呂曉鳳，孟 武，劉玉濤，張夢夢，盧春玲，李 強(qiáng)，馬春蓮，邱振清，韓云翠，趙巧珍，胥鑫鈺，高紅波

（1.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）生物工程學(xué)院，山東濟(jì)南 250353；2.濟(jì)南趵突泉釀酒有限責(zé)任公司技術(shù)質(zhì)量部，山東濟(jì)南 250115；3.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京 100015）

白酒是我國特有的傳統(tǒng)酒種，更是中國人民智慧的象征。自中國建國以來，芝麻香型白酒一直是中國的創(chuàng)新白酒之一，綜合感官具有焙烤芝麻香的優(yōu)雅細(xì)膩，其生產(chǎn)工藝更是結(jié)合醬香、清香、濃香3種白酒香型的特點(diǎn)，獨(dú)成一家[1]。

芝麻香白酒及其酒醅中存在吡嗪類風(fēng)味組分，吡嗪類風(fēng)味組分主要貢獻(xiàn)為堅(jiān)果香、焙烤香。吡嗪類風(fēng)味組分的香氣閾值高，濃度低，OAV 值較小，但其對(duì)一些白酒起到重要的作用。吡嗪是在1,4 位含氮的六元雜環(huán)化合物，其衍生物在自然界中非常豐富，特別是在食品和飲料中，是一類重要的食品雜環(huán)香料[2-4]。自然界中存在著各種形式的吡嗪類化合物，也是各類香型白酒中均可檢出的一類微量健康成分[5-7]，尤其是在醬香型白酒和芝麻香白酒中含量較多，具有特殊的焦糊香和獨(dú)特的健康功能。四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TTMP）又名川芎嗪，是醬香型、芝麻香型白酒中極其重要的香氣物質(zhì)[8]，有焙烤芝麻、可可等氣味[8-10]，四甲基吡嗪作為川芎的有效藥用成分，在心腦血管方面有顯著效果，同時(shí)作為香料廣泛應(yīng)用于食品調(diào)香中[11-16]。當(dāng)今社會(huì)，人們追求風(fēng)味健康雙導(dǎo)向，在追求風(fēng)味的同時(shí)，更加關(guān)注健康功能[17]。因此，對(duì)于吡嗪風(fēng)味組分的檢測成為主要研究方向。近年來，王佳琳[18]在研究一種格瓦斯飲料的制作時(shí)，創(chuàng)建了一種固相萃取-氣相色譜法來測定四個(gè)主要的吡嗪化合物，并且分析比較3 種萃取頭，得出最佳萃取頭為75 μm CAR/PDMS；程偉[19]在研究馥合香白酒的風(fēng)味特征時(shí)，采用SPME-GC-MS 結(jié)合OAV 進(jìn)行金種子酒的分析與感官評(píng)價(jià)；龍四紅等[17]建立高效液相色譜（HPLC）法測定白酒中8 種吡嗪類化合物含量的方法，并進(jìn)行了方法學(xué)研究；蘇寧等[20]建立了一種測定高溫大曲中吡嗪類化合物含量的方法，采用直接進(jìn)樣法進(jìn)GC-MS，進(jìn)行分析；喬慧等[21]應(yīng)用氣相色譜與NPD 檢測器聯(lián)用技術(shù)，建立了快速測定白酒中吡嗪類化合物的方法；王莉等[22]采用氣相色譜-質(zhì)譜-離子掃描聯(lián)用法快速檢測白酒中4 種吡嗪類化合物。本研究采用直接進(jìn)樣法-GC-MS 對(duì)芝麻香白酒及酒醅中吡嗪類風(fēng)味組分進(jìn)行檢測，總共檢出8 吡嗪類風(fēng)味組分，該方法與固相微萃取相比更加簡潔、高效。

芝麻香白酒及其酒醅中吡嗪類風(fēng)味組分含量與酸、酯、醇類相比，含量甚微，因此其定性定量存在一定程度的困難。本試驗(yàn)采用直接進(jìn)樣-氣相色譜質(zhì)譜法對(duì)芝麻香白酒以及酒醅中的吡嗪類味組分進(jìn)行測定，建立直接進(jìn)樣-氣相色譜質(zhì)譜法快速測定芝麻香白酒以及酒醅中的8 種吡嗪類風(fēng)味組分的方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

試驗(yàn)樣品：芝麻香型白酒，來自濟(jì)南趵突泉釀酒有限責(zé)任公司；酒醅，取自濟(jì)南趵突泉釀酒有限責(zé)任公司芝麻香手工釀造班組入池酒醅。

