分復(fù)雜和多變的，故本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建小鼠aGVHD 模型，證實(shí)了移植前單劑量ECP 處理過的細(xì)胞可以減少aGVHD 的發(fā)生，并且顯著延長(zhǎng)了小鼠骨髓移植后的存活率，這部分研究結(jié)果與Alin 等[20]的臨床研究結(jié)果一致，提示了ECP 作為1 種細(xì)胞療法在aGVHD 預(yù)防中的潛力。

GVHD 的發(fā)生主要包括3 個(gè)過程:1)放化療損傷組織器官，引發(fā)宿主細(xì)胞分泌各種炎性因子，并激活抗原呈遞細(xì)胞(antigen-presenting cell，APC)；2)供者T 細(xì)胞通過識(shí)別宿主APC 提呈的異基因抗原而被異常激活和擴(kuò)增，尤其是Th1 類細(xì)胞的擴(kuò)增，分泌大量IFN-γ 同時(shí)分化為效應(yīng)T 細(xì)胞，；3)最后大量炎性因子的分泌形成“細(xì)胞因子風(fēng)暴”和效應(yīng)T 細(xì)胞作用于小腸、皮膚、肝臟和肺臟等靶器官和組織，造成臨床aGVHD 的 發(fā) 生[4]。 2002 年Francine 等[31]第1 次 揭 示 了ECP 用于治療aGVHD 的免疫機(jī)制，發(fā)現(xiàn)ECP 治療后體內(nèi)Th1 向Th2 轉(zhuǎn)變，說明ECP 抑制了“細(xì)胞因子風(fēng)暴”，建立特異性免疫耐受。 2006 年人們對(duì)ECP 治療aGVHD 引起的免疫耐受有了更加進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)和了解，認(rèn)為ECP 治療主要通過回輸?shù)蛲龅牧馨图?xì)胞來觸發(fā)體內(nèi)的一系列免疫耐受機(jī)制，從而抑制細(xì)胞因子風(fēng)暴[32]。 然而不同于臨床在aGVHD發(fā)生之后采取ECP 治療，我們則是在aGVHD 發(fā)生之前回輸了單劑量的ECP 處理過的細(xì)胞，不僅觀察到一定的臨床預(yù)防作用，后續(xù)進(jìn)一步的流式細(xì)胞術(shù)也發(fā)現(xiàn)與aGVHD 組相比，ECP 預(yù)防組小鼠Th1 類細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P＜0.05)，同時(shí)IFN-γ，IL-2 和TNF 細(xì)胞因子的濃度也顯著下降(P＜0.05)，說明ECP 可能依賴早凋的細(xì)胞來預(yù)防小鼠aGVHD 的發(fā)生，這可能是其抗aGVHD 的關(guān)鍵機(jī)制之一。 移植前回輸單劑量ECP 誘導(dǎo)的早期凋亡的脾臟單個(gè)核細(xì)胞抑制了Th1 類細(xì)胞的異常擴(kuò)增，也減弱了“細(xì)胞因子風(fēng)暴”的影響，阻止了aGVHD 的發(fā)生發(fā)展，說明ECP 不僅僅可以治療aGVHD，也能起到一定的預(yù)防作用。 由此可見，ECP 無(wú)疑是1 種十分有前景的細(xì)胞治療手段，這部分的結(jié)果為臨床使用ECP 預(yù)防aGVHD 提供了新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

盡管我們的研究結(jié)果表明了ECP 在防治aGVHD 方面的巨大潛力，但仍存在一些研究限制。 首先，本研究使用小鼠作為模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果仍需要在人體中進(jìn)行驗(yàn)證。 其次，我們僅觀察了ECP 處理對(duì)細(xì)胞的早期凋亡的影響，對(duì)于ECP 處理后細(xì)胞的長(zhǎng)期影響仍需要進(jìn)一步研究。 ECP 發(fā)揮免疫調(diào)控的機(jī)制十分復(fù)雜，涉及許多方面，目前已得到公認(rèn)的基礎(chǔ)機(jī)制:細(xì)胞因子分泌模式從促炎轉(zhuǎn)變?yōu)橐盅譡33]，誘導(dǎo)耐受性樹突狀細(xì)胞(tolerogenic dendritic cell，TolDC)和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(regulatory T cells， Treg)的產(chǎn)生[34]。 有研究表明ECP 處理的細(xì)胞所提供的凋亡信號(hào)會(huì)直接影響宿主APC[14]，而DC 則是迄今為止功能最強(qiáng)大的APC，具有免疫應(yīng)答和免疫耐受兩種功能，對(duì)維持免疫平衡具有重要作用[35]。 從功能講，能夠誘導(dǎo)免疫耐受的DC 群定義為TolDC，TolDC 主要由未成熟DC(immature DC，imDC)組成。imDC 低水平表達(dá)CD83，同時(shí)還低水平表達(dá)與T 細(xì)胞激活密切相關(guān)的MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ類分子、協(xié)同刺激分子(CD80 和CD86)，因此imDC 抗原攝取、加工處理能力較強(qiáng)，但誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答能力較弱，故可介導(dǎo)耐受作用[36-37]。 2008 年一項(xiàng)臨床研究[38]發(fā)現(xiàn)，aGVHD 患者經(jīng)ECP 治療后的凋亡淋巴細(xì)胞與imDC 共培養(yǎng)后，可以截?cái)鄆mDC 的成熟，故本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)ECP 處理后的早凋細(xì)胞也可能通過宿主DC 來調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，DC 細(xì)胞不僅僅是目前ECP 研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，也是本課題的下一步研究方向。

綜上所述，本研究通過以C57BL/6 小鼠作供鼠，BALB/C小鼠作受鼠，經(jīng)X 射線8Gy 全身照射后，尾靜脈輸注供鼠骨髓細(xì)胞和脾細(xì)胞，可成功建立小鼠aGVHD 模型。 通過預(yù)防性輸注ECP 誘導(dǎo)的早期凋亡細(xì)胞可減少aGVHD 的發(fā)生，顯著延長(zhǎng)了小鼠骨髓移植后的存活率。 本研究為ECP 在aGVHD 預(yù)防中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研究ECP的機(jī)制和優(yōu)化治療方案提供了方向。 未來的臨床研究可以進(jìn)一步在人體中驗(yàn)證ECP 的預(yù)防作用，并探索其在不同類型GVHD 中的作用機(jī)制。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。