湯倩玲?溫福龍?袁陽(yáng)?吳怡?馬文博?褚以文?趙克雷

摘要：目的 以銅綠假單胞菌PAO1為模式菌，研究惡唑烷酮類新化合物對(duì)銅綠假單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的抑制作用及其作用機(jī)制。 方法 測(cè)定5個(gè)惡唑烷酮類新化合物對(duì)PAO1生物膜、綠膿菌素、運(yùn)動(dòng)能力抑制活性，采用qRT-PCR測(cè)試其對(duì)群體感應(yīng)相關(guān)基因的下調(diào)作用，并評(píng)估化合物對(duì)秀麗隱桿線蟲感染模型的保護(hù)活性。結(jié)果 化合物SIIA-MA2與SIIA-MA4對(duì)PAO1生物膜、綠膿菌素、運(yùn)動(dòng)能力具有較強(qiáng)的抑制活性，其作用機(jī)制均是并顯著下調(diào)PAO1中10個(gè)已知的受群體感應(yīng)系統(tǒng)正調(diào)控的基因?；衔颯IIA-MA2與SIIA-MA4對(duì)秀麗隱桿線蟲感染模型具有良好的體內(nèi)保護(hù)活性，其中化合物SIIA-MA2對(duì)急性感染模型具有顯著保護(hù)活性；化合物SIIA-MA4對(duì)慢性感染模型具有顯著保護(hù)活性。結(jié)論 惡唑烷酮類新化合物SIIA-MA2和SIIA-MA4通過(guò)抑制PAO1群體感應(yīng)系統(tǒng)發(fā)揮抗感染作用。

關(guān)鍵詞：惡唑烷酮類化合物；銅綠假單胞菌；群體感應(yīng)；群體感應(yīng)抑制劑

中圖分類號(hào)：R978.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Study on inhibition of quorum sensing system of Pseudomonas aeruginosa by five novel oxazolidinones

Tang Qianling， Wen Fulong， Yuan Yang， Wu Yi， Ma Wenbo， Chu Yiwen， and Zhao Kelei

（Antibiotics Research and Re-evaluation Key Laboratory of Sichuan Province， Sichuan Industrial Institute of Antibiotics， School of Pharmacy， Chengdu University， Chengdu 610106）

Abstract Objective To evaluate the inhibitory activities of novel oxazolidinone compounds on the quorum sensing （QS） system of P. aeruginosa reference strain PAO1. Methods The influences of five novel oxazolidinones on the QS system， biofilm formation， pyocyanin formation， and motility ability of P. aeruginosa PAO1 were tested， followed by checking the expression of 10 typical genes that are positively regulated by the QS system of P. aeruginosa using qRT-PCR. Caenorhabditis elegans-P. aeruginosa PAO1 infection model was employed to explore the in vivo protective effect of compounds SIIA-MA2 and SIIA-MA4.? Results Compounds SIIA-MA2 and SIIA-MA4 significantly inhibited the production of biofilm， pyocyanin， and bacterial motility of P. aeruginosa PAO1， and the expression levels of QS-controlled genes were significantly down-regulated. Furthermore， the treatment of compound SIIA-MA2 significantly protected C. elegans from the fast-killing of P. aeruginosa PAO1， while the compound SIIA-MA4 mainly functioned in the slow-killing assay. Conclusion This study reveals anti-QS activities of the new oxazolidinone compounds SIIA-MA2 and SIIA-MA4 against P. aeruginosa， and provides a method for the discovery of novel anti-infectious drugs.

Key words Oxazolidinones; Pseudomonas aeruginosa; Quorum sensing; Quorum sensing inhibitor

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa， PA）是一種條件致病菌，容易導(dǎo)致局部感染和全身感染，患有免疫功能受損疾?。ㄈ缒倚岳w維化、癌癥和艾滋?。┑幕颊吒赘腥尽A通過(guò)毒力因子產(chǎn)生致病性，其固有耐藥與生物膜相關(guān)[1]。PA的生物膜形成和多數(shù)胞外毒力因子的合成和分泌都受群體感應(yīng)系統(tǒng)（quorum sensing， QS）調(diào)控，QS在PA的致病性和耐藥性中起著重要作用[2]。PA具有l(wèi)as、rhl與pqs等3個(gè)QS調(diào)控系統(tǒng)，且las系統(tǒng)能夠正向調(diào)控其余兩個(gè)系統(tǒng)，QS抑制劑的開發(fā)對(duì)防控PA的感染與耐藥性具有重要意義[3]。

