[摘 " 要] " 目的：建立反向DNA-pull down方法，驗(yàn)證目的蛋白與靶DNA的結(jié)合，為探究疾病發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供新的手段。方法：以小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞總cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得轉(zhuǎn)錄因子PU.1 -ETS結(jié)構(gòu)域編碼序列，通過酶切連接的方式連入表達(dá)質(zhì)粒pET28a，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）誘導(dǎo)蛋白異源表達(dá)。以小鼠基因組DNA為模板，通過PCR獲得Ly96啟動(dòng)子序列。將異源表達(dá)的PU.1 ETS結(jié)合至Ni-NTA磁珠后，與靶DNA—Ly96啟動(dòng)子體外孵育，最終經(jīng)蛋白酶K酶解、DNA抽提及瓊脂糖凝膠電泳檢測PU.1 ETS體外結(jié)合Ly96啟動(dòng)子情況，評估反向DNA-pull down技術(shù)的可行性。結(jié)果：通過大腸桿菌異源表達(dá)和親和純化獲得Ni-NTA磁珠-PU.1 ETS復(fù)合物，通過PCR獲得Ly96啟動(dòng)子序列，經(jīng)反向DNA-pull down驗(yàn)證PU.1 ETS與Ly96啟動(dòng)子的相互結(jié)合作用。結(jié)論：以PU.1-ETS-Ly96啟動(dòng)子相互作用為例，證實(shí)反向DNA pull-down技術(shù)的可行性，為探究已知蛋白與靶DNA結(jié)合和疾病發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制提供了一種操作簡單、實(shí)驗(yàn)條件要求不高、成本較低的可選方案。

[關(guān)鍵詞] " 蛋白-DNA結(jié)合；反向DNA-pull down方法；異源表達(dá)；PU.1轉(zhuǎn)錄因子

[中圖分類號] " Q503 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] " A [DOI] " 10.19767/j.cnki.32-1412.2024.06.003

Establishment of reverse DNA-pull down method

CHU Jiaqi1， WANG Xueming1， KOU Yanbo2， YAN Xiaoqing3

（1First Clinical College; 2Jiangsu Key Laboratory of Immunity and Metabolism; 3Laboratory of Emergency Medicine，

Xuzhou Medical University， Jiangsu 221004）

[Abstract] " Objective： To establish a reverse DNA-pull down method for verifying the binding of the target protein to the target DNA， providing a new approach for exploring the molecular mechanisms of disease development. Methods： The total cDNA of mouse bone marrow-derived macrophages was used as a template to amplify the coding sequence of the ETS domain of the transcription factor PU.1 by PCR. The ETS domain coding sequence was then ligated to the expression vector pET28a by enzymatic digestion， and then transformed into Escherichia coli BL21（DE3） for heterologous expression of the protein. The Ly96 promoter sequence was amplified with mouse genomic DNA as a template. The heterogeneously expressed PU.1 ETS complex was bound to the Ni-NTA beads， after which the beads-PU.1 ETS complex was incubated with the target DNA-Ly96 promoter in vitro. The PU.1 ETS-Ly96 promoter interaction was evaluated by agarose gel electrophoresis after proteinase K digestion and DNA extraction to verify the feasibility of reverse DNA-pull down. Results： The Ni-NTA beads-PU.1 ETS complex was obtained through heterologous expression and affinity purification. The Ly96 promoter sequence was amplified by PCR， and the interaction between PU.1 ETS and the Ly96 promoter was verified by reverse DNA-pull down. Conclusion： Taking the interaction of PU.1-ETS-Ly96 promoter as an example， the feasibility of reverse DNA-pull down technology is confirmed， which provides an alternative scheme with simple operation， low experimental conditions and low cost for exploring the molecular mechanism of binding of known protein to target DNA and disease development.

[Key words] " protein-DNA binding; reverse DNA-pull down assay; heterologous expression; PU.1 transcription factor

蛋白表達(dá)開始于編碼基因的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄起始的核心是蛋白（轉(zhuǎn)錄因子/輔轉(zhuǎn)錄因子或轉(zhuǎn)錄復(fù)合物）與目的DNA（啟動(dòng)子）的結(jié)合，該過程在細(xì)胞內(nèi)受嚴(yán)格的調(diào)控。研究基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，特別是以轉(zhuǎn)錄因子為代表的蛋白與DNA結(jié)合機(jī)制是闡明蛋白表達(dá)調(diào)控方式的重要手段，也是明確疾病發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制的有力依據(jù)。目前研究蛋白與DNA結(jié)合的經(jīng)典方法較多，包括染色質(zhì)免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation assay，ChIP）、凝膠遷移實(shí)驗(yàn)（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）、雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)、酵母單雜交實(shí)驗(yàn)等。然而，這些方法往往操作較為復(fù)雜，而且或多或少存在著某些不足之處[1-7]。如ChIP實(shí)驗(yàn)不能排除轉(zhuǎn)錄因子通過結(jié)合其它輔/轉(zhuǎn)錄因子而與啟動(dòng)子結(jié)合，EMSA需要對目的DNA進(jìn)行標(biāo)記而增大實(shí)驗(yàn)成本，雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性和重復(fù)性欠佳，酵母單雜交實(shí)驗(yàn)需要特殊的宿主酵母和質(zhì)粒系統(tǒng)等。因此，尋找研究蛋白與DNA結(jié)合的新方法具有重要意義。