試劑及耗材：無水乙醇（色譜純）；內(nèi)標(biāo)物：2-甲氧基-3-甲基吡嗪；吡嗪類標(biāo)準(zhǔn)品：2-甲基吡嗪、四甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,3-二乙基吡嗪、2-乙基吡嗪。內(nèi)標(biāo)物與吡嗪類標(biāo)準(zhǔn)品，純度均為99.9%，均購于百靈威科技有限公司。

儀器設(shè)備：氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（安捷倫7890 A-5975 C)；恒溫磁力攪拌器；磁力轉(zhuǎn)子；移液槍；秒表；FA2004 精密電子天平，天津天馬衡基儀器有限公司；UPR 超純水機(jī)，四川優(yōu)普超純科技有限公司；KQ2200E 超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 氣相色譜分析條件（表1）

表1 氣相色譜分析條件

1.2.2 質(zhì)譜條件(表2)

表2 質(zhì)譜分析條件

1.2.3 溶液配制

1.2.3.1 吡嗪類混標(biāo)儲(chǔ)備溶液（100 mg/L)

準(zhǔn)確稱取2-甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2，3，5-三甲基吡嗪、2,3-二乙基吡嗪、四甲基吡嗪標(biāo)準(zhǔn)品各0.01 g（精確至0.0001 g）于容量瓶中，使用無水乙醇定容至100 mL，配制成100 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.2.3.2 吡嗪類混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（10 mg/L)

準(zhǔn)確吸取10 mL吡嗪類混標(biāo)儲(chǔ)備溶液（100 mg/L)于100 mL容量瓶中，用無水乙醇溶液定容至100 mL，配制成10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。

1.2.3.3 2-甲氧基-3-甲基吡嗪內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液（100 mg/L)

準(zhǔn)確稱取0.01 g（精確至0.0001 g）2-甲氧基-3-甲基吡嗪標(biāo)品于100 mL 容量瓶中，用無水乙醇溶液定容，配制成濃度為100 mg/L 的2-甲氧基-3-甲基吡嗪內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液。

1.2.3.4 2-甲氧基-3-甲基吡嗪內(nèi)標(biāo)使用液（10 mg/L)

準(zhǔn)確吸取10 mL 2-甲氧基-3-甲基吡嗪內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液（100 mg/L)于100 mL容量瓶中，用無水乙醇定容，配制成濃度為10 mg/L 的2-甲氧基-3-甲基吡嗪內(nèi)標(biāo)使用液。

1.2.3.5 吡嗪類混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

分別取適量吡嗪類混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于容量瓶中，用無水乙醇溶液定容混勻，逐級(jí)稀釋成一系列的標(biāo)準(zhǔn)梯度濃度，待用。

1.2.4 樣品前處理

1.2.4.1 芝麻香白酒樣品

準(zhǔn)確吸取芝麻香白酒1 mL，加入100 μL 2-甲氧基-3-甲基吡嗪內(nèi)標(biāo)溶液(10 mg/L)，壓緊瓶蓋后，快速搖勻器進(jìn)行搖勻。

1.2.4.2 芝麻香酒醅樣品

取酒醅5 g，加15%無水乙醇（色譜純）30 mL，超聲30 min，10000 r/min 離心5 min，離心后經(jīng)0.22 μm 無機(jī)濾膜進(jìn)行過濾，吸取1 mL 濾液放入進(jìn)樣瓶中，加入100 μL 2-甲氧基-3-甲基吡嗪內(nèi)標(biāo)溶液(10 mg/L)，壓緊瓶蓋后，快速搖勻器進(jìn)行搖勻。

1.2.5 定性定量方法

定性：SCAN 模式下，使用NIST 08 標(biāo)準(zhǔn)光譜庫進(jìn)行定性，以確定被監(jiān)測離子的參數(shù)。

定量：根據(jù)SCAN 檢測模式得到的離子檢測參數(shù)，建立SIM 檢測模式，利用內(nèi)標(biāo)-標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

1.2.6 檢出限、精密度、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

以信噪比S/N 為3，計(jì)算出方法的檢出限；在同一試樣中分別加入3 個(gè)不同濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)；每個(gè)濃度分別做6 個(gè)平行樣品，以6 個(gè)平行樣品實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，作為該方法的精密度（relative standard deviation,RSD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)品、樣品的定性定量檢測分析

通過表3 的定性定量分析，確定了8 種吡嗪類化合物的定量離子，通過保留時(shí)間與定量離子，建立8 種吡嗪類化合物的SIM 檢測模式，根據(jù)內(nèi)標(biāo)法，建立吡嗪類風(fēng)味組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中，芝麻香白酒中8種吡嗪類化合物色譜圖見圖1。