本研究前期通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)對(duì)自建化合物庫(kù)中的化合物進(jìn)行虛擬篩選，得到了22個(gè)惡唑烷酮類新化合物，利用M9-腺苷培養(yǎng)基與LB培養(yǎng)基進(jìn)行差異性培養(yǎng)篩選[4]，在50 μmol/L的化合物濃度下經(jīng)初篩得到5種活性化合物（圖1），再設(shè)置25、50、100、200 μmol/L的濃度梯度開展量效關(guān)系研究，最終確定了50 μmol/L為最適抑制濃度。本文報(bào)道5個(gè)化合物對(duì)PA生物膜、綠膿菌素及運(yùn)動(dòng)能力的抑制作用，以及活性化合物SIIA-MA2與SIIA-MA4對(duì)QS相關(guān)基因表達(dá)的下調(diào)作用和對(duì)秀麗隱桿線蟲感染模型的保護(hù)活性。

1 材料

1.1 供試化合物

按照文獻(xiàn)方法[5]合成純度大于95%的化合物，配成濃度為10 mg/mL二甲亞砜（DMSO）溶液，經(jīng)肉湯稀釋法[6]測(cè)定5種化合物對(duì)PAO1的最小抑菌濃度均大于1024 μg/mL，均為無(wú)直接殺菌作用的化合物。

1.2 菌株及線蟲

野生型銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa PAO1）由本實(shí)驗(yàn)室保存，嘧啶缺陷型大腸埃希菌OP50（Escherichia coli OP50）及野生型秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）N2由加拿大戴爾豪斯大學(xué)Balakrishnan Prithiviraj博士惠贈(zèng)。

1.3 培養(yǎng)基

秀麗隱桿線蟲感染試驗(yàn)采用快殺培養(yǎng)基（peptone-glucose-sorbitol agar media，PGS）和慢殺培養(yǎng)基（slow killing agar media，SK）[7]。

1.4 試劑

DMSO、磷酸二氫鉀、氯化鈉、氯化銨、氯化鈣、七水硫酸鎂、腺苷乙醇、三氯甲烷為分析純，購(gòu)于成都市科隆化學(xué)品有限公司；結(jié)晶紫染料購(gòu)于Solarbio公司；細(xì)菌RNA提取試劑盒購(gòu)于福際生物有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green qPCR試劑盒，購(gòu)于Takara Bio公司。

1.5 儀器

LDZM-80KCS-II立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)，浙江孚夏醫(yī)療科技有限公司；CMax Plus酶標(biāo)儀，Molecular Devices公司；UV5500PC型紫外可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；CFX96熒光定量PCR儀，美國(guó)BIO-RAD公司；SMZ168體式顯微鏡，杭州歐爾柏維科技有限公司。

2 方法

2.1 化合物生物膜抑制活性檢測(cè)

參照Hwang等[8]的方法，利用結(jié)晶紫染色法檢測(cè)5個(gè)化合物對(duì)PAO1生物膜產(chǎn)量的抑制作用。初篩活性化合物的終濃度設(shè)置為50 μmol/L，設(shè)置DMSO為空白對(duì)照。

2.2 化合物綠膿菌素抑制活性檢測(cè)

參照Chakraborty等[9]的方法，將5個(gè)化合物的終濃度設(shè)置為50 μmol/L，設(shè)置DMSO為空白對(duì)照。

2.3 化合物運(yùn)動(dòng)能力抑制活性檢測(cè)

參照Ghosh等[10]的方法，利用瓊脂濃度為0.5%的LB固體培養(yǎng)基研究5個(gè)化合物在50 μmol/L濃度下對(duì)PAO1游動(dòng)能力的抑制活性，利用瓊脂濃度為1%的LB固體培養(yǎng)基研究化合物在50 μmol/L濃度下對(duì)PAO1震動(dòng)能力的抑制活性，以mm為單位測(cè)量菌落在培養(yǎng)基上形成的菌落直徑大小。設(shè)置DMSO處理組為空白對(duì)照組。

2.4 化合物SIIA-MA4、SIIA-MA2對(duì)QS相關(guān)基因表達(dá)量的影響

按照細(xì)菌總RNA提取試劑盒的操作方法提取對(duì)照組與SIIA-MA2、SIIA-MA4處理組PAO1總RNA。將上述PAO1總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用Zhao等[11-12]設(shè)計(jì)的QS正調(diào)基因特異引物，使用SYBR Green qPCR試劑盒與CFX96熒光定量PCR儀定量分析SIIA-MA2與SIIA-MA4對(duì)相關(guān)調(diào)控基因以及功能基因表達(dá)量的影響。以PAO1的16S rRNA作為內(nèi)參基因，通過(guò)2-??Ct計(jì)算方法將每個(gè)目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化。

