于文慧 鄭佳 李楊華 楊明川 王雅利 張子路 龔利娟 康振輝

摘要［目的］以高梁基因sbbHLH168為研究對(duì)象，探究其耐鎘脅迫發(fā)熱分子機(jī)制，對(duì)培育耐鎘高粱提供了理論參考。［方法］從高粱品種“BTx623”鎘脅迫下轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（RNA-seq）中篩選出一個(gè)受鎘脅迫后顯著上調(diào)表達(dá)的基因sbbHLH168，使用在線軟件對(duì)其生物信息進(jìn)行分析；通過(guò)洋蔥表皮侵染進(jìn)行亞細(xì)胞定位；構(gòu)建pGBKT7-sbbHLH168載體驗(yàn)證sbbHLH168基因的轉(zhuǎn)錄激活活性；將水培至四葉一心的高粱置于NaCl、PEG、ABA、ACC、GA和JA溶液處理，分別在0、1、12、24和48 h提取RNA，通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)sbbHLH168基因的相對(duì)表達(dá)量。［結(jié)果］sbbHLH168基因的開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為567 bp，編碼189個(gè)氨基酸殘基，蛋白分子量為20.55 kD，理論等電點(diǎn)（PI）為8.86，為堿性帶正電的蛋白，定位于細(xì)胞核，具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄激活活性。sbbHLH168基因在鹽、干旱和植物激素脅迫下表達(dá)量整體呈上升趨勢(shì)，但表達(dá)量在不同處理時(shí)間存在明顯差異。對(duì)sbbHLH168基因在不同組織中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，該基因在高粱的根和葉中均有表達(dá)，其中在鹽、干旱、ABA、GA和JA脅迫下，sbbHLH168基因在處理12 h時(shí)表達(dá)量最高。而在ACC處理時(shí)，則在處理24 h時(shí)表達(dá)量最高。［結(jié)論］sbbHLH168基因是一個(gè)定位在細(xì)胞核有轉(zhuǎn)錄激活活性的轉(zhuǎn)錄因子，屬于bHLH家族。

關(guān)鍵詞高粱；sbbHLH168；生物信息學(xué)分析；表達(dá)特征；轉(zhuǎn)錄激活活性

中圖分類號(hào)Q 81文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2023）24-0086-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.24.019

Expression and Bioinformatics Analysis of Cadmium Stress Response Gene sbbHLH168 in Sorghum bicolor

YU Wenhui1， ZHENG Jia2， LI Yanghua2 et al

（1.College of Bioengineering，Sichuan University of Science & Engineering，Yibin，Sichuan 644000;2. Wuliangye Group Co.， Ltd.， Yibin， Sichuan 644000）

Abstract［ Objective ］The study aimed to explore the molecular mechanism of cadmium stress tolerance in Sorghum bicolor gene sbbHLH168， which plays an important role in plant response to biotic and abiotic stresses， it provides a theoretical reference for breeding cadmiumtolerant Sorghum bicolor. ［Method］A significantly upregulated sbbHLH168 was screened from the transcriptome data （RNAseq） of Sorghum bicolor cultivar ‘BTx623 under cadmium stress， and its biological information was analyzed by online software subcellular localization of sbbHLH168 gene was carried out by infection of onion epidermis， PGBKT7sbbHLH168 vector was constructed to verify the transcriptional activation activity of sbbHLH168 gene， and Sorghum bicolor plants cultured in water were treated with NaCl， PEG， ABA， ACC， GA and JA solutions， RNA was extracted at 0，1，12，24 and 48 hours respectively， and the relative expression of sbbHLH168 gene was detected by RTqPCR. ［Result］The open reading frame length of sbbHLH168 gene was 567 bp， encoding 189 amino acid residues. The molecular weight of sbbHLH168 protein was 20.55 kDa， and the theoretical isoelectric point （PI） was 8.86. sbbHLH168 was a basic protein with positive charge， which was located in the nucleus of cells， it has strong transcriptional activation activity. The expression level of sbbHLH168 was increased under salt， drought and plant hormone stress， but the expression level was significantly different at different treatment time. The expression of sbbHLH168 gene in different tissues showed that sbbHLH168 gene was expressed in root and leaf of Sorghum bicolor， and the highest expression level was observed under salt， drought， ABA， GA and JA stress for 12 h. In ACC treatment， the highest expression level was observed at 24 h. ［Conclusion］sbbHLH168 gene is a transcription factor with transcriptional activation activity located in the nucleus and belongs to bHLH family.

