【摘 要】亨廷頓病是一種常染色體顯性遺傳病，近年來(lái)多項(xiàng)針對(duì)mRNA水平的干預(yù)策略相繼開(kāi)展臨床試驗(yàn)，同時(shí)隨著聚集的規(guī)律性間隔短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspersed short palindromic repeats，CRISPR）/CRISPR關(guān)聯(lián)基因（CRISPR associatedgene，Cas）系統(tǒng)的日漸成熟，針對(duì)致病基因組的基因編輯策略也屢有報(bào)道。本文將圍繞亨廷頓病基因治療的臨床現(xiàn)狀、研究進(jìn)展、臨床評(píng)估的改進(jìn)做簡(jiǎn)要綜述。

【關(guān)鍵詞】亨廷頓?。换蛑委?；反義寡核苷酸；基因編輯

【中圖分類(lèi)號(hào)】R745 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2024-01-26

亨廷頓?。℉untington’s disease，HD）是一種以舞蹈樣動(dòng)作、智力減退和精神行為異常為主要臨床表現(xiàn)的中年起病且逐漸進(jìn)展的常染色體顯性遺傳病[1]。該疾病的致病突變是4號(hào)染色體上亨廷頓基因（Huntingtin，HTT）第一號(hào)外顯子CAG三聯(lián)密碼子重復(fù)序列的異常擴(kuò)增（CAGgt;40）。CAG密碼子編碼谷氨酰胺，野生型亨廷頓蛋白含有一定長(zhǎng)度的多聚谷氨酰胺，其本身并不具有毒性。CAG重復(fù)序列異常擴(kuò)增導(dǎo)致HTT編碼的突變HTT蛋白（mutant HTT，mHTT）中多聚谷氨酰胺長(zhǎng)度超過(guò)一定限度，使其傾向于形成聚集體，最終在細(xì)胞核內(nèi)聚集形成包涵體，引起典型的病理改變[2]。盡管HD的致病基因和突變形式已明確30年之久，但目前仍缺乏能夠阻止疾病發(fā)生和發(fā)展的治療方法。

由于亨廷頓病是由基因突變引起的，因此“基因治療”成為研發(fā)HD疾病修飾治療（disease modified therapy，DMT）的主要策略。一般而言，以致病基因?yàn)榘悬c(diǎn)，通過(guò)糾正基因異常功能的治療均可稱(chēng)為基因治療（gene therapy）。根據(jù)基因突變后獲得致病功能（gain of function）或者失去正常功能（loss of function），可針對(duì)性地給予基因沉默（gene silencing）或基因替代（gene replacement）治療，或更進(jìn)一步地通過(guò)基因編輯（gene editing）糾正突變基因本身[3]。由于HD的致病突變屬于gain of function，因此現(xiàn)在在臨床嘗試的基因治療策略均為沉默突變HTT基因，相應(yīng)的基因編輯策略尚處于實(shí)驗(yàn)室階段。本文將簡(jiǎn)要綜述HD基因治療的臨床現(xiàn)狀、研究進(jìn)展和臨床評(píng)估的改進(jìn)。

1 HD基因治療的臨床現(xiàn)狀

由于致病基因明確，病情逐漸加重并嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量及生命，HD、脊髓性肌萎縮、杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良等疾病的基因治療一直處于神經(jīng)病領(lǐng)域的前沿，各類(lèi)創(chuàng)新的技術(shù)和策略多在這類(lèi)疾病中首先開(kāi)展嘗試。

理想狀態(tài)下，治療性物質(zhì)可通過(guò)系統(tǒng)吸收，透過(guò)血腦屏障，發(fā)揮功能，例如小分子藥物PTC518。但大部分治療性物質(zhì)并不具備血腦屏障透過(guò)性，因此更多的嘗試是為了提高其在腦組織中的有效濃度，或通過(guò)直接連接腦靶向肽、或通過(guò)鞘內(nèi)注射的方式繞過(guò)血腦屏障，或者使用載體將治療性物質(zhì)進(jìn)行定向遞送。就基因沉默策略而言，目前優(yōu)化改進(jìn)的重點(diǎn)是遞送載體。

遞送載體可病毒載體和非病毒載體。目前常用的病毒載體有慢病毒和各種血清型的腺相關(guān)病毒，優(yōu)勢(shì)是能夠介導(dǎo)外源基因持續(xù)表達(dá)，優(yōu)化血清型可獲得理想的組織特異性，目前已有成熟的工業(yè)化生產(chǎn)流程[4]。但是由于中和抗體的存在，無(wú)法多次給藥[5]，仍存在外源序列插入到基因組，有潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)。雖然AAV療法已廣泛使用在多種疾病，但目前仍可見(jiàn)多例嚴(yán)重不良事件報(bào)道[6]。而非病毒載體則是各種外泌體或者納米顆粒，這類(lèi)遞送載體的組織相容性好，無(wú)排異反應(yīng)，多次給藥有效；此外外源序列不會(huì)插入到基因組，相對(duì)安全；對(duì)靶基因的調(diào)控相對(duì)可控[7]。然而該類(lèi)載體涉及大量構(gòu)件的體外合成和裝載，中間環(huán)節(jié)繁多、不可控，成本高昂，目前仍缺乏相應(yīng)的行業(yè)或行政規(guī)范[8]。

