王軍偉,馬桂巧,張佩佩,邵 婧,馬嬋娟,3*

(1山西中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床學(xué)院腎內(nèi)科,晉中 030600;2山西醫(yī)科大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院腎內(nèi)科;3山西省人民醫(yī)院腎內(nèi)科;*通訊作者,E-mail：mcj5670206@163.com)

糖尿病腎病(diabetic kidney disease,DKD)作為糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥,對患者的健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅,影響了數(shù)億人的生活質(zhì)量[1]。DKD是糖尿病患者進(jìn)展為終末期腎病(end-stage renal disease,ESRD)的主要原因之一,最終需要腎臟透析或移植[2]。長期高血糖會誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙,破壞細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡,并引起胰島素抵抗,從而導(dǎo)致多種并發(fā)癥[3]。高糖(high glucose,HG)誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡在DKD的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。高糖不僅增加了細(xì)胞內(nèi)ROS水平,而且削弱了抗氧化酶系統(tǒng)的能力,從而加重了機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)[4]。氧化應(yīng)激對腎小管的損傷包括凋亡、肥大、纖維化等病理改變。腎小管損傷被認(rèn)為是DKD的重要病理改變[5]。因此,預(yù)防和治療腎小管損傷,阻斷高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和氧化損傷已成為DKD治療的重要靶點之一。

AKT/GSK3β信號通路是一個重要的細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑,它參與調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過程,包括細(xì)胞增殖、存活和凋亡等。這個信號通路由蛋白激酶B(protein kinase B,PKB又稱AKT)和糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)2個主要蛋白質(zhì)組成[6]。AKT通過直接抑制GSK3β的磷酸化來增強(qiáng)細(xì)胞生存的信號。GSK3β具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用,活化的AKT通過抑制GSK3β的活性,降低了其對凋亡相關(guān)蛋白的磷酸化,從而抑制細(xì)胞凋亡[7]。因此AKT的激活抑制了GSK3β的活性,從而減輕細(xì)胞凋亡。細(xì)胞氧化應(yīng)激是細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)失衡引起的一種病理過程。AKT的激活可以通過抑制GSK3β減少細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基的產(chǎn)生,并增強(qiáng)抗氧化能力,從而減輕細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。

槐杞黃(Huaiqihuang, HQH)是一種傳統(tǒng)中藥復(fù)方制劑,由槐耳、枸杞子、黃精組成。包括黃酮類化合物、多糖、多酚類化合物等有效成分[8]。槐杞黃具有多種藥理作用,包括抗氧化、抗炎、抗纖維化等,在中醫(yī)藥臨床實踐中被廣泛應(yīng)用于治療腎臟病等其他疾病[9]。然而,槐杞黃對腎小管上皮細(xì)胞(human kidney-2,HK-2)氧化應(yīng)激和凋亡的作用鮮有報道。因此,本研究將聚焦槐杞黃對腎小管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的作用及其調(diào)控機(jī)制,通過高糖處理HK-2細(xì)胞,觀察槐杞黃對細(xì)胞氧化損傷和凋亡的保護(hù)作用,并以AKT/GSK3β抗氧化抗凋亡途徑為切入點探索其作用機(jī)制,為臨床防治腎臟病提供新的思路及支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

卡托普利購自美國MCE公司;CCK-8試劑盒購自美國APExBIO公司;SOD和MDA檢測試劑盒購自南京建成生物工程有限公司;活性氧檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;BCA蛋白定量試劑盒購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司;cleaved-Caspase-3抗體購自美國CST公司;p-GSK3β抗體和GSK3β抗體購自美國Santa Cruz公司;蛋白提取裂解液、TUNEL檢測試劑盒、p-AKT抗體、AKT抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體、Caspase-3抗體和GAPDH抗體,以及HRP標(biāo)記的山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

槐杞黃清膏是槐耳菌質(zhì)、黃精、枸杞的提取物,為棕褐色稠厚的半流體,由江蘇啟東蓋天力醫(yī)藥有限公司饋贈;將2 g的槐杞黃溶解在20 ml的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,作為濃度為100 mg/ml的原液,通過0.22 μm濾膜滅菌,密封后-20 ℃保存。

1.2 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)

HK-2細(xì)胞購自湖南豐暉生物科技有限公司。HK-2細(xì)胞使用含有5.5 mmol/L葡萄糖、10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、95%濕度和5%CO2的培養(yǎng)箱環(huán)境條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞分組和處理