Key wordsSorghum bicolor;sbbHLH168;Bioinformatics analysis;Expression characteristics;Transcriptional activation activity

高粱［Sorghum bicolor（L.） Moench］屬于禾本科單子葉植物，具有較強(qiáng)的耐鹽堿、耐高溫和抗旱等抗逆特性。高粱的生產(chǎn)和生物量相較于其他糧食作物更高，因此是許多非洲和許多發(fā)展中國(guó)家的重要食物來(lái)源［1］。近年來(lái)，高粱受到真菌、重金屬、低溫、干旱等逆境脅迫的影響，嚴(yán)重影響高粱的產(chǎn)量和品質(zhì)［2］。其中，鎘是植物生長(zhǎng)發(fā)育的一種非必需元素，它很容易被根吸收，并通過(guò)木質(zhì)部運(yùn)輸?shù)饺~中。植物內(nèi)鎘的積累會(huì)引起各種毒性癥狀，例如葉片變黃、萎蔫、生物量減少和細(xì)胞死亡等［3］。因此，對(duì)高粱抗逆脅迫基因進(jìn)行研究具有重要意義。

自然界的植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中不可避免地會(huì)受到許多生物和非生物脅迫的影響［4］。為了生存，植物本身必須利用廣泛的生理生化過(guò)程來(lái)應(yīng)對(duì)各種壓力［5］，這些反應(yīng)通過(guò)激活或抑制基因特異性表達(dá)來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)［6］?；蛱禺愋员磉_(dá)途徑之一是轉(zhuǎn)錄因子與順式元件的相互作用，特異性表達(dá)與環(huán)境脅迫有關(guān)的基因，以維持植物的正常生命活動(dòng)［7］。轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor，TF）又稱反式作用因子，其主要功能是激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)。通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用，可以利用轉(zhuǎn)錄因子來(lái)改良植物的抗逆性［8］。根據(jù)其DNA保守結(jié)構(gòu)域的不同，可以分為AP2/EREBP、MADS、bZIP和MYB等若干個(gè)家族［9］，在與植物抗逆性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子家族中，bHLH家族是植物中僅次于MYB家族的第二大家族［10］，它是由bHLH特征結(jié)構(gòu)域定義的DNA結(jié)合蛋白超家族，該結(jié)構(gòu)域包含參與DNA結(jié)合的基本區(qū)域和HLH區(qū)域充當(dāng)?shù)亩劢Y(jié)構(gòu)域［11］。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和基因組序列的增加，越來(lái)越多的bHLH轉(zhuǎn)錄因子被鑒定出來(lái)。例如，花生（Arachis hypogaea Linn.）、短柄草［Brachypodium sylvaticum（Huds.） Beauv.］、蘋(píng)果（Malus pumila Mill.）和大豆［Glycine max（Linn.） Merr.］的基因組分別包含261、146、188和155個(gè)bHLH基因［9，12-13］。植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)大量基因的表達(dá)，涉及廣泛的調(diào)節(jié)途徑［14］，如植物次生代謝：水稻（Oryza sativa L.）bHLH家族成員OsbHLH148被證明通過(guò)調(diào)節(jié)茉莉酸信號(hào)參與介導(dǎo)耐寒性［15］。bHLH112增加了擬南芥（Arabidopsis thaliana）細(xì)胞的ABA 水平。擬南芥AtbHLH40則與赤霉素的合成轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)［16］。響應(yīng)逆境脅迫：如AtbHLH12基因可以正向調(diào)控?cái)M南芥對(duì)鹽、干旱及滲透脅迫的抵抗力［17］；IbHLH1在蘋(píng)果對(duì)冷脅迫的適應(yīng)中發(fā)揮重要作用［18］?？刂萍?xì)胞的生長(zhǎng)：如水稻的稀穗突變體LAX是控制植株頂端分生組織的主要調(diào)節(jié)因子［19］。擬南芥SPATULA基因參與花形態(tài)建成和角果發(fā)育等多種發(fā)育過(guò)程［20］。AtbHLH95基因通過(guò)控制胚胎發(fā)育延緩植物的生長(zhǎng)［21］；擬南芥的AtbHLH21和水稻的OsbHLH164對(duì)花粉粒的形成及絨氈層細(xì)胞的發(fā)育有著關(guān)鍵的調(diào)控作用［22］。這些結(jié)果表明，bHLH轉(zhuǎn)錄因子除了調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育之外，還在植物應(yīng)對(duì)各種非生物脅迫中起著關(guān)鍵作用。已知的植物bHLH基因序列主要來(lái)源于水稻和擬南芥2種模式植物，對(duì)其他植物bHLH蛋白的功能研究還比較少［23］。