目前各種策略在HD中均有開(kāi)展嘗試，現(xiàn)分述如下。

1.1 反義寡核苷酸（antisense oligonucleotides，ASOs）

反義寡核苷酸是一種合成的單鏈DNA或RNA，可以與相應(yīng)的mRNA形成雜交復(fù)合物，并通過(guò)募集核糖核酸酶H導(dǎo)致mRNA降解。根據(jù)ASO設(shè)計(jì)靶向序列的不同，可分為同時(shí)靶向野生型和突變型HTT mRNA 的非等位基因特異性（non-allele specific）ASOs，以及對(duì)mHTT mRNA有較高靶向特異性的等位基因特異性（allele specific）ASOs。

Tominersen（IONIS-HTTRx或RG6042）是由Roche和Ionis制藥公司合作研發(fā)的，能夠同時(shí)靶向野生型和突變型HTT mRNA的非等位基因特異性ASOs。其Ⅰ/Ⅱa期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，Tominersen鞘內(nèi)注射能夠有效降低HD患者腦脊液中mHTT蛋白水平，并呈劑量依賴(lài)性降低。在90 mg和120 mg劑量組的受試者中觀察到腦脊液mHTT水平較基線(xiàn)降低約40%（NCT02519036）[9]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中的預(yù)測(cè)結(jié)果，腦脊液mHTT 降低40% 大概相當(dāng)于mHTT 分別在大腦皮層和尾狀核降低55%～85%和20%～50%。然而，隨后進(jìn)行的Ⅲ期臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)120 mg劑量組的參與者在運(yùn)動(dòng)功能和認(rèn)知能力等臨床癥狀方面較安慰劑組明顯惡化，且出現(xiàn)NfL的升高（NCT03761849），因此該項(xiàng)目提前終止[10]。亞組分析提示較為年輕、疾病負(fù)荷較低的HD 患者可能能夠在較低劑量、較長(zhǎng)間隔的給藥中獲益[11]。2023 年初，羅氏啟動(dòng)了新的2期臨床試驗(yàn)（GENERATION HD2），旨在探索不同劑量Tominersen（60 mg、100 mg）每16 周1 次給藥的療效（NCT05686551）。

在HTT基因中，特定單核苷酸多態(tài)性（single nucleotidepolymorphism，SNP）變異在CAG 擴(kuò)增的等位基因上高頻出現(xiàn)[12]。因此，Wave Life Sciences和武田公司共同開(kāi)發(fā)了3種可能具有等位基因特異性的ASOs。其中針對(duì)rs362307（WVE-120101）、rs362331（WVE-120102）的ASOs 已完成1b/2a 期臨床試驗(yàn)（PRECISION-HD1 和PRECISION-HD2，NCT03225833，NCT03225846），以評(píng)估其耐藥性、藥代動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)和安全性。然而這2種ASO在鞘內(nèi)注射后，并未能降低腦脊液中mHTT，因此試驗(yàn)被提前終止。另一種等位基因特異性ASO-WVE-003，針對(duì)一個(gè)未公開(kāi)的SNP 位點(diǎn)（SNP3）。WVE-003在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，能夠降低HD模型小鼠50%的mHTT，且治療效果持續(xù)3個(gè)月。該藥物于2021年開(kāi)始I期臨床試驗(yàn)，預(yù)計(jì)于2024年12月結(jié)束（NCT05032196）。目前相關(guān)中期報(bào)告顯示，WVE-003的30 mg和60 mg劑量組在給藥85 d后，腦脊液中mHTT的含量較基線(xiàn)水平降低約22%，而腦脊液中wt HTT的水平保持不變，表現(xiàn)出良好的等位基因特異性。類(lèi)似WVE-120101和WVE-120102這樣的等位基因特異性ASOs，主要依賴(lài)等位基因之間僅有一個(gè)核苷酸錯(cuò)配來(lái)區(qū)分突變型和野生型基因。理論上，核苷酸錯(cuò)配數(shù)目越多，等位基因之間的區(qū)分效率越高。因此，插入缺失多態(tài)性（indel）也是一個(gè)值得關(guān)注的靶點(diǎn)，因?yàn)椴迦肴笔Ф鄳B(tài)性可以在HTT等位基因之間引入2～17個(gè)核苷酸的差異[13]。ASO-WVE-003 靶向的未公開(kāi)SNP3 可能就屬于這類(lèi)多態(tài)性。此外，目前的臨床試驗(yàn)主要依賴(lài)鞘內(nèi)注射，這限制了ASOs的應(yīng)用。因此，尋找更便捷的途徑使ASO能夠到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)是研發(fā)的一個(gè)重要方向。

