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α2珠蛋白基因Questembert變異聯(lián)合-α3.7 缺失導(dǎo)致α-地中海貧血一家系的遺傳學(xué)研究

2024-01-11 03:23:22張鑫麗陽鑫妙唐克鋒李雯雯沈國松
浙江醫(yī)學(xué) 2023年23期
關(guān)鍵詞:珠蛋白證者家系

張鑫麗 陽鑫妙 唐克鋒 李雯雯 沈國松

α-地中海貧血是由于α-珠蛋白基因缺陷導(dǎo)致的α-珠蛋白鏈合成障礙引起的遺傳性溶血性貧血,它是最常見的常染色體單基因遺傳病,其基因缺陷包括大片段丟失(占95%)和α-珠蛋白基因血紅蛋白A1 帶(HbA1)、血紅蛋白A2 帶(HbA2)變異。病情嚴(yán)重程度與α-珠蛋白鏈減少的程度直接相關(guān)[1]。本研究對1 例嚴(yán)重溶血性貧血疑似α-地中海貧血的患兒和家系進(jìn)行致病基因分析,發(fā)現(xiàn)了中國人群罕見的α-地中海貧血致病型變異,并對先證者母親羊水進(jìn)行產(chǎn)前診斷,現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 先證者,男,4 歲,貧血嚴(yán)重。2021 年5 月20 日因母親再次妊娠至湖州市婦幼保健院遺傳咨詢門診就診?;純簽樽阍路置洌冈衅诤突純撼錾鷷r無異常,患兒出生后1 個月,呈現(xiàn)貧血狀態(tài),2 個月起開始輸血治療,現(xiàn)每4 周輸血400 mL,42 個月時行脾切除手術(shù)。患兒中度貧血貌,皮膚黏膜黃染出血。父母非近親婚配,父親籍貫江蘇,母親籍貫貴州,父親表型正常;母親此次為自然妊娠中期,胎兒B 超檢查顯示為雙絨雙羊雙胎,無其他異常;母親及其家系有多名貧血及脾腫大或脾切除史者。收集患兒父母及母親家系貧血成員相關(guān)病歷,并進(jìn)行血液學(xué)相關(guān)檢查。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查通過(批準(zhǔn)文號:2022-J-110),患兒父母與家系成員均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 血常規(guī)和Hb 電泳檢測 收集患兒、患兒父母及母親家系部分成員非空腹外周靜脈血2 mL,EDTA 抗凝。先采用全自動血液分析儀進(jìn)行血常規(guī)測定,再采用Sebia capalliary2 毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行Hb 成分分析。

1.2.2 常見地中海貧血基因檢測 抽取患兒和父母的非空腹外周靜脈血2 mL,EDTA 抗凝。母親孕18 周穿刺取羊水10 mL,進(jìn)行DNA 提取及熒光定量PCR 實驗。試劑由廈門致善生物技術(shù)有限公司提供,采用“多色熒光PCR 熔解曲線(MMCA)”技術(shù),按照基因診斷試劑盒的操作說明在羅氏熒光定量PCR Lightcycler 480Ⅱ上進(jìn)行中國人常見α-地中海貧血基因(包括3種缺失型變異:-SEA、-α3.7、-α4.2,3 種常見非缺失型變異:HbCS、HbWS、HbQS)檢測。

1.2.3 血液系統(tǒng)疾病Panel 檢測 將患兒、患兒父母及母親家系成員的外周血及母親羊水送至北京邁基諾醫(yī)學(xué)檢驗所進(jìn)行檢測。根據(jù)該所提供的血液系統(tǒng)疾病Panel 檢測項目,從先證者樣本中提取DNA,構(gòu)建文庫,使用IDTxGen?Exome Research panel v1.0 雜交捕獲試劑完成目標(biāo)區(qū)域捕獲,采用Illumina NovaSeq 完成高通量測序(測序讀長為2×150 bp)。通過生物信息學(xué)分析,并結(jié)合當(dāng)前國內(nèi)外現(xiàn)有的行業(yè)指南和醫(yī)學(xué)知識,篩選出與表型相關(guān)的靶向外顯子組區(qū)域的(可能)致病性變異,并對其設(shè)計引物,進(jìn)行Sanger 測序驗證,引物序列HbA2-F:5'-CAGGATTGGGCGAAGCCCT-3',HbA2-R:5'-GAGGTCCTTGGTCTGAGACAGG-3';并對父母、母親家系及母親羊水進(jìn)行該變異位點的Sanger 驗證。實驗過程中,對檢測樣本的質(zhì)控分析貫穿整個過程,并選用8~10 個高頻單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNP)位點作為樣本身份標(biāo)識。