筆者從高粱鎘脅迫下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出一個(gè)顯著上調(diào)表達(dá)的基因sbbHLH168。通過(guò)生物信息學(xué)等方法分析該基因的基本特征，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real．time PCR，RT-qPCR）檢測(cè)sbbHLH168基因在不同非生物脅迫處理下在高粱根和葉中的相對(duì)表達(dá)量，了解其在抗逆脅迫中的作用，以期為sbbHLH168基因的研究提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料及主要試劑

試驗(yàn)材料包括實(shí)驗(yàn)室提供的高粱品種“BTx623”和P30-GFP載體，以及市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)的洋蔥（Allium cepa L.）。試驗(yàn)所用試劑包括TRIzol試劑和DNA Maker DL 2000購(gòu)自天根生化科技（TIANGEN）有限公司；PrimeScriptTM RT reagent kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒，TB Green Premix Ex TaqTM Ⅱ購(gòu)于寶日醫(yī)（北京）生物技術(shù)有限公司，2×EasyTaq PCR SuperMix購(gòu)自北京全式金（TransGen Biotech）生物技術(shù)有限公司。試驗(yàn)所用設(shè)備為Genesy 96T基因擴(kuò)增熱循環(huán)儀（西安天隆科技有限公司），TG16高速離心機(jī)（四川蜀科儀器有限公司），EF-UPR激光共聚焦顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司），Nano Drop 2000分光光度計(jì)（Thermo Scientific，美國(guó)），凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad，美國(guó)），RQH智能人工氣候培養(yǎng)箱（鄭州生元儀器有限公司），CFX96 Real-Time PCR System定量熒光PCR儀（Bio-Rad，美國(guó)），JY300E電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1多種非生物脅迫處理。

將高粱種子置于水培盒中培養(yǎng)至四葉一心時(shí)進(jìn)行鹽脅迫（100 mmol/L NaCl）和干旱脅迫（20% PEG 2 000）以及100 μmol/L ABA（脫落酸）、100 μmol/L ACC（乙烯合成前體）、100 μmol/L GA（赤霉素）和100 μmol/L JA（茉莉酸）處理。并在處理后的0（CK）、1、12、24和48 h分別取其根和葉組織樣品，置于液氮中速凍，剩余樣品于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。每組試驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)［24］。

1.2.2高粱sbbHLH168基因的獲取和克隆。

通過(guò)對(duì)高粱品種“BTx623”進(jìn)行鎘脅迫，從RNA-seq數(shù)據(jù)篩選到1個(gè)受鎘脅迫誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá)的sbbHLH168基因。根據(jù)Trizol試劑法提取各處理高粱根和葉組織樣品的RNA，并根據(jù)PrimeScriptTM RT reagent kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物（sbbHLH168F/R）（表1）。PCR反應(yīng)體系為20.0 μL∶2.0 μL cDNA、上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL、2×EasyTaq PCR SuperMix 10 μL、6.4 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性：95 ℃ 1 min；95 ℃ 20 s，58.6 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。將PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，將目的片段用DNA純化回收試劑盒回收后連接至PMD19-T（Simple）載體上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌trans5a感受態(tài)細(xì)胞，然后挑取陽(yáng)性克隆提交至華大基因生物科技（重慶）有限公司測(cè)序。