此外，Vico Therapeutics的VO659也是一種正在進(jìn)行HD的臨床試驗(yàn)且具有等位基因特異性的ASOs。VO659的具體的結(jié)構(gòu)和修飾方式尚未公布，通過(guò)鞘內(nèi)注射給藥。不同于其他ASOs，VO659 通過(guò)靶向CAG 重復(fù)序列來(lái)識(shí)別、降解mRNA，對(duì)存在CAG擴(kuò)增的等位基因具有較高的特異性，理論上可能對(duì)SCA1、SCA3 和HD 等CAG 擴(kuò)增疾病有效。目前，VO659的I/IIa開(kāi)放標(biāo)簽、劑量遞增試驗(yàn)正在進(jìn)行，旨在探討藥物在早期HD患者、輕中度SCA1、SCA3患者中的安全性和耐受性（NCT05822908）。

1.2 AMT-130

AMT-130是由uniQure開(kāi)發(fā)的一種非等位基因特異性基因療法。該療法需要通過(guò)神經(jīng)外科立體定位注射，將血清型5 腺相關(guān)病毒載體（Adeno-associated virus serotype 5，AAV5）注射至HD患者雙側(cè)尾狀核和殼核，以介導(dǎo)miRNA在局部表達(dá)，從而干擾HTT基因的翻譯[14]。

早前該項(xiàng)目招募了36例HD患者進(jìn)行了1項(xiàng)Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)（NCT04120493），并繼續(xù)進(jìn)行開(kāi)放標(biāo)簽延長(zhǎng)試驗(yàn)（NCT05243017），以觀察AMT-130的安全性、耐受性和有效性，預(yù)計(jì)將于2029年完成。根據(jù)2023年12月uniQure的信息披露，AMT-130兩個(gè)劑量組（低劑量組n=13，高劑量組n=20）治療整體耐受性良好。在給藥后24個(gè)月內(nèi)，觀察到在UHDRS綜合評(píng)分、運(yùn)動(dòng)及認(rèn)知量表中均有較預(yù)測(cè)自然病程改善的趨勢(shì)，其中高劑量組的改善更為明顯。然而，由于對(duì)照組缺乏對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)，AMT-130的臨床療效仍待進(jìn)一步確認(rèn)。

對(duì)應(yīng)的影像學(xué)及生物標(biāo)志物結(jié)果與臨床評(píng)估不一致。低劑量組AMT-130在治療后3～9個(gè)月觀察到mHTT相較基線(xiàn)降低約40%，30個(gè)月觀察到腦脊液NfL降低至基線(xiàn)水平以下。然而，高劑量組AMT-130截至目前仍未觀察到mHTT和NfL較基線(xiàn)水平明顯地降低。研究者認(rèn)為這種差異可能源于2個(gè)劑量組受試者基線(xiàn)mHTT水平的較大差異，并且由于AMT-130的給藥方式為基底節(jié)定位注射，治療范圍相對(duì)較為局限，NfL和mHTT未能靈敏反映治療效果[15]。

1.3 PTC518

相較于需要鞘內(nèi)注射的ASOs以及腦定位注射的AAV，由PTC公司研發(fā)的，能夠影響HTT pre-mRNA剪接的小分子化合物PTC518，因其通過(guò)口服給藥而受到更廣泛的關(guān)注。PTC518干擾HTT pre-mRNA剪接，通過(guò)引入假外顯子而最終使HTT mRNA被降解以達(dá)到治療效果[16]。在2022年3月，PTC啟動(dòng)了1項(xiàng)Ⅱ期臨床研究，旨在評(píng)估PTC518在162例患者中的安全性和有效性（NCT053588717）。盡管該研究曾在2022年10月被FDA叫停，要求提供更多證據(jù)，但研究仍在歐洲及澳大利亞繼續(xù)進(jìn)行。根據(jù)2023年6月PTC發(fā)布的中期數(shù)據(jù)（安慰劑組n=9，PTC518 5 mg組n=11，PTC518 10 mg組n=13），PTC518整體表現(xiàn)出良好的耐受性，未見(jiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)，并且藥物在腦脊液和血漿中的濃度相當(dāng)，表現(xiàn)出良好的血腦屏障透過(guò)性。在治療后12周，PTC518能夠劑量依賴(lài)性地降低外周血液中HTT的蛋白和mRNA水平，降低幅度可達(dá)30%。腦脊液中NfL在治療后12周也呈現(xiàn)5%～9%的下降趨勢(shì)，但腦脊液中mHTT的數(shù)據(jù)尚未報(bào)道。目前整體研究情況較為積極，計(jì)劃在招募患者的基礎(chǔ)上進(jìn)行更長(zhǎng)周期的臨床試驗(yàn)[17]。