圖1 芝麻香白酒中8種吡嗪類化合物色譜圖

表3 8種吡嗪類風(fēng)味組分監(jiān)測離子參數(shù)

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢出限

所制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液在最佳色譜條件下進(jìn)行分析，以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到8 種吡嗪類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)見表4。

表4 8種吡嗪類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)

由表4 可知，在100～5000 μg/L 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)R2均在0.999以上，符合準(zhǔn)確定量的要求。

2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)以及加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

取芝麻香白酒樣品，檢測吡嗪類風(fēng)味組分含量，根據(jù)測定含量分別加入250 μg/L、500 μg/L、1000 μg/L 濃度的吡嗪標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度分別做6 個(gè)平行樣品，以6 個(gè)平行樣品實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，作為該方法的精密度（relative standard deviation,RSD)，結(jié)果見表5。

表5 方法的精密度及回收率試驗(yàn)結(jié)果

由表5 可知，8 種吡嗪類風(fēng)味組分的RSD≤10，結(jié)果證實(shí)該方法具有良好的重現(xiàn)性；8 種吡嗪類風(fēng)味組分的平均回收率在87%～110%之間，表明該方法是可行的，因此可以滿足本研究中對(duì)芝麻香白酒中吡嗪類風(fēng)味組分測定的實(shí)驗(yàn)要求。

2.4 樣品檢測-驗(yàn)證性分析實(shí)驗(yàn)

用所建立的方法對(duì)六個(gè)芝麻香白酒樣品以及堆積過程中酒醅吡嗪類風(fēng)味組分含量進(jìn)行測定，結(jié)果見表6、表7。

表6 芝麻香白酒酒樣中吡嗪類風(fēng)味組分的測定

表7 堆積過程吡嗪類風(fēng)味組分的測定

由表6 可知，從吡嗪類風(fēng)味組分總量分析，2#酒樣遠(yuǎn)高于其他酒樣，然后依次是3#和4#酒樣、6#酒樣，1#酒樣和5#酒樣的含量相對(duì)較低。1#酒樣中總的含量最低，除2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪含量相對(duì)較高，其他物質(zhì)都很少。2#酒樣中除2,5-二甲基吡嗪外，其他吡嗪均高于其他酒樣，尤其是2,3-二甲基吡嗪高于其他酒樣。3#酒樣中四甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪含量較為突出。4#酒樣中2,5-二甲基吡嗪的含量高于其他酒樣，另外2,3,5-三甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪含量較高。5#酒樣中四甲基吡嗪含量較高，2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪均為220～270 μg/L。6#酒樣無論從總量還是各類吡嗪的含量而言，與4#酒樣比較接近。

堆積過程中，芝麻香酒釀造原料含氮量高，采用高溫大曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵、高溫餾酒的生產(chǎn)工藝，有利于美拉德反應(yīng)的發(fā)生，所以含氮化合物含量高，特別是吡嗪類化合物含量高[23]。但是表7結(jié)果反映出在堆積過程中，除了2,5-二甲基吡嗪和2-甲基吡嗪有較為明顯的升高，其他吡嗪類并沒有顯著提高。推測可能由于堆積時(shí)間短，美拉德反應(yīng)未完全進(jìn)行或只產(chǎn)生部分前體物質(zhì)。結(jié)果表明，該方法可以用于芝麻香白酒以及酒醅中8 種吡嗪類化合物的快速檢測。

3 結(jié)論

基于直接進(jìn)樣-氣相色譜質(zhì)譜法，快速測定芝麻香白酒及其酒醅中8 種吡嗪類化合物，結(jié)果表明，8 種吡嗪線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999，方法最低檢出限為10 μg/L，加標(biāo)回收率為87%～116%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3 %～10 %。該方法采用內(nèi)標(biāo)法定量，準(zhǔn)確度高、精密度好，可用于芝麻香白酒以及酒醅中吡嗪類風(fēng)味組分的常規(guī)檢測。

堆積過程是一個(gè)開放式的發(fā)酵過程，可以網(wǎng)羅空氣中的微生物進(jìn)行聯(lián)合發(fā)酵。2,5-二甲基吡嗪和2-甲基吡嗪有較為明顯的升高，其他吡嗪類并沒有顯著提高，推測可能由于堆積時(shí)間短，美拉德反應(yīng)未完全進(jìn)行或只產(chǎn)生部分前體物質(zhì)，后續(xù)可以進(jìn)行具體機(jī)理的深入研究。