劉學(xué)鵬，孫甲樹，張引鋒，孫海燕*

1.陽光融和醫(yī)院骨科，濰坊 261000

2.淄博市第一醫(yī)院骨科，淄博 255200

脊柱融合術(shù)為治療脊柱疾病不可或缺的方法［1］，但融合手術(shù)創(chuàng)傷較大［2］，且易致融合節(jié)段活動功能喪失、融合失敗、鄰近節(jié)段退行性變（ASD）等問題［3］。單純開窗、半椎板切除或椎板切除減壓術(shù)不影響脊柱穩(wěn)定性［4］，但5%～ 40%的患者術(shù)后發(fā)生腰椎不穩(wěn)甚至滑脫、硬膜外粘連和繼發(fā)性椎管狹窄等，甚至發(fā)生下腰椎術(shù)后失敗綜合征（FBSS）［5］。因此，研究預(yù)防椎板切除術(shù)后脊柱不穩(wěn)的材料和手術(shù)方法對改善術(shù)后效果有積極意義。本研究用自體微小骨粒與不同比例的納米羥基磷灰石顆粒修復(fù)全椎板切除術(shù)后的兔椎板缺損，評估其組織相容性及對脊柱穩(wěn)定性的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取48 只4 月齡新西蘭大白兔（山東魯抗實驗動物繁育中心，合格證號：SCXK-2022-0001），雌雄不限，體質(zhì)量4.5～ 5.5 kg，平均分為4組，每組12只：A 組，自體微小骨粒植骨；B 組，自體微小骨粒與納米羥基磷灰石以3∶1 的比例混合后進行植骨；C組，自體微小骨粒與納米羥基磷灰石以1∶1 的比例混合后進行植骨；D 組，空白對照組，僅放置明膠海綿。動物實驗方案及實驗過程均通過濰坊市陽光融和醫(yī)院動物實驗倫理委員會審核批準。

1.2 實驗方法

術(shù)前動物禁食水6 h。用1%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）耳緣靜脈注射麻醉，取俯臥位，以L5/L6為中心，術(shù)野去毛備皮，常規(guī)碘伏消毒皮膚，鋪無菌洞巾，切開皮膚及淺、深筋膜3～ 4 cm，鈍性分離骶棘肌，顯露L5棘突及椎板，咬骨鉗咬除L5棘突及上下棘突間韌帶，1 mm 槍狀椎板咬骨鉗咬除L5，6節(jié)段黃韌帶、L5全部椎板，在咬除椎板過程中需要確保關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)囊完整性，造成骨缺損平均大小為8 mm×6 mm，全椎板切除動物模型建立完成。

用同一手術(shù)切口，牽拉皮緣，暴露其中一側(cè)髂骨，取髂骨（應(yīng)注意保護走行于髂骨近端下方的腰骶神經(jīng)，損傷后會出現(xiàn)下肢癱瘓），去除骨膜和軟骨，用尖嘴咬骨鉗將其咬碎成小骨粒（長寬高均為1～ 2 mm，目測體積與用尖嘴咬骨鉗咬碎的納米羥基磷灰石相仿，盡可能均勻）用作植骨。

選取合適大小明膠海綿捏成薄片狀，放入開窗處，在明膠海綿上方放入骨粒，須覆蓋椎板缺損處，總量約為3 g（將骨顆粒放在無菌單上，置于微量電子秤上稱重）。在植骨前將植骨處（L5，6節(jié)段）椎板去皮質(zhì)化，使其滲血。A 組放入自體微小骨粒；B組自體微小骨粒和納米羥基磷灰石以3∶1 比例放入；C 組自體微小骨粒和納米羥基磷灰石以1∶1 比例放入；D 組只放明膠海綿。徹底止血后，留置引流管1 根并妥善固定，逐層縫合切口。術(shù)后碘伏消毒，無菌紗布包扎。術(shù)后單籠飼養(yǎng)，自由活動、常規(guī)喂食給水，觀察兔的精神狀態(tài)、生命體征、雙下肢感覺運動功能、二便功能、進飲食、體質(zhì)量情況等。