另外，最初用于治療脊肌萎縮癥的小分子藥物L(fēng)MI070（Branaplam），因其能減少Htt 蛋白[18]，在2022 年也針對(duì)HD開(kāi)始了Ⅱ期臨床試驗(yàn)（NCT05111249）。然而，因發(fā)現(xiàn)Branaplam可能導(dǎo)致外周神經(jīng)損害，試驗(yàn)提前中止?？傮w而言，目前小分子化合物因其口服給藥方式的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)以及篩選體系的成熟性而備受關(guān)注，許多學(xué)者和企業(yè)都在積極探索不同化合骨架的小分子化合物用于治療HD。

1.4 ER2001

目前國(guó)內(nèi)也在HD基因治療上作出創(chuàng)新的嘗試。南京大學(xué)自主研發(fā)出能夠靶向人HTT基因的核酸藥物ER2001注射液（簡(jiǎn)稱(chēng)ER2001）。ER2001注射液的活性成分為環(huán)狀雙鏈DNA。通過(guò)靜脈輸注后，ER2001被肝臟吸收，驅(qū)動(dòng)表達(dá)包含miR-155骨架的靶向HTT siRNA和RVG-Lamp2b融合蛋白。RVG-Lamp2b融合蛋白可組裝至外泌體膜上，而HTT siRNA則通過(guò)miR-155的體內(nèi)剪接機(jī)制被包裝至RVG標(biāo)記的外泌體中。含有siRNA的外泌體通過(guò)循環(huán)系統(tǒng)遞送，在RVG標(biāo)簽的引導(dǎo)下穿透血腦屏障，到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，降解HTT mRNA[19]。

目前，ER2001正在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院開(kāi)展一項(xiàng)開(kāi)放標(biāo)簽的劑量遞增臨床試驗(yàn)，以評(píng)估其在HD患者中的安全性、耐受性和有效性。目前已招募了7例HD患者，涉及4個(gè)不同的劑量組（0.04、0.08、0.16、0.32 mg/kg）。截至目前，該研究觀察到36例次的不良反應(yīng)，其中與藥物相關(guān)的不良反應(yīng)主要涉及心臟、肝功能和脂代謝，嚴(yán)重程度輕微，大部分無(wú)須醫(yī)療干預(yù)或在無(wú)醫(yī)療干預(yù)下自行好轉(zhuǎn)。此外，研究還對(duì)治療后的運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知功能進(jìn)行了評(píng)估。受試者在給藥后8周UHDRS（統(tǒng)一亨廷頓運(yùn)動(dòng)評(píng)分）和認(rèn)知量表評(píng)估中表現(xiàn)穩(wěn)定，較基線(xiàn)有改善的趨勢(shì)。然而，由于缺乏安慰劑組及自然病程預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)，臨床療效仍待進(jìn)一步臨床試驗(yàn)明確。目前相關(guān)的影像學(xué)和生物標(biāo)志物結(jié)果仍需集中分析和統(tǒng)計(jì)。

1.5 臨床試驗(yàn)現(xiàn)狀總結(jié)

任何可能能夠干預(yù)HD疾病病程的嘗試都是值得鼓勵(lì)的，然而目前現(xiàn)有的試驗(yàn)藥物距離臨床應(yīng)用還有相當(dāng)大的距離。現(xiàn)將目前相關(guān)臨床試驗(yàn)嘗試的優(yōu)缺點(diǎn)見(jiàn)表1。

2 HD基因治療的治療策略進(jìn)展

聚集的規(guī)律性間隔短回文重復(fù)序列（clustered regularlyinterspersed short palindromic repeats，CRISPR）和CRISPR 關(guān)聯(lián)基因（CRISPR associated gene，Cas）使細(xì)菌免疫系統(tǒng)能夠識(shí)別和破壞外源DNA，目前CRISPR/Cas系統(tǒng)被廣泛用于真核生物的基因調(diào)控。CRISPR/Cas也是HD基因治療目前的主流發(fā)展方向，根據(jù)其是否產(chǎn)生DNA 雙鏈斷裂（doublestrand break，DSB），分為DSB型和非DSB型。

2.1 DSB型CRISPR/Cas策略

DSB型是Cas9核酸酶在gRNA引導(dǎo)下與目標(biāo)DNA序列結(jié)合，誘導(dǎo)雙鏈斷裂，雙鏈斷裂大概率通過(guò)錯(cuò)誤同源端連接修復(fù)，導(dǎo)致移碼突變，引起基因失活，小概率通過(guò)以另外一條等位基因?yàn)槟０暹M(jìn)行直接同源修復(fù)。來(lái)自Roche Tominersen臨床試驗(yàn)的研究結(jié)果提示野生型HTT可能具有重要作用，因此基因編輯應(yīng)當(dāng)具有較高的等位基因特異性。