HK-2細(xì)胞分為5組：正常對照組(Control,CON)、甘露醇組(Mannitol,MAN)、高糖模型組(high glucose,HG),槐杞黃組(HQH),卡托普利組(Captopril, CAP)。正常對照組使用含有5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基正常培養(yǎng);甘露醇組在正常組的基礎(chǔ)上加入終濃度為34.5 mmol/L的甘露醇刺激48 h;高糖模型組使用含有40 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基刺激48 h;槐杞黃組在高糖模型組的基礎(chǔ)上加入終濃度為8 mg/ml的槐杞黃共同刺激48 h;卡托普利組在高糖模型組的基礎(chǔ)上加入終濃度為100 μmol/L的卡托普利共同刺激48 h。甘露醇組用于排除滲透壓對細(xì)胞的影響,另外,卡托普利是一種血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑,能縮小腎小球濾過膜孔徑,修復(fù)其通透性,進(jìn)一步減少蛋白尿和腎小管損傷[10],因此本研究選擇了卡托普利作為陽性對照。

1.4 CCK-8檢測細(xì)胞活力

將細(xì)胞以1×104個/孔的密度接種到96孔培養(yǎng)板中,當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70%時,將細(xì)胞分為正常對照組、高糖模型組和不同藥物濃度槐杞黃組,正常對照組使用含有5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基正常培養(yǎng);高糖模型組使用含有40 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h;槐杞黃組在高糖模型組的基礎(chǔ)上分別加入終濃度為2,4,6,8,10,12和14 mg/ml的槐杞黃共同孵育48 h。在干預(yù)結(jié)束后,向每孔中加入10 μl CCK-8試劑,并在37 ℃下繼續(xù)孵育2 h,使用酶標(biāo)儀檢測450 nm的吸光度。

1.5 活性氧檢測試劑盒檢測ROS生成

將HK-2細(xì)胞接種到6孔板中,細(xì)胞按照1.3分組處理后,用PBS洗滌,并用10 μmol/L 2′,7′二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)在37 ℃下避光孵育20 min。用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次,在倒置熒光顯微鏡下觀察ROS的生成并采集圖像,隨后用Image J軟件分析圖像的平均熒光強(qiáng)度。

1.6 HK-2細(xì)胞中SOD和MDA含量測定

超氧化物歧化酶活性檢測試劑盒、丙二醛測定試劑盒測定HK-2細(xì)胞中SOD和MDA含量。細(xì)胞分組和處理后,去除培養(yǎng)液,收集細(xì)胞。使用超聲波細(xì)胞破碎器對收集的HK-2細(xì)胞進(jìn)行勻漿,離心收集上清。將上清液和工作試劑轉(zhuǎn)移到96孔板中,通過計算的蛋白質(zhì)濃度對SOD和MDA濃度歸一化。分別在450,532,562 nm處的吸光度檢測SOD、MDA和蛋白含量。

1.7 RT-qPCR檢測KIM-1、NGAL mRNA表達(dá)水平

使用RNA細(xì)胞快速提取試劑盒從細(xì)胞中提取總mRNA。用PrimeScript RT reagent Kit將其逆轉(zhuǎn)成cDNA。用TB Green premix Ex TaqⅡ在CFX96系統(tǒng)進(jìn)行定量PCR分析。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s、95 ℃變性5 s,60 ℃退火延伸30 s,變性和退火延伸進(jìn)行40個循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參,使用2-ΔΔCt方法計算基因表達(dá)量差異。PCR引物見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.8 Western blot檢測Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、Caspase-3、p-AKT、AKT、p-GSK-3β、GSK-3β蛋白表達(dá)水平

將細(xì)胞在含有1%磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑混合物的RIPA緩沖液中裂解。通過BCA蛋白測定試劑盒檢測蛋白濃度。通過SDS-PAGE分離所研究的蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移至PVDF膜,將PVDF膜在室溫下在含有5%脫脂奶粉的TBST中封閉2 h,加一抗(cleaved-Caspase-3、Caspase-3、p-GSK-3β、GSK-3β的稀釋比例為1∶1 000,Bcl-2、p-AKT、AKT的稀釋比例為1∶2 000,Bax、GAPDH的稀釋比例為1∶5 000),4 ℃孵育過夜。用TBST緩沖液洗滌后,將膜與二抗(山羊抗兔二抗、羊抗小鼠二抗的稀釋比例為1∶8 000)在室溫孵育1 h。均勻滴加ECL顯色液,于凝膠成像儀中曝光和拍照。使用Image J軟件分析蛋白質(zhì)灰度值,以GAPDH作為內(nèi)參對照。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

使用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間比較使用成組t檢驗進(jìn)行分析。多組間比較采用單因素ANOVA分析,組間兩兩比較用Tukey檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 槐杞黃對高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞存活率的影響