術(shù)前給予頭孢唑啉鈉（13 mg/kg）靜脈注射1次，椎板切除前30 min 給予靜脈注射地塞米松1 mg，術(shù)后給予頭孢唑啉鈉（13 mg/kg）靜脈注射2 次（每24 h 1 次）。

1.3 觀察指標

術(shù)后3 個月每次每組隨機空氣栓塞法處死4 只動物，取出椎板缺損脊柱標本進行手觸檢查、生物力學(xué)檢測及組織切片檢查。

每組標本用10%福爾馬林液固定1 周，再用10%硝酸脫鈣2 周。將1.0 cm 椎板缺損脊柱標本均等分為3 段，分別脫水和石蠟包埋，每段橫切片2枚，厚7～ 10 μm，分別行HE 染色，光鏡觀察植骨區(qū)的成骨情況。

取L4～ S1節(jié)段標本，去除椎旁肌肉，保留韌帶、椎間關(guān)節(jié)和椎間盤，將標本上、下端用骨水泥進行包埋，置于-20℃冰箱保存。測試時解凍，使用CSS-44100 型材料測試機（實驗標準為GB 228-87）軸向加載，在壓頭上加接測試傳感器精確測力，模擬軸向壓縮、屈伸、側(cè)曲運動，每個標本每種測試方式重復(fù)3 次，取平均值，記錄載荷-形變曲線、載荷-位移曲線。同樣方法進行標本的強度和軸向剛度檢測［6-7］。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料以表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

A 組1 只動物因術(shù)后傷口感染死亡；C 組1 只動物不進食后死亡；均于1 周內(nèi)補充。一般術(shù)后第2 天，所有動物均可進飲食，無精神萎靡、煩躁，雙下肢感覺、運動功能正常，二便正常，可站立、行走、搖尾，術(shù)后3 d 可跑、跳。術(shù)后7 d 切口愈合。術(shù)后3個月體質(zhì)量皆有不同程度增加。

2.1 大體觀察

A、B、C 組大體標本新生椎板形態(tài)正常，骨質(zhì)愈合，纖維組織增生連接，骨橋形成，植骨處骨痂愈合良好（圖1a～ c）。D 組為纖維結(jié)締組織愈合（圖1d）。

圖1 大體標本Fig 1 Gross specimen

2.2 組織學(xué)觀察

A 組可見少量幼稚軟骨細胞，較多的成熟軟骨陷窩細胞，過渡性骨小梁排列結(jié)構(gòu)趨于正常，向板層骨過渡，骨髓腔貫通，可見大量髓細胞，無炎性反應(yīng)（圖2a）。B 組自體髂骨與人工骨無明顯相互促進作用，也無抑制作用；可見較少量的幼稚軟骨細胞，以較幼稚的軟骨陷窩細胞為主，無過渡性骨小梁，炎性反應(yīng)基本消失；纖維組織成熟、分化，納米羥基磷灰石孔隙中細胞長入，未完全降解，晶體數(shù)量減少，軟骨成骨更多，且趨向成熟骨（圖2b）。C 組成骨介于A 組與B 組之間，其新生軟骨及成骨較A 組少，較B 組多，較少的幼稚軟骨細胞，以成熟的軟骨陷窩細胞為主，過渡性骨小梁較少，炎性反應(yīng)基本消失（圖2c）。D 組可見纖維結(jié)締組織增生（圖2d）。

圖2 HE 染色（×100）Fig 2 HE staining（×100）

2.3 載荷與形變、位移的關(guān)系

載荷與形變呈非線性關(guān)系，表現(xiàn)出復(fù)合組織結(jié)構(gòu)的力學(xué)性能。從載荷-應(yīng)變曲線可發(fā)現(xiàn)3 個不同的變化過程：在力量較小時標本即出現(xiàn)形變，類似軟組織的力學(xué)表現(xiàn)；隨著力量的增加，展現(xiàn)出彈性材料的力學(xué)表現(xiàn)，表現(xiàn)為彈性形變；最后力量增大而形變減少，曲線斜率明顯增大（圖3）。載荷與位移基本呈線性關(guān)系，載荷-位移曲線基本呈不同斜率的直線（圖4）。