由于Cas9核酸酶斷裂雙鏈需要PAM位點(diǎn)，而等位基因間SNP的多態(tài)性使等位基因間PAM位點(diǎn)不盡相同，為Cas9實(shí)現(xiàn)等位基因特異性編輯提供了可能（圖1）[20]。第一種，由于部分SNP位點(diǎn)位于外顯子，在該SNP位點(diǎn)雜合可能在突變的等位基因上形成可供Cas9結(jié)合的PAM位點(diǎn)（野生型等位基因無(wú)），從而實(shí)現(xiàn)等位基因特異性。一旦通過(guò)PAM識(shí)別突變的等位基因，Cas9切割DNA雙鏈，導(dǎo)致隨機(jī)同源重組，進(jìn)而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄本的無(wú)以降解，實(shí)現(xiàn)臨床治療。第二種則利用存在于exon 1在5'啟動(dòng)子序列以及3'端內(nèi)含子上的SNP，使得等位基因間PAM 存在差異，能夠更具選擇性地將擴(kuò)增的exon 1剪切，并且有可能以正常等位基因?yàn)槟０暹M(jìn)行修復(fù)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)突變HTT的糾正[21]。該項(xiàng)策略擁有多個(gè)可供選擇的位點(diǎn)，且人群中雜合頻率較高，預(yù)測(cè)多種組合能夠覆蓋80% 以上的HD 患者，應(yīng)該是未來(lái)重點(diǎn)的發(fā)展方向。隨著Cas9蛋白功能日益明確，多種Cas9蛋白的變種也在驗(yàn)證中，能夠提供各種各樣的PAM限制，且具更高的保真度，將為后續(xù)設(shè)計(jì)研究靶點(diǎn)提供更大的空間[22]。

另外一種DSB策略則是將gRNA設(shè)計(jì)在exon1 CAG重復(fù)序列的交界處，研究發(fā)現(xiàn)特定的gRNA能夠使得突變基因擴(kuò)增的CAG重復(fù)序列縮短，其中25%的CAG縮短沒(méi)有引入移碼突變，另外75%存在移碼突變[23]。該策略的若能進(jìn)一步改進(jìn)有望實(shí)現(xiàn)真正的基因治療。

2.2 非DSB型CRISPR/Cas策略

而非DSB 型CRISPR/Cas9 策略主要是指CRISPRi 以及堿基編輯技術(shù)。研究顯示靶向CAG重復(fù)序列的CRISPRi能夠在不引起DNA改變的情況下，更有選擇性地降低mHTT，并且表現(xiàn)出比CRISPR/Cas9更優(yōu)異的行為學(xué)改善，而且對(duì)其他CAG基因的表達(dá)沒(méi)有影響[24]。

此外堿基編輯技術(shù)在HD中也有一定的應(yīng)用前景。HD患者擴(kuò)增的CAG重復(fù)序列中可能會(huì)夾雜有CAA，盡管CAG和CAA都編碼谷氨酰胺，在翻譯產(chǎn)物上沒(méi)有區(qū)別。但是有趣的是，決定起病年齡的是CAA以前連續(xù)的CAG重復(fù)次數(shù)，連續(xù)的CAG重復(fù)次數(shù)與更嚴(yán)重的轉(zhuǎn)錄紊亂、核內(nèi)包涵體聚集以及體細(xì)胞CAG擴(kuò)增相關(guān)[25]。因此，通過(guò)胞嘧啶堿基編輯器（cytosine base editors，CBEs）將CAG轉(zhuǎn)換為CAA可能能夠在盡可能小的基因組改變上使HD患者獲益，目前已有相關(guān)研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行對(duì)應(yīng)研究。

Cas13是CRISPR/Cas系統(tǒng)中的一員，與Cas9不同，Cas13在gRNA 的引導(dǎo)下與特定序列的單鏈RNA 結(jié)合并將其剪切[26]。Cas13切割RNA并不依賴(lài)PAM位點(diǎn)，因此其在gRNA的設(shè)計(jì)上有較高的自由度，能夠更好地優(yōu)化單個(gè)核苷酸錯(cuò)配導(dǎo)致的等位基因特異性[27]。然而與理論不同，研究發(fā)現(xiàn)Cas13能夠通過(guò)靶向CAG重復(fù)序列來(lái)實(shí)現(xiàn)等位基因特異性，等位基因間CAG重復(fù)次數(shù)差異越大，對(duì)擴(kuò)增的等位基因抑制效率越強(qiáng)。定位注射Cas13d病毒載體后，zQ175 HD小鼠模型中mHTT蛋白表達(dá)下調(diào)，癥狀明顯緩解[28]。但是值得注意的是，靶向CAG重復(fù)序列的Cas13d在調(diào)控mHTT的同時(shí)，也可能影響Ataxin1/2/3/7、TBP、atrophin-1等富含多聚谷氨酰胺的蛋白，因此其脫靶效應(yīng)值得進(jìn)一步關(guān)注。

2.3 小結(jié)