CCK-8結(jié)果顯示,與正常對照組比較,高糖模型組細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.001);與高糖模型組相比,不同濃度槐杞黃(2,4,6,8,10,12,14 mg/ml)組HK-2細(xì)胞存活率明顯改善,并且當(dāng)槐杞黃濃度為8 mg/ml時達(dá)到峰值(P<0.001,見圖1),因此選擇8 mg/ml槐杞黃用于后續(xù)實驗。與正常對照組相比,高糖模型組腎小管損傷標(biāo)志物KIM-1和中性粒細(xì)胞相關(guān)載脂蛋白NGAL mRNA的表達(dá)水平顯著增加(P<0.001),與高糖模型組比較,槐杞黃組和卡托普利組KIM-1和NGAL mRNA的表達(dá)水平均顯著降低(P<0.001);而槐杞黃組與卡托普利組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(見圖1)。

與CON比較,###P<0.001;與HG比較,*P<0.05,***P<0.001圖1 HQH對高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞存活率和KIM-1、NGAL mRNA水平的影響 (n=3)Figure 1 Effect of HQH on the survival rate of high glucose-induced HK-2 cells and the levels of KIM-1 and NGAL mRNA (n=3)

2.2 槐杞黃減少高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞ROS的產(chǎn)生

與正常對照組相比,高糖模型組細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高(P<0.001);與高糖模型組相比,槐杞黃組和卡托普利組藥物干預(yù)后ROS水平顯著降低(P<0.001,見圖2);而槐杞黃組與卡托普利組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果表明,槐杞黃對ROS的過量產(chǎn)生具有顯著的抑制作用。

2.3 槐杞黃抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞氧化應(yīng)激

與正常對照組比較,高糖模型組HK-2細(xì)胞MDA含量顯著升高,SOD活性顯著下降(均P<0.001);與高糖模型組比較,槐杞黃組和卡托普利組MDA含量顯著下降,而SOD活性顯著上升(均P<0.001);而槐杞黃組與卡托普利組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(見圖3)。表明槐杞黃可以降低高糖環(huán)境下HK-2細(xì)胞中脂質(zhì)過氧化反應(yīng),并提高細(xì)胞的抗氧化能力。

圖2 DCFH-DA檢測槐杞黃對高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞ROS表達(dá)水平的影響 (×200,n≥3)Figure 2 Effect of HQH on ROS expression in HK-2 cells induced by high glucose by DCFH-DA (×200,n≥3)

與CON比較,###P<0.001;與HG比較,***P<0.001圖3 槐杞黃對高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞MDA和SOD含量的影響 (n=3)Figure 3 Effect of HQH on MDA and SOD contents in HK-2 cells induced by high glucose (n=3)

2.4 槐杞黃抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡

Western blot結(jié)果顯示,與正常對照組相比,高糖模型組細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax和cleaved-Caspase-3的表達(dá)水平顯著增加(P<0.001),而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.001),同時Bcl-2/Bax比值也顯著降低(P<0.001,見圖4)。與高糖模型組相比,槐杞黃組和卡托普利組細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax和cleaved-Caspase-3的表達(dá)水平顯著下降(P<0.001),而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.01),同時Bcl-2/Bax比值也顯著上升(P<0.001,見圖4)。槐杞黃組與卡托普利組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.5 槐杞黃對AKT/GSK3β信號通路的調(diào)控效應(yīng)

與對照組比較,高糖模型組p-AKT蛋白表達(dá)水平明顯減少(P<0.001),p-GSK-3β蛋白表達(dá)水平明顯增加(P<0.001);與高糖模型組比較,槐杞黃組和卡托普利組p-AKT表達(dá)上升(P<0.01),p-GSK-3β表達(dá)水平降低(P<0.01,見圖5)?；辫近S組與卡托普利組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

DKD是糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,并且是慢性腎臟病的最常見原因[11]。越來越多的證據(jù)表明,氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡與糖尿病誘導(dǎo)的腎損害有關(guān)[12,13]。腎小球系膜擴(kuò)張、基底膜增厚和腎小管損傷是DKD的主要形態(tài)學(xué)改變,這些病理改變均與氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡有關(guān)[14,15]。在這種情況下,抗氧化應(yīng)激和抗細(xì)胞凋亡可能為DKD的治療提供有希望的策略[16,17]。近年來,中成藥槐杞黃顆粒由于其具有抗氧化和抗凋亡特性而被廣泛研究[18,19]。

與CON比較,###P<0.001;與HG比較,**P<0.01,***P<0.001圖4 Western blot法檢測槐杞黃對高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞Bcl-2、Bax、Caspase-3和cleaved-Caspase-3表達(dá)的影響 (n=3)Figure 4 Effect of HQH on expressions of Bcl-2, Bax, Caspase-3 and cleaved-Caspase-3 in HK-2 cells induced by high glucose by Western blot (n=3)