圖3 載荷與形變關(guān)系Fig.3 Relationship between load and deformation

圖4 載荷與位移關(guān)系Fig.4 Relationship between load and displacement

2.4 植骨段的強度和軸向剛度

生物力學(xué)表明，A、B、C 組在植骨段強度及剛度方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05，表1）；與D 組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05，表1）。

表1 120 N載荷下植骨段的強度和軸向剛度Tab.1 Strength and axial stiffness of bone graft segments under 120 N load

3 討論

理想的植骨材料應(yīng)具備以下特點［8］。①具備骨傳導(dǎo)性，允許骨長入；②具備骨誘導(dǎo)因子，能誘導(dǎo)骨再生和修復(fù)；③植骨空隙中存活，且具備干細胞的分化潛能；④結(jié)構(gòu)完整，具備一定的力學(xué)支撐特性。自體松質(zhì)骨內(nèi)含有豐富的骨髓干細胞、生長因子等［9］，在明膠海綿等特定條件的誘導(dǎo)下可轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂谐晒腔钚缘募毎?0］，此類細胞在很多動物實驗中已被證實具有明確的成骨活性［11］、骨誘導(dǎo)、骨引導(dǎo)、骨傳導(dǎo)作用［12］；故自體骨移植一直是植骨融合的金標準［13］。但自體骨來源有限，取骨增加出血量，延長手術(shù)時間，部分患者出現(xiàn)髂骨骨折、供骨區(qū)疼痛及神經(jīng)損傷等并發(fā)癥［14］。同種異體骨雖來源豐富，但因各種弊端限制它只能作為自體骨量不夠情況下的一種補充［15］。近年來，隨著材料學(xué)的不斷發(fā)展，復(fù)合人工骨在植骨術(shù)中得到推廣［16］。

羥基磷灰石中的鈣磷結(jié)構(gòu)接近于人體骨骼，納米羥基磷灰石具有與松質(zhì)骨類似的互通的多孔支架結(jié)構(gòu)，無抗原性，具有生物相容性［17］，其力學(xué)性能可滿足臨床上骨組織修復(fù)的要求［18］，其化學(xué)成分和表面特性可影響細胞的生存、附著、遷移分化和增殖［19］。骨移植后骨愈合的3個基本過程是移植物的血管化、新生骨形成及與鄰近骨質(zhì)融合［20］，血管化是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，血管化程度與植骨修復(fù)效果呈正相關(guān)［17］。羥基磷灰石可在缺損處為修復(fù)早期的微血管形成及宿主骨細胞的附著提供支撐［14］。有研究［21］應(yīng)用納米羥基磷灰石修復(fù)兔的橈骨缺損，可見植入材料內(nèi)大量新生血管組織長入，并存在隨血液循環(huán)進入的間充質(zhì)干細胞等在誘導(dǎo)因子的作用下分化為成骨細胞，并能產(chǎn)生新生骨組織加速骨愈合。本研究的組織學(xué)檢查也有相同發(fā)現(xiàn)，如新生血管長入及軟骨細胞生長，術(shù)后3 個月周圍纖維組織、軟骨組織與納米羥基磷灰石融合，且沒有明顯的排斥反應(yīng)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著自體骨比例的降低，融合的成功率及生物力學(xué)指標也均有下降，并且炎性介質(zhì)增加。也有研究［22］報道，單獨應(yīng)用納米羥基磷灰石進行植骨，2、4、6、10 周時均未觀察到骨融合，組織學(xué)觀察成骨效果亦不如自體骨，說明納米羥基磷灰石材料本身雖具有仿生骨的構(gòu)架，有骨傳導(dǎo)性，但其成骨效果欠佳；其作用機制是誘導(dǎo)干細胞長入，促進細胞因子附著和增生，逐漸分化為新生骨組織，同時，納米羥基磷灰石逐漸分解，最終被新生骨組織替代［23］。且本研究未采取制動措施，植骨顆粒與植骨床之間可能存在微動，也可能影響植骨融合的效果。但Nagel 等［24］在羊后路椎板融合研究中發(fā)現(xiàn)，腰椎關(guān)節(jié)的融合率為100%，而腰骶關(guān)節(jié)的融合率為0，L5/L6節(jié)段平均位移1.2 mm，產(chǎn)生10%應(yīng)變，認為椎板間輕微位移不會對植骨融合產(chǎn)生影響。Evans［25］認為，理想的植骨區(qū)力學(xué)環(huán)境應(yīng)遵循：①作用于植骨塊和宿主骨的載荷不能超過兩者所能承受的最大載荷；②植骨區(qū)應(yīng)受到適當?shù)膽?yīng)力刺激，可以存在微動關(guān)系，但不能有顯著運動，且愈合前不應(yīng)存在張應(yīng)力。本研究術(shù)后3 個月植骨組均愈合良好，因此，推測植骨愈合不僅需要一定的植骨環(huán)境，也需要一定的應(yīng)力刺激。