值得注意的是，DSB型CRISPR/Cas策略引起的DNA雙鏈斷裂，有一定概率會(huì)導(dǎo)致染色體重排或缺失[29]，盡管相關(guān)技術(shù)已在不斷優(yōu)化，力圖降低發(fā)生的概率[30]。就此而言，非DSB型CRISPR/Cas策略擁有著較高的安全性。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中全身性使用HD相關(guān)基因編輯策略（靜脈注射AAV）可影響生殖腺基因組[31]，就此引出一個(gè)倫理問(wèn)題：HD的相關(guān)基因編輯策略能否具有生殖腺的編輯功能？一方面是HD患者有生育健康后代的需求；另一方面不可避免地導(dǎo)致被編輯后代的出生[32]。而限制基因編輯的作用范圍，相應(yīng)的給藥方式（鞘內(nèi)注射、腦內(nèi)注射）無(wú)疑增加受試患者的負(fù)擔(dān)，也有可能導(dǎo)致療效不佳。此外相關(guān)的復(fù)雜倫理問(wèn)題也必然會(huì)為相應(yīng)的臨床試驗(yàn)申報(bào)帶去繁多的手續(xù)和討論。

總體而言，隨著CRISPR/Cas策略的不斷優(yōu)化，HTT基因編輯迎來(lái)了多種可能的策略。然而，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的應(yīng)用仍然面臨較大的限制。給藥載體是另一個(gè)需要進(jìn)一步優(yōu)化的方向[33]。然而，由于Cas9蛋白相對(duì)較大，如何提高載體的裝載效率，以實(shí)現(xiàn)更高效的基因編輯，仍需要更多的努力和研究。這一領(lǐng)域的進(jìn)展將為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供更可行的方案。

3 HD基因治療的評(píng)估進(jìn)展

3.1 生物標(biāo)志物評(píng)估

CSF 中的mHTT 作為與HD 病程密切相關(guān)的生物標(biāo)志物，在基因治療的療效評(píng)估中起著重要作用。然而，隨著對(duì)CSF mHTT廣泛應(yīng)用和認(rèn)識(shí)的不斷深入，其地位值得進(jìn)一步評(píng)估。

目前的實(shí)踐中觀察到，一些臨床發(fā)病患者的CSF mHTT水平低于定量區(qū)間，因此更加靈敏、可靠的mHTT檢測(cè)技術(shù)仍具有極大的應(yīng)用前景[34]。此外，CSF mHTT被認(rèn)為是由神經(jīng)元分泌，經(jīng)由腦類(lèi)淋巴途徑進(jìn)入腦脊液，并被主動(dòng)清除出腦。因此，CSF mHTT的含量可能受多種因素的影響，但目前缺乏研究評(píng)估各種因素對(duì)個(gè)體CSF mHTT的影響[35]。

隨著治療策略的改善，如口服給藥、靜脈給藥等相對(duì)無(wú)創(chuàng)的實(shí)施，使得腰穿的實(shí)施和次數(shù)成為臨床試驗(yàn)中最令受試者顧慮的環(huán)節(jié)。因此，如何使用外周體液組織評(píng)估中樞神經(jīng)系統(tǒng)HTT降低的效果成為當(dāng)前研究的熱門(mén)方向。

Amber Southwell的團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元分泌的細(xì)胞外囊泡中含有HTT蛋白，主要集中在血漿和腦脊液的ectosomes而非exosomes中。與之對(duì)應(yīng)的，人血漿細(xì)胞外囊泡上存在神經(jīng)元的表面標(biāo)志物ATP1A3以及L1CAM。血漿中神經(jīng)元來(lái)源的ectosomes中的mHTT水平有望成為未來(lái)無(wú)創(chuàng)評(píng)估中樞神經(jīng)系統(tǒng)HTT降低療效的可能策略。這一發(fā)現(xiàn)為非侵入性評(píng)估治療效果提供了新的方向。

3.2 影像標(biāo)志物應(yīng)用

結(jié)構(gòu)MRI在各種HD相關(guān)的臨床研究中得到廣泛應(yīng)用，其主要目標(biāo)是評(píng)估HD患者腦組織萎縮速率以及監(jiān)控可能的不良事件。然而，目前尚未發(fā)現(xiàn)其他影像標(biāo)志物被用于評(píng)估基因治療策略對(duì)腦功能的影響。鑒于MRI的無(wú)創(chuàng)性，其在HD臨床試驗(yàn)中的應(yīng)用值得被更廣泛地推廣。

HD腦組織中存在腦血管結(jié)構(gòu)及功能異常，神經(jīng)元功能異常也將導(dǎo)致其對(duì)局部血流調(diào)控出現(xiàn)障礙。Klinkmueller P等[36]研究發(fā)現(xiàn)，腦小動(dòng)脈血流體積（arteriolar cerebral bloodvolumes，CBVa）的升高是HD腦組織早期的變化。在小鼠中實(shí)現(xiàn)基因調(diào)控后，相應(yīng)的CBVa改變甚至早于行為學(xué)改善，這項(xiàng)技術(shù)值得在臨床試驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證[37]。

正如前文所述，mHTT在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中經(jīng)歷了主動(dòng)清除機(jī)制，而目前已有證據(jù)提示HD患者腦組織中清除機(jī)制的相關(guān)結(jié)構(gòu)存在異常，并與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)[38]。因此對(duì)相應(yīng)的腦類(lèi)淋巴功能進(jìn)行評(píng)估在將來(lái)納入臨床試驗(yàn)中將變得十分必要。這將有助于更好地解讀腦脊液中mHTT水平的結(jié)果[39]。