本研究基于DNA-pull down實(shí)驗(yàn)基本原理[8]，以轉(zhuǎn)錄因子PU.1-ETS結(jié)構(gòu)域-Lymphocyte antigen 96（Ly96）啟動(dòng)子為代表[9]，建立反向DNA-pull down方法，為探究蛋白與DNA直接結(jié)合提供新的策略。

1 " 材料與方法

1.1 " 材料 " 6周齡野生型C57BL/6小鼠（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司），大腸桿菌感受態(tài)DH5α和BL21（DE3）、高保真DNA聚合酶（北京全式金生物技術(shù)股份有限公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連寶生物工程有限公司），Ni-NTA瓊脂糖磁珠（Qiagen），Trizol、核酸內(nèi)切酶NcoⅠ、HindⅢ、KpnⅠ、XhoⅠ及DNA連接酶（Thermo Fisher Scientific），基因組提取試劑盒、切膠回收試劑盒和核酸純化試劑盒（廣州飛揚(yáng)生物工程有限公司），異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）（生工生物工程股份有限公司）。

1.2 " 方法

1.2.1 " 轉(zhuǎn)錄因子PU.1 ETS結(jié)構(gòu)域編碼基因克?。簾o菌操作取野生型C57BL/6小鼠股骨和脛骨骨髓，分離并誘導(dǎo)骨髓來源的巨噬細(xì)胞。收集細(xì)胞后提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后獲得總cDNA。以總cDNA為模板，PU.1 ETS-F（5′-CATGCCATGGGCCCTGGGCCAGG-

TCTTCTGCACGGG-3′）和PU.1 ETS-R（5-′CCCAA

GCTTCCCACGGCCCAGCACCTCGCC-3′）為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收獲得純化的PU.1 ETS結(jié)構(gòu)域編碼序列。

1.2.2 " PU.1 ETS結(jié)構(gòu)域表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：將pET28a空質(zhì)粒和1.2.1中純化的PU.1 ETS結(jié)構(gòu)域編碼序列用NcoⅠ和HindⅢ雙酶切后，通過凝膠回收獲得線性化的pET28a和酶切的PU.1 ETS編碼序列。將線性化的pET28a和酶切的PU.1 ETS編碼序列按照摩爾比1 ∶ 7的比例混合，并用DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物以熱激法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中。過夜培養(yǎng)后挑取轉(zhuǎn)化子，經(jīng)菌液PCR和酶切驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序無誤的重組質(zhì)粒用于后續(xù)蛋白表達(dá)。

1.2.3 " PU.1 ETS結(jié)構(gòu)域異源表達(dá)：將1.2.2中測序無誤的重組質(zhì)粒和pET28a空質(zhì)粒（對照）分別通過熱激法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）中，挑取陽性轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證無誤后，接種至LB培養(yǎng)基，置于旋轉(zhuǎn)搖床，37 ℃，220 r/min，直至生長至對數(shù)期中后期。取該菌液按照1 ∶ 50比例轉(zhuǎn)接至新鮮LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)2～3 h后，向培養(yǎng)基中添加終濃度1 mmol/L IPTG，將培養(yǎng)條件改為20 ℃，100 r/min，過夜培養(yǎng)后收取菌體。將菌體用PBS洗滌3次后進(jìn)行超聲破碎，收集上清，采用SDS-PAGE電泳、考馬斯亮藍(lán)染色觀察蛋白表達(dá)情況。

1.2.4 " PU.1 ETS結(jié)構(gòu)域蛋白純化：將1.2.3所得的上清與平衡好的Ni-NTA瓊脂糖磁珠按照說明書推薦的比例混勻，置于旋轉(zhuǎn)搖床，4 ℃，80 r/min，孵育4 h。然后4 ℃下3 000 r/min離心5 min，收集磁珠，5 mmol/L咪唑洗滌1次，PBS洗滌3次，得到對照磁珠和純化的結(jié)合有PU.1 ETS結(jié)構(gòu)域的Ni-NTA瓊脂糖磁珠。

1.2.5 " Ly96啟動(dòng)子序列克隆：收集1.2.1中骨髓來源的巨噬細(xì)胞，提取總DNA，以該總DNA為模板，PLy96-F（5′-TAATTGTCTCCCTGAAAATGTGC-3′）和PLy96-R（R：5′-TAAACTCGCCAGGAAGACCAT-3′）為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲取Ly96啟動(dòng)子區(qū)，切膠回收后獲得純化的Ly96啟動(dòng)子。