有研究［26-28］表明，后方韌帶復(fù)合體（PLC）對脊柱有顯著的穩(wěn)定作用，可以限制脊柱的過度屈伸。本研究結(jié)果顯示，與未植骨組（D 組）相比，植骨組（A、B、C 組）的屈伸、壓縮、拉伸應(yīng)力均較高，表明椎板重建能增加脊柱的穩(wěn)定性；也從另一個方面說明，椎板切除對腰椎PLC 的生物力學(xué)影響較大，這與Kim 等［29］的研究結(jié)果一致。分析其原因，椎板重建恢復(fù)了腰椎的后張力帶，并重建了腰椎PLC 結(jié)構(gòu)，其中椎板可抵抗軸向旋轉(zhuǎn)，后側(cè)張力帶可抵抗屈曲運動。Merter 等［30］的研究表明，F(xiàn)BSS 的發(fā)生可能是由于PLC受損后脊柱后部結(jié)構(gòu)失去了對壓縮力的阻力，大部分壓縮力轉(zhuǎn)移到椎間盤。Li 等［31］的研究表明，保留PLC 可減少減壓節(jié)段的椎間盤應(yīng)力。Huang 等［32］發(fā)現(xiàn)，在后路腰椎椎間融合術(shù)中保留PLC 可有效預(yù)防ASD 的發(fā)生。此外，另一項研究［33］也發(fā)現(xiàn)，椎板切除術(shù)本身也會導(dǎo)致ASD。因此，結(jié)合本研究的生物力學(xué)數(shù)據(jù)可以推斷，椎板重建可以通過恢復(fù)脊柱后部結(jié)構(gòu)來預(yù)防ASD，減輕減壓節(jié)段的椎間盤應(yīng)力［17］。相關(guān)研究［34］還表明，椎板切除術(shù)后椎板重建對關(guān)節(jié)活動度的影響較小，說明重建椎板不僅可以重建脊柱的穩(wěn)定性，還可保留脊柱小關(guān)節(jié)的原始關(guān)節(jié)活動度。

本研究結(jié)果表明，全椎板切除術(shù)后行椎板重建可增加脊柱穩(wěn)定性，且新生椎板的生物學(xué)特性不僅符合椎板的力學(xué)需求，還有很好的生物相容性及骨誘導(dǎo)性，具有廣泛的應(yīng)用前景。但本研究樣本量較小，實驗時間短，動物模型力學(xué)性能與人體存在差異，且缺乏在臨床實踐中的驗證，結(jié)論仍需進一步探討、研究。