4 總結(jié)與展望

目前對(duì)HD的自然病程仍無(wú)有效的干預(yù)手段，但越來(lái)越多的治療策略在HD治療領(lǐng)域中開(kāi)展嘗試。希望能盡早研發(fā)出安全、有效的HD治療策略，并且便捷、精準(zhǔn)地進(jìn)行療效評(píng)價(jià)，最大程度上地讓HD患者及其家庭獲益。

參考文獻(xiàn)

[1] McColgan P，Tabrizi SJ. Huntington's disease：a clinical review[J].Eur J Neurol，2018，25（1）：24-34．

[2] Tabrizi SJ，F(xiàn)lower MD，Ross CA，et al. Huntington disease：new insightsinto molecular pathogenesis and therapeutic opportunities[J]. NatRev Neurol，2020，16（10）：529-546．

[3] Chancellor D，Barrett D，Nguyen-Jatkoe L，et al. The state of celland gene therapy in 2023[J]. Mol Ther，2023，31（12）：3376-3388．[4] Ling QL，Herstine JA，Bradbury A，et al. AAV-based in vivo genetherapy for neurological disorders[J]. Nat Rev Drug Discov，2023，22（10）：789-806．

[5] Schulz M，Levy DI，Petropoulos CJ，et al. Binding and neutralizinganti-AAV antibodies：detection and implications for rAAV-mediatedgene therapy[J]. Mol Ther，2023，31（3）：616-630．

[6] Lek A，Wong B，Keeler A，et al. Death after high-dose rAAV9gene therapy in a patient with duchenne's muscular dystrophy[J]. N EnglJ Med，2023，389（13）：1203-1210．

[7] Mondal J，Pillarisetti S，Junnuthula V，et al. Hybrid exosomes，exosome-like nanovesicles and engineered exosomes for therapeutic applications[J]. J Control Release，2023，353：1127-1149．

[8] 馬 躍，鄧 莉，李善剛. 納米粒子在CRISPR/Cas9基因治療中的應(yīng)用[J]. 生物工程學(xué)報(bào)，2022，38（6）：2087-2104．

Ma Y，Deng L，Li SG. Application of nanoparticles in CRISPR/Cas9-based gene therapy[J]. Chin J Biotechnol，2022，38（6）：2087-2104．

[9] Tabrizi SJ，Leavitt BR，Landwehrmeyer GB，et al. Targeting hun‐tingtin expression in patients with Huntington's disease[J]. N Engl JMed，2019，380（24）：2307-2316．

[10] Tabrizi SJ，Estevez-Fraga C，van Roon-Mom WMC，et al. Potentialdisease-modifying therapies for Huntington's disease：lessonslearned and future opportunities[J]. Lancet Neurol，2022，21（7）：645-658．

[11] McColgan P，Thobhani A，Boak L，et al. Tominersen in adultswith manifest Huntington's disease[J]. N Engl J Med，2023，389（23）：2203-2205．

[12] Warby SC，Montpetit A，Hayden AR，et al. CAG expansion in theHuntington disease gene is associated with a specific and targetable predisposinghaplogroup[J]. Am J Hum Genet，2009，84（3）：351-366．

[13] Shin JW，Shin A，Park SS，et al. Haplotype-specific insertiondeletionvariations for allele-specific targeting in Huntington's disease[J]. Mol Ther Methods Clin Dev，2022，25：84-95．

[14] Spronck EA，Vallès A，Lampen MH，et al. Intrastriatal administrationof AAV5-miHTT in non-human Primates and rats is well toleratedand results in miHTT transgene expression in key areas of Huntingtondisease pathology[J]. Brain Sci，2021，11（2）：129．

[15] UniQure. UniQure announces update on phase Ⅰ/Ⅱ clinical trialsof AMT-130 gene therapy for the treatment of Huntington's disease[EB/OL].（ 2023-12-19） [2024-01-26]. https：//uniqure.gcs-web.com/newsreleases/news-release-details/uniqure-announces-update-phase-iiiclinical-trials-amt-130-gene.

[16] Keller CG，Shin Y，Monteys AM，et al. An orally available，brainpenetrant，small molecule lowers huntingtin levels by enhancing pseudoexoninclusion[J]. Nat Commun，2022，13（1）：1150．

[17] PTC Therapeutics. PIVOT-HD interim data update[EB/OL].（2023-06-01）[2024-01-26]. https：//ir.ptcbio.com/static-files/cbaeb42b-4897-40c6-bfba-d0f21eacc4d9.