1.2.3高粱sbbHLH168基因的相對(duì)表達(dá)量。

使用Beacon Designer 8.0設(shè)計(jì)定量引物（QsbbHLH168F/R）（表1）。以cDNA為模板，高粱sbPP2A基因?yàn)閮?nèi)參，通過(guò)Bio-Rad CFX96對(duì)樣品sbbHLH168的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)體系為20.0 μL∶7.4 μL ddH2O、10 μL SYBR/TB Green II、7.4 μL RNase-free ddH2O、1.0 μL cDNA模板及定量引物（10 μmol/L）各0.8 μL，反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性：95 ℃ 30 s，變性：95 ℃ 5 s，退火：60 ℃ 30 s，循環(huán)40次后進(jìn)行融解曲線分析。每組試驗(yàn)設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。使用GraphPad Prism 9.0軟件作圖，同時(shí)進(jìn)行差異顯著性分析。

1.2.4sbbHLH168蛋白生物信息學(xué)分析。

利用NCBI在線工具查找sbbHLH168基因的CDS序列，通過(guò)Translate將其翻譯成氨基酸序列。使用Protein Blast對(duì)該氨基酸序列進(jìn)行同源序列比對(duì)，將同源序列利用DNAMAN 8.0進(jìn)行多重序列比對(duì)；使用MEGA 11.0軟件中的Neighbor-Joining構(gòu)建同源序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；利用Expasy在線工具Protparam和Protscale對(duì)sbbHLH168蛋白的等電點(diǎn)（PI）、分子量（MW）、不穩(wěn)定系數(shù)、氨基酸組成和蛋白親水性進(jìn)行分析；通過(guò) TMpred Server程序預(yù)測(cè)sbbHLH168蛋白的跨膜區(qū)；利用SOPMA在線程序預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.5sbbHLH168蛋白的亞細(xì)胞定位。

通過(guò)引物sbbHLH168-SacI-F和sbbHLH168-BamHI-R（表1）進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到含有SacI和BamHI酶切位點(diǎn)但不含終止密碼子的sbbHLH168全長(zhǎng)CDS片段，經(jīng)過(guò)雙酶切后連接到P30-GFP載體上。經(jīng)過(guò)測(cè)序比對(duì)，將成功構(gòu)建的質(zhì)粒P30-sbbHLH168-GFP與P30-GFP 載體分別通過(guò)電擊法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105中，并進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)。對(duì)驗(yàn)證正確的陽(yáng)性克隆置于YEB液體培養(yǎng)基中，于28 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)至菌液OD600約為1.0，將菌液離心重懸后于無(wú)菌條件下侵染洋蔥下表皮細(xì)胞。將侵染后的洋蔥下表皮置于28 ℃暗培養(yǎng)，2 d后將洋蔥下表皮細(xì)胞分別在熒光顯微鏡的明場(chǎng)及綠色熒光通道下觀察。亞細(xì)胞定位載體P30-sbbHLH168-GFP構(gòu)建見(jiàn)圖1。

1.2.6sbbHLH168蛋白的轉(zhuǎn)錄激活活性。

以cDNA為模板，用引物 sbbHLH168-BD-F/R（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到含有EcoRI和BamHI酶切位點(diǎn)的sbbHLH168全長(zhǎng)cDNA，經(jīng)雙酶切后連接到酵母雙雜交的誘餌載體pGBKT7上，酶切鑒定后通過(guò)PEG/LiAc法轉(zhuǎn)化至酵母Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞中。同時(shí)轉(zhuǎn)化pGBKT7空質(zhì)粒作為陰性對(duì)照，涂布于SD-Trp平板上，待菌落長(zhǎng)出后挑取單菌落重懸于10 μL滅菌的雙蒸水中，取1 μL重懸液點(diǎn)在SD-Trp和SD-Trp/X-α-gal（α-半乳糖苷酶作用的發(fā)色底物）固體培養(yǎng)基上，通過(guò)觀察菌落是否變藍(lán)來(lái)檢測(cè)sbbHLH168蛋白的轉(zhuǎn)錄激活活性。