2.5 化合物SIIA-MA4和SIIA-MA2對(duì)PAO1感染秀麗隱桿線蟲的保護(hù)活性

參照Tan等[7]的方法，分別挑取10只處于L4期的秀麗隱桿線蟲于PGS培養(yǎng)基與SK培養(yǎng)基上，分別于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)80和11 d，觀察記錄線蟲存活情況，設(shè)置給藥組和DMSO對(duì)照組。

2.6 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次生物學(xué)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，使用GraphPad Prism 8進(jìn)行ANOVA檢驗(yàn)，使用log-rank （Mantel-Cox） test對(duì)線蟲生長(zhǎng)曲線進(jìn)行生存曲線差異度比較；以P<0.05時(shí)判定具有顯著性差異，P < 0.01時(shí)判定具有極顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 化合物抑制PAO1生物膜和綠膿菌素的生成

與DMSO對(duì)照組相比，化合物SIIA-MA1、SIIA-MA3與SIIA-MA5在50 μmol/L時(shí)對(duì)PAO1生物膜和綠膿菌素?zé)o顯著抑制作用（P>0.05）。而50 μmol/L濃度的化合物SIIA-MA2和SIIA-MA4處理過(guò)的PAO1生物膜產(chǎn)量均顯著減少（圖2a），化合物SIIA-MA2對(duì)PAO1生物膜產(chǎn)量有極顯著的抑制作用（P<0.01）；化合物SIIA-MA4對(duì)PAO1生物膜的產(chǎn)量有顯著性抑制作用（P<0.05）?；衔颯IIA-MA2和SIIA-MA4在50 μmol/L終濃度的條件下，對(duì)PAO1綠膿菌素產(chǎn)量均有極顯著的抑制作用（圖2b）。

3.2 化合物抑制PAO1運(yùn)動(dòng)能力

在瓊脂濃度為0.5%的LB固體培養(yǎng)基中，與DMSO對(duì)照組相比，化合物SIIA-MA1、SIIA-MA3與SIIA-MA5在50 μmol/L時(shí)對(duì)PAO1運(yùn)動(dòng)能力無(wú)顯著抑制作用，但化合物SIIA-MA2和SIIA-MA4對(duì)PAO1的游動(dòng)能力顯示出極顯著抑制作用（P<0.0001）（圖3 a）。在瓊脂濃度為1%的LB固體培養(yǎng)基中（圖4b），與DMSO對(duì)照組相比，化合物SIIA-MA2和SIIA-MA4在50 μmol/L的終濃度下，對(duì)PAO1的震顫能力顯示出極顯著抑制作用（P<0.01）。

3.3 化合物SIIA-MA2與SIIA-MA4抑制QS相關(guān)毒力基因的表達(dá)

與DMSO對(duì)照組相比，化合物SIIA-MA2作用下的PAO1群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控基因lasR、rhlR、pqsR和下游功能基因lasB、rhlA、pqsA、pqsE、pqsD、hcnA和phzA1的表達(dá)水平均呈現(xiàn)不同程度的下調(diào)，其中調(diào)控基因lasR具有極顯著差異（P<0.001）?；衔颯IIA-MA4作用下的QS調(diào)控基因表達(dá)水平也均有不同程度的下調(diào)，其中調(diào)控基因lasR的下調(diào)具有極顯著差異（P<0.01），同時(shí)，rhlR與pqsR兩個(gè)調(diào)控基因下調(diào)均有極顯著差異（P<0.001）。表明化合物SIIA-MA2與SIIA-MA4通過(guò)同時(shí)抑制3個(gè)QS系統(tǒng)產(chǎn)生對(duì)PA的抑菌活性。

3.4 化合物SIIA-MA2與SIIA-MA4對(duì)PAO1感染秀麗隱桿線蟲的保護(hù)活性

結(jié)果表明，化合物SIIA-MA2對(duì)急性感染PA的秀麗隱桿線蟲有顯著保護(hù)作用，化合SIIA-MA4對(duì)慢性感染PA的秀麗隱桿線蟲有顯著保護(hù)作用。