與CON比較,###P<0.001;與HG比較,**P<0.01圖5 Western blot法檢測槐杞黃對AKT/GSK3β信號通路的影響 (n=3)Figure 5 Effects of HQH on AKT/GSK3β signaling pathway by Western blot (n=3)

先前的研究指出,槐杞黃對腎臟疾病甚至多種癌癥都有輔助治療作用,其具體機(jī)制可能涉及氧化應(yīng)激、免疫、自噬、凋亡、鐵死亡和焦亡等[20,21]。在本研究中,高糖環(huán)境下HK-2細(xì)胞存活率顯著下降,細(xì)胞受到生長抑制。細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)的增加導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS,破壞細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示,高糖組腎小管損傷標(biāo)記物(KIM-1)、中性粒細(xì)胞相關(guān)載脂蛋白(NGAL)mRNA表達(dá)水平增加,槐杞黃干預(yù)減輕了高糖對HK-2細(xì)胞存活率的抑制作用及其對腎小管的損害程度,以上結(jié)果說明槐杞黃對高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞損傷有明顯改善作用。

來自體外和體內(nèi)的大量數(shù)據(jù)表明,氧化應(yīng)激與DKD的發(fā)病機(jī)制有關(guān),抗氧化應(yīng)激可能為預(yù)防和治療糖尿病誘導(dǎo)的腎損傷提供新的治療思路[22,23]。SOD是在各種器官中提供針對氧化應(yīng)激的第一線酶促抗氧化防御的最重要的保護(hù)酶,MDA是膜脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物之一[24],已有研究表明腎損傷中SOD活性降低,MDA含量增加[25]。而本研究也通過對SOD活性和MDA水平的檢測,發(fā)現(xiàn)高糖能夠增加MDA含量,并減少SOD活性,引起細(xì)胞氧化損傷;而用槐杞黃藥物進(jìn)行干預(yù)后,受損的細(xì)胞內(nèi)MDA含量降低,SOD活性升高。這些數(shù)據(jù)證實了槐杞黃可以通過提高HK-2細(xì)胞中SOD活性,抑制MDA含量,從而抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。

以往的研究已經(jīng)證實細(xì)胞凋亡在高血糖刺激后腎臟結(jié)構(gòu)和功能損傷中起著至關(guān)重要的作用,但這種損傷和功能障礙的潛在機(jī)制尚未得到很好的解釋[26]。為探討槐杞黃對糖尿病腎病的保護(hù)作用及其減輕腎臟損害的具體作用機(jī)制,本研究采用免疫印跡法檢測HK-2細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2和cleaved-Caspase-3的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)與對照組比較,高糖對HK-2細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平具有顯著抑制作用,對Bax和cleaved-Caspase-3蛋白水平具有明顯的促進(jìn)作用;而槐杞黃干預(yù)顯著提高了Bcl-2蛋白的表達(dá),并降低了Bax和cleaved-Caspase-3蛋白的表達(dá)。這表明槐杞黃能夠抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡。AKT信號通路已被證實參與糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制。AKT磷酸化可以改善糖尿病動物的抗凋亡和抗氧化能力,但AKT磷酸化也可以被氧化應(yīng)激抑制[27]。當(dāng)AKT磷酸化降低時,其下游因子GSK-3β磷酸化被激活,其他凋亡相關(guān)因子如Bax和cleaved-Caspase-3表達(dá)增加[28]。為進(jìn)一步驗證槐杞黃對高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞保護(hù)作用機(jī)制,我們又檢測了AKT及其下游GSK3β的蛋白的表達(dá)水平,通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)在高糖處理下,HK-2細(xì)胞中p-AKT表達(dá)降低,p-GSK-3β表達(dá)升高,高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞GSK-3β磷酸化水平增加,說明GSK-3β在高糖誘導(dǎo)的HK 2細(xì)胞中活性受到了抑制。而經(jīng)槐杞黃處理后,p-AKT蛋白的表達(dá)顯著提高,并p-GSK-3β蛋白的表達(dá)降低。上述結(jié)果揭示了槐杞黃治療糖尿病腎病的分子機(jī)制,表明槐杞黃可能是通過激活A(yù)KT信號通路并抑制GSK3β磷酸化來調(diào)控細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)和凋亡過程。

綜上所述,槐杞黃具有良好的抗氧化功能,并能夠抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能與調(diào)控AKT/GSK3β信號通路有關(guān)。本研究局限于體外細(xì)胞水平,后續(xù)還需在體內(nèi)實驗深入研究HQH延緩糖尿病腎病的進(jìn)展與氧化應(yīng)激和凋亡的關(guān)系,以及其影響AKT/GSK3β信號通路的具體機(jī)制。