2結(jié)果與分析

2.1高粱sbbHLH168基因的表達(dá)量

為進(jìn)一步探究sbbHLH168基因的表達(dá)水平，將其進(jìn)行不同非生物脅迫及植物生長(zhǎng)物質(zhì)處理。結(jié)果表明（圖2），sbbHLH168在根和葉中均有表達(dá)，并具有組織特異性，其中在葉中的表達(dá)量高，根中少。相較于CK，sbbHLH168均有差異性表達(dá)，其中鹽脅迫（NaCl）能顯著誘導(dǎo)其表達(dá)，呈先上升后下降的趨勢(shì)，對(duì)高粱葉的誘導(dǎo)在12 h達(dá)到最大值，根在24 h達(dá)到最大值。聚乙二醇（PEG）、脫落酸（ABA）和茉莉酸（JA）處理下，sbbHLH168基因的表達(dá)量呈上升—下降—上升的趨勢(shì)，均在12 h達(dá)到最大值。sbbHLH168在乙烯合成前體（ACC）和赤霉素（GA）處理下，其表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，分別在24、12 h達(dá)到最大表達(dá)量。這表明NaCl、PEG、ABA、ACC、GA和JA等外源非生物脅迫處理可以誘導(dǎo)sbbHLH168的表達(dá)，從表達(dá)量看，sbbHLH168對(duì)NaCl的響應(yīng)更加強(qiáng)烈。這表明sbbHLH168基因受NaCl、PEG、ABA、ACC、GA和JA等外源非生物脅迫處理的誘導(dǎo)，證明sbbHLH168基因參與高粱的非生物脅迫響應(yīng)，正向調(diào)控其抵抗非生物脅迫的能力。

2.2蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

sbbHLH168基因的開(kāi)放閱讀框?yàn)?67 bp，編碼189個(gè)氨基酸殘基。蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，其分子量為20.55 kD，理論等電點(diǎn)為8.86。蛋白的氨基酸組成中陰性氨基酸（Asp + Glu）有25個(gè)，陽(yáng)性氨基酸（Arg + Lys）有28個(gè)，屬于堿性蛋白，其不穩(wěn)定系數(shù)為48.84，屬于不穩(wěn)定蛋白。親/疏水性分析表明，sbbHLH168蛋白的平均親水系數(shù)為-0.286（圖3A），即該蛋白為疏水性蛋白。TMpred預(yù)測(cè)表明該蛋白不含跨膜區(qū)（圖3B）。保守結(jié)構(gòu)域分析顯示，sbbHLH168基因的氨基酸序列在第1～60位有1個(gè)bHLH_SF結(jié)構(gòu)域（圖3C），表明該蛋白屬于bHLH家族。

通過(guò)SOPMA對(duì)sbbHLH168氨基酸序列進(jìn)行分析并預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖4A、圖4B）。結(jié)果表明，sbbHLH168包含α螺旋、β轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈，其中占比最多的是α螺旋（52.13%）和無(wú)規(guī)則卷曲（36.17%），其空間結(jié)構(gòu)如圖所示（圖4C）。

2.3sbbHLH168蛋白定位在細(xì)胞核且有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄激活活性

通過(guò)Cell-PLoc 2.0在線程序進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明該蛋白位于細(xì)胞核中。將sbbHLH168與GFP熒光信號(hào)融合表達(dá)，結(jié)果表明，GFP熒光蛋白在整個(gè)細(xì)胞中均有表達(dá)，而sbbHLH168和GFP融合蛋白僅在細(xì)胞核中表達(dá)（圖5A），說(shuō)明sbbHLH168定位在細(xì)胞核中。轉(zhuǎn)錄激活活性分析表明，PGBKT7載體轉(zhuǎn)化的酵母僅能在SD/-Trp平板上生長(zhǎng)，而PGBKT7-sbbHLH168轉(zhuǎn)化的酵母在SD/-Trp和SD/-Trp/X-a-gal平板上均能生長(zhǎng)，且在含X-a-gal的平板上酵母菌落會(huì)變藍(lán)。說(shuō)明sbbHLH168轉(zhuǎn)錄因子具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄激活活性（圖5B）。

2.4蛋白序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分析

基于NCBI的Protein BLAST程序，比對(duì)與sbbHLH168同源的蛋白氨基酸序列。序列對(duì)比結(jié)果表明，sbbHLH168蛋白與南荻（Miscanthus lutarioriparius）的一致性最高，為77.5%。其次是穇［Eleusine coracana（Linn.） Gaertn.］64.4%、黍（Panicum hallii） 66.15%、黍稷（Panicum miliaceum）66.15%、柳枝稷（Panicum virgatum） 65.62%、小米（Setaria italica） 63.54%、彎葉畫(huà)眉草［Eragrostis curvula（Schrad.） Nees］62.23%、狗尾草（Setaria viridis）60.96%、二穗短柄草（Brachypodium distachyon） 57.98%等，均表現(xiàn)出較高的同源性。