在急性感染模型中（圖5a和圖5c），DMSO對(duì)照組中的線蟲在20 h開始死亡，在40 h時(shí)死亡率達(dá)到50%；在80 h時(shí)線蟲已完全死亡，而化合物SIIA-MA2給藥組的線蟲在40 h時(shí)開始死亡，在80 h時(shí)仍有50%的存活率，有顯著性差異（圖5a）；化合物SIIA-MA4給藥組的線蟲在40 h時(shí)開始死亡，在80 h時(shí)，有25%的存活率，但無(wú)顯著性差異（圖5c）。

在慢性感染模型中（圖5b和圖5d），DMSO對(duì)照組的線蟲在第10天時(shí)死亡率達(dá)到100%，而化合物SIIA-MA2處理過(guò)的線蟲整體死亡速率更慢，但無(wú)顯著性差異（圖5b）。DMSO對(duì)照中的線蟲在第9天時(shí)全部死亡，而化合物SIIA-MA4給藥組在第9天的時(shí)候線蟲存活率為40%，具有顯著性差異（圖5d）。

4 討論

惡唑烷酮類抗菌藥物是繼喹諾酮類和磺胺類后研發(fā)的第三類化學(xué)全合成抗菌藥物，對(duì)常見耐藥革蘭陽(yáng)性菌如耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌等有治療效果。第一個(gè)惡唑烷酮類藥物是利奈唑胺，于2000年4月在美國(guó)上市，對(duì)革蘭陽(yáng)性菌有良好的抑菌作用，暫無(wú)抑制PA群體感應(yīng)方面的研究。輝瑞公司用二氫噻嗪類替代C環(huán)合成了一系列衍生物，將惡唑烷酮類化合物原有的抗菌譜擴(kuò)大到革蘭陰性菌[13]。曾善超等[14]和Jiang等[15]以3-氨基-2-惡唑烷酮為骨架設(shè)計(jì)合成了一系列衍生物，得到化合物XYL-13與Z2，化合物XYL-13在576 μmol/L的濃度下有效抑制PA生物膜、綠膿菌素產(chǎn)量，抑制PA的運(yùn)動(dòng)能力；利用紫色色桿菌CV026在125 μmol/L時(shí)篩選出化合物Z2有QS抑制作用。

本研究在前期采用分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)惡唑烷酮類化合物與LasR的結(jié)合位點(diǎn)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)利奈唑胺結(jié)構(gòu)中的惡唑烷酮雜環(huán)和苯環(huán)基團(tuán)是重要結(jié)合位點(diǎn)。因此以惡唑烷酮雜環(huán)和苯環(huán)為基本骨架合成了22個(gè)新結(jié)構(gòu)衍生物，經(jīng)抗QS活性初篩獲得了本文報(bào)道的5個(gè)目標(biāo)化合物，結(jié)合5個(gè)化合物的體外抗QS表型試驗(yàn)結(jié)果和化學(xué)結(jié)構(gòu)，推測(cè)化合物苯環(huán)上的甲氧基基團(tuán)是該類化合物抑制QS活性所必需的，而結(jié)構(gòu)中苯環(huán)上的鹵素基團(tuán)不利于抑制活性的保持?；衔颯IIA-MA2與SIIA-MA4，能在50 μmol/L的低濃度下較顯著的抑制PA的QS系統(tǒng)及相關(guān)毒力因子。在秀麗隱桿線蟲感染保護(hù)實(shí)驗(yàn)中，化合物SIIA-MA2與SIIA-MA4在PA的急性感染和慢性感染中表現(xiàn)出了不同的保護(hù)活性，化合物SIIA-MA2對(duì)線蟲的急性感染模型有顯著保護(hù)活性，化合物SIIA-MA4對(duì)線蟲的慢性感染模型有顯著保護(hù)活性，可能與化合物SIIA-MA2的苯環(huán)上比化合物SIIA-MA4多一個(gè)甲基有關(guān)，有研究表明藥物分子中引入甲基能夠增加分子對(duì)靶蛋白的親和力[16]，兩個(gè)化合物體內(nèi)活性的差異需要更深入的構(gòu)效關(guān)系研究加以闡明。

參 考 文 獻(xiàn)

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收稿日期：2022-11-14

基金項(xiàng)目：四川省科技廳杰出青年科技基金項(xiàng)目（No. 2021JDJQ0042）；成都大學(xué)高層次人才培育項(xiàng)目（No. 2081920066）

作者簡(jiǎn)介：湯倩玲，女，生于1997年，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)橄葘?dǎo)化合物開發(fā)，E-mail： tql875@sina.com

*通信作者，E-mail： zhaokelei@cdu.edu.cn