1.2.6 " 反向DNA-pull down實(shí)驗(yàn)：將等量的1.2.4所得的Ni-NTA瓊脂糖磁珠分別與1 μg Ly96啟動(dòng)子混勻，置于旋轉(zhuǎn)搖床4 ℃，80 r/min孵育2 h，離心收集珠子，PBS洗滌5遍后用150 μL PBS重懸磁珠，加入終濃度40 μg/mL蛋白酶K，45 ℃，酶解2 h。利用DNA純化試劑盒回收酶解釋放的Ly96啟動(dòng)子，最終通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PU.1 ETS結(jié)合Ly96啟動(dòng)子情況。利用Image J軟件對電泳條帶進(jìn)行灰度分析。

1.3 " 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 " 采用Graph Pad Prism 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以■±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 " 結(jié) " " "果

2.1 " PU.1-ETS結(jié)構(gòu)域表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 " 以骨髓來源的巨噬細(xì)胞總cDNA為模板，PCR擴(kuò)增PU.1-ETS編碼區(qū)（圖1A）。目的產(chǎn)物經(jīng)切膠回收純化后，由NcoⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切，連入表達(dá)質(zhì)粒pET28a，得到重組質(zhì)粒pET28a-PU.1-ETS。pET28a-PU.1-ETS分別經(jīng)NcoⅠ/HindⅢ和KpnⅠ/XhoⅠ酶切驗(yàn)證產(chǎn)生條帶約為5 300 bp/320 bp和5 400 bp/190 bp（圖1B）。測序無誤后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 " PU.1-EST結(jié)構(gòu)域的異源表達(dá)和純化 " 將上述測序無誤的pET28a-PU.1-ETS和對照空載體pET28通過熱激法分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）中，挑取轉(zhuǎn)化子經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證正確后，取1號（對照菌株，攜帶pET28a）和4號（重組蛋白表達(dá)菌株，攜帶pET28a-PU.1-ETS）轉(zhuǎn)化子用于后續(xù)誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)（圖2A）。轉(zhuǎn)化子經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，收集菌體進(jìn)行超聲破碎，將超聲破碎后的全菌體、沉淀和上清樣本進(jìn)行SDS-PAGE電泳，發(fā)現(xiàn)pET28a-PU.1-ETS轉(zhuǎn)化子沉淀和上清中均存在大量疑似目的蛋白（圖2B）。為進(jìn)一步確定該蛋白是否是PU.1-ETS-His重組蛋白，我們利用His-Tag抗體進(jìn)行Western bolt檢測，重組蛋白理論分子量為13.92 kD，Western blot結(jié)果顯示在接近15 kD處檢測到His Tag信號，表明該蛋白確實(shí)為PU.1-ETS-His重組蛋白（圖2C）。

2.3 " PU.1-ETS與Ly96啟動(dòng)子反向DNA-pull down技術(shù) " 已有文獻(xiàn)報(bào)道PU.1能識別并結(jié)合淋巴細(xì)胞抗原96（lymphocyte antigen 96，Ly96）編碼基因啟動(dòng)子，調(diào)控Ly96轉(zhuǎn)錄。因此，本研究以PU.1-ETS-Ly96啟動(dòng)子為例驗(yàn)證反向DNA-pull down技術(shù)的可行性。將2.2中菌體破碎上清中重組蛋白、Ni-NTA瓊脂糖珠、純化的Ly96啟動(dòng)子按圖 3A所示流程進(jìn)行操作，最終通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PU.1-ETS體外結(jié)合Ly96啟動(dòng)子情況。結(jié)果顯示，雖然空珠子有一定的DNA結(jié)合背景，但與空珠子相比，結(jié)合PU.1 ETS的珠子明顯能吸附更多的Ly96啟動(dòng)子區(qū)DNA，表明Ni-NTA-PU.1-ETS在體外能有效結(jié)合Ly96啟動(dòng)子（圖3B-E），證明反向DNA-pull down技術(shù)可用于體外蛋白與核酸結(jié)合的檢測。

3 " 討 " " "論

機(jī)體的健康穩(wěn)態(tài)實(shí)際上是各個(gè)組織器官處于適應(yīng)當(dāng)前環(huán)境的狀態(tài)表現(xiàn)，隨著環(huán)境的改變，機(jī)體需要相應(yīng)改變以適應(yīng)新環(huán)境，保持健康的穩(wěn)態(tài)。然而，有些情況下機(jī)體并不能對環(huán)境作出很好的應(yīng)答，往往導(dǎo)致疾病產(chǎn)生。機(jī)體擁有適應(yīng)不同環(huán)境并保持健康穩(wěn)態(tài)的潛力，是在不同環(huán)境下基因選擇性調(diào)控表達(dá)的結(jié)果。因此，探究機(jī)體應(yīng)對環(