運(yùn)用MEGA 11.0軟件，通過(guò)Neighbor-Joining對(duì)篩選出的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，其中矯正參數(shù)值設(shè)置為1 000。高粱sbbHLH168和MICAD6211412.1、MICAD6203892.1、SbSORBI 3001G350300、SbBDA96 01G371800和MICAD6232386.1在同一分支，表明其與南荻親緣關(guān)系最近（圖6、7）。

3討論

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中易受到生物和非生物脅迫的影響，植物為了適應(yīng)復(fù)雜的生長(zhǎng)環(huán)境，在長(zhǎng)期進(jìn)化中，植物形成了多種抗脅迫的機(jī)制［25］。其中，bHLH基因參與植物代謝調(diào)節(jié)、生長(zhǎng)發(fā)育及對(duì)環(huán)境信號(hào)反應(yīng)等過(guò)程。該研究采用實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)高粱在NaCl、PEG、ABA、ACC、GA和JA處理下sbbHLH168基因的表達(dá)量，試驗(yàn)結(jié)果表明，sbbHLH168基因在根和葉中的表達(dá)量整體呈上升趨勢(shì)，并且鹽脅迫能顯著誘導(dǎo)其表達(dá)，這表明sbbHLH168基因參與了高粱的非生物脅迫響應(yīng)。目前許多前人的研究都可以證明bHLH基因響應(yīng)植物的非生物脅迫，如在小麥中，通過(guò)TabHLH1基因?qū)BA途徑的調(diào)節(jié)，提高小麥對(duì)干旱的適應(yīng)性［26］。水稻基因OsbHLH148過(guò)表達(dá)，調(diào)節(jié)JA途徑和OsJAZ（茉莉酸ZIM結(jié)構(gòu)域）蛋白的功能［27］。PRE1的過(guò)表達(dá)激活了擬南芥中赤霉素依賴性反應(yīng)［28］。bHLH39的過(guò)表達(dá)增加了小麥對(duì)鹽脅迫的耐受性［29］。35S：CSbHLH增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥和黃瓜（Cucumis sativus L.）幼苗對(duì)NaCl和ABA的耐受性［30］。蘋(píng)果中的MdbHLH130通過(guò)維持ROS的穩(wěn)態(tài)來(lái)提高轉(zhuǎn)基因煙草（Nicotiana tabacum L.）缺水脅迫的耐受性［31］。沙漠楊樹(shù)（Populus euphratica O.）的PebHLH35在擬南芥中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)通過(guò)調(diào)節(jié)所得植物的氣孔發(fā)育和光合作用來(lái)增加對(duì)缺水脅迫的耐受性［32］。綜上所述，bHLH蛋白在植物響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮重要作用，可以提高植物抵抗不良環(huán)境的能力。今后可以通過(guò)構(gòu)建sbbHLH168基因在植物中的過(guò)表達(dá)或敲除來(lái)進(jìn)一步研究sbbHLH168基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆脅迫過(guò)程的功能。

4結(jié)論

植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但目前對(duì)于高粱bHLH轉(zhuǎn)錄因子的研究還缺乏深入研究。該研究以高粱sbbHLH168基因?yàn)檠芯繉?duì)象，利用PCR技術(shù)成功克隆了該基因的cDNA全長(zhǎng)序列，并在DNA水平上分析了其基因結(jié)構(gòu)。采用各種生物信息學(xué)軟件對(duì)其編碼蛋白sbbHLH168的理化性質(zhì)、親/疏水性、保守結(jié)構(gòu)域和二級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行分析，結(jié)果表明，sbbHLH168基因全長(zhǎng)567 bp，編碼189個(gè)氨基酸；sbbHLH168蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)多為無(wú)規(guī)則卷曲和a螺旋，是一種無(wú)跨膜區(qū)域的不穩(wěn)定疏水性蛋白，具有HLH_SF結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析表明，高粱sbbHLH168與南荻、穇和黍的親緣關(guān)系最近，與植物分類地位一致。

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