2 結(jié)果

2.1 先證者及家系成員檢測結(jié)果 見表1。

表1 先證者及家系成員檢測結(jié)果

2.2 常規(guī)地中海貧血基因診斷 結(jié)果發(fā)現(xiàn),先證者和其父親存在αα/-α3.7雜合缺失型突變。

2.3 DNA 變異信息 二代測序后提示先證者HbA2 基因3 號外顯子處有一個純合突變HbA2c.394T>C(p.S132P),Sanger 測序驗證母親攜帶該位點的雜合性變異,父親為野生純合,見圖1。母親家系的部分成員進(jìn)行該位點驗證,發(fā)現(xiàn)了8 名攜帶者;母親羊水細(xì)胞Sanger 測序雙胎均未攜帶此變異位點,見圖2,隨訪為健康雙胎女嬰。

圖1 HbA2 基因c.394T>C 變異的Sanger 測序圖

圖2 患兒家系系譜圖

3 討論

α-珠蛋白基因位于16 號染色體上(16p13),每條染色體有2 個連鎖的α-珠蛋白基因,即HbA1 和HbA2基因。1 個或2 個α-珠蛋白基因的合成缺陷會導(dǎo)致紅細(xì)胞參數(shù)發(fā)生輕度到中度的變化。大多數(shù)已確定的α-地中海貧血患者是由1 個或2 個重復(fù)α-珠蛋白基因的大量缺失引起,這是主要的致病突變,其余則是HbA1 和HbA2 基因點突變引起的非缺失型地中海貧血。此外,已經(jīng)報道了超過100 種不同的點突變。這些點突變?nèi)绻押塑账岵迦牒腿笔Т蠖嗯cα-珠蛋白基因正常表達(dá)的關(guān)鍵基因組區(qū)域相關(guān)[2],通過多種機制減少或抑制α-珠蛋白鏈的合成,如影響轉(zhuǎn)錄、剪接、翻譯、翻譯后加工等[3]。而一些由α-珠蛋白基因等位基因共同遺傳的非缺失型變異造成α-珠蛋白不穩(wěn)定變體的患者可能出現(xiàn)與地中海貧血中間型血紅蛋白H帶(HbH)病[4]相似的臨床和血液學(xué)結(jié)果。其中產(chǎn)生極不穩(wěn)定的α-珠蛋白變異體的,臨床癥狀(貧血、肝脾腫大、輸血頻次)更加嚴(yán)重[5]。因為不穩(wěn)定的α-珠蛋白變異體可能沒有Hb 運輸釋放氧氣和二氧化碳的作用,但它們具有高氧親和力,導(dǎo)致組織供氧減少,造成溶血和貧血,最終導(dǎo)致造血不良的骨髓擴張,骨、肝、脾的髓外造血[3]。

第三外顯子突變引起第三外顯子編碼區(qū)域的螺旋H 的破壞,最終造成不穩(wěn)定的α2 珠蛋白鏈變體比較多見。H 螺旋從118 個氨基酸殘基延伸到138 個氨基酸殘基,在血紅蛋白四聚體中α1 和β1 單體的疏水接觸中起關(guān)鍵作用,或在α-珠蛋白穩(wěn)定蛋白(AHSP)(α-珠蛋白的分子伴侶)的形成中起關(guān)鍵作用[6]。H 螺旋的突變產(chǎn)生極不穩(wěn)定的Hb 變體[1],并在紅細(xì)胞中沉淀,導(dǎo)致溶血,出現(xiàn)α 地中海表型[7-8]。如Hb Toyama(p.Leu135Arg)已證實其表達(dá)水平低于總Hb 的1%[9];Hb Quong Sze(p.Leu125Pro)是在1 例HbH 病患者中發(fā)現(xiàn)的[10];Hb Sun Prairie(p.Ala130Pro)[11]和Hb Attleboro(p.Ser138Pro)[12]為兩種低水平表達(dá)的不穩(wěn)定Hb 導(dǎo)致患者出現(xiàn)嚴(yán)重的溶血。