[18] Estevez-Fraga C，Tabrizi SJ，Wild EJ. Huntington's disease clinicaltrials corner：November 2022[J]. J Huntingtons Dis，2022，11（4）：351-367．

[19] Zhang L，Wu TT，Shan YY，et al. Therapeutic reversal of Huntington'sdisease by in vivo self-assembled siRNAs[J]. Brain，2021，144（11）：3421-3435．

[20] Monteys AM，Ebanks SA，Keiser MS，et al. CRISPR/Cas9 editingof the mutant huntingtin allele in vitro and in vivo[J]. Mol Ther，2017，25（1）：12-23．

[21] Shin JW，Hong EP，Park SS，et al. PAM-altering SNP-basedallele-specific CRISPR-Cas9 therapeutic strategies for Huntington'sdisease[J]. Mol Ther Methods Clin Dev，2022，26：547-561．

[22] Bravo JPK，Liu MS，Hibshman GN，et al. Structural basis for mismatchsurveillance by CRISPR-Cas9[J]. Nature，2022，603（7900）：343-347．

[23] Oura S，Noda T，Morimura N，et al. Precise CAG repeat contractionin a Huntington's Disease mouse model is enabled by gene editingwith SpCas9-NG[J]. Commun Biol，2021，4（1）：771．

[24] Seo JH，Shin JH，Lee J，et al. DNA double-strand break-freeCRISPR interference delays Huntington's disease progression in mice[J]. Commun Biol，2023，6（1）：466．

[25] Gu XF，Richman J，Langfelder P，et al. Uninterrupted CAG repeatdrives striatum-selective transcriptionopathy and nuclear pathogenesisin human Huntingtin BAC mice[J]. Neuron，2022，110（7）：1173-1192.

[26] Cox DBT，Gootenberg JS，Abudayyeh OO，et al. RNA editing withCRISPR-Cas13[J]. Science，2017，358（6366）：1019-1027．

[27] Molina Vargas AM，Sinha S，Osborn R，et al. New design strategiesfor ultra-specific CRISPR-Cas13a-based RNA detection withsingle-nucleotide mismatch sensitivity[J]. Nucleic Acids Res，2024，52（2）：921-939．

[28] Morelli KH，Wu Q，Gosztyla ML，et al. An RNA-targetingCRISPR-Cas13d system alleviates disease-related phenotypes in Huntington'sdisease models[J]. Nat Neurosci，2023，26（1）：27-38．

[29] Leibowitz ML，Papathanasiou S，Doerfler PA，et al. Chromothripsisas an on-target consequence of CRISPR-Cas9 genome editing[J].Nat Genet，2021，53（6）：895-905．

[30] Tsuchida CA，Brandes N，Bueno R，et al. Mitigation of chromosomeloss in clinical CRISPR-Cas9-engineered T cells[J]. Cell，2023，186（21）：4567-4582.

[31] Yan S，Zheng X，Lin YQ，et al. Cas9-mediated replacement of expandedCAG repeats in a pig model of Huntington's disease[J]. NatBiomed Eng，2023，7（5）：629-646．

[32] Coller BS. Ethics of human genome editing[J]. Annu Rev Med，2019，70：289-305．

[33] Yao XG，Lyu P，Yoo K，et al. Engineered extracellular vesicles asversatile ribonucleoprotein delivery vehicles for efficient and safeCRISPR genome editing[J]. J Extracell Vesicles，2021，10（5）：e12076．

[34] Rodrigues FB，Byrne LM，Tortelli R，et al. Mutant huntingtin andneurofilament light have distinct longitudinal dynamics in Huntington'sdisease[J]. Sci Transl Med，2020，12（574）：eabc2888．

[35] Caron NS，Banos R，Yanick C，et al. Mutant huntingtin is clearedfrom the brain via active mechanisms in Huntington disease[J]. J Neurosci，2021，41（4）：780-796．

[36] Klinkmueller P，Kronenbuerger M，Miao XY，et al. Impaired responseof cerebral oxygen metabolism to visual stimulation in Huntington'sdisease[J]. J Cereb Blood Flow Metab，2021，41（5）：1119-1130．

[37] Liu HS，Zhang CC，Xu JD，et al. Huntingtin silencing delays onsetand slows progression of Huntington's disease：a biomarker study[J].Brain，2021，144（10）：3101-3113．

[38] Chan ST，Mercaldo ND，Ravina B，et al. Association of dilatedperivascular spaces and disease severity in patients with Huntington disease[J]. Neurology，2021，96（6）：e890-e894．

[39] Eide PK，Lashkarivand A，Pripp A，et al. Plasma neurodegenerationbiomarker concentrations associate with glymphatic and meningeallymphatic measures in neurological disorders[J]. Nat Commun，2023，14（1）：2084．

（責(zé)任編輯：曾 玲）

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃資助項(xiàng)目（編號(hào)：2022YFA1104900、2022YFA1104904）；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：82071255、82271266、82101330）；廣東省神經(jīng)系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心資助項(xiàng)目（編號(hào)：2020B1111170002）；廣東省神經(jīng)疾病早期干預(yù)及功能修復(fù)研究國(guó)際科技合作基地資助項(xiàng)目（編號(hào)：2020A0505020004）。