而HbA2 基因c.394T>C(p.Ser132Pro),又稱為Hb Questembert 變異,可引起H 螺旋中132 位極性中性氨基酸(絲氨酸)轉(zhuǎn)變?yōu)榉菢O性疏水性氨基酸(脯氨酸),導(dǎo)致H 螺旋結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的破壞。迄今為止該變異有少量報道,其表型主要是結(jié)合了地中海貧血和周圍溶血性貧血的特征。該變異首次于1993 年在法國Questembert 地區(qū)的一個先天性Heinz 小體貧血8 例患者的家系中被報道[13]。該家系為HbA2 基因c.394T>C變異,功能試驗證實該變異影響了從mRNA 轉(zhuǎn)錄、剪接到蛋白的空間結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)錄和翻譯過程,產(chǎn)生了極不穩(wěn)定α-珠蛋白鏈,且其在紅細(xì)胞中表達(dá)水平非常低,造成患者造血功能障礙和周圍性溶血。另1 例報道為希臘雅典的2 歲重度溶血性貧血患兒,其HbA1 基因的c.394T>C 變異,并且在反式位置檢出-α3.7缺失[14]。

本研究中,Hb Questembert 變異在家系中攜帶者表現(xiàn)為輕到中度地中海貧血,地中海貧血特征要嚴(yán)重于αα/-α3.7缺失型攜帶者。而先證者測序為HbA2 的c.394T>C 的純合變異是由于合并反式-α3.7缺失造成,其α-地中海貧血基因型為αQuestembertα/-α3.7。由于HbA2基因編碼的mRNA 的穩(wěn)定水平比HbA1 基因高3 倍[15],HbA2 上的點突變對α-珠蛋白鏈影響可能更大[13]。本例先證者對比希臘雅典患者,具有典型的地中海貧血血液學(xué)特征和嚴(yán)重的臨床表現(xiàn),其表型傾向于非缺失型HbH 病。

地中海貧血非缺失型變異攜帶者Hb 成分很多沒有明顯的變化,常規(guī)的PCR 法也難以檢測。然而,隨著分子診斷技術(shù)的發(fā)展,許多α-地中海貧血病的鑒定變得更加容易。因此,臨床上要對地中海貧血保持高度敏感性,必要時應(yīng)用遺傳咨詢,以降低母親懷孕期間嚴(yán)重的并發(fā)癥和杜絕中重型α-地中海貧血患兒的出生。Hb Questembert 變異首次在我國被發(fā)現(xiàn),豐富了中國人群α-地中海貧血突變譜,且經(jīng)過家系驗證,該變異可導(dǎo)致典型的α-地中海貧血,為該家系在遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷中提供重要依據(jù)。

遺傳性血紅蛋白病,包括α-地中海貧血癥的遺傳咨詢是至關(guān)重要的,至少可以最大限度地減少巴特血紅蛋白胎兒積液綜合征的發(fā)生,該綜合征可能導(dǎo)致新生兒死亡和懷孕期間母親的嚴(yán)重健康并發(fā)癥。只有當(dāng)臨床結(jié)果準(zhǔn)確區(qū)分α-珠蛋白基因型和其他相關(guān)基因型,且表現(xiàn)與各種形式的α-地中海貧血相同時,遺傳咨詢才有意義。隨著遺傳咨詢技術(shù)的發(fā)展,許多α-地中海貧血病遺傳修飾因子的鑒定變得更加容易,并記錄了它們對各種表型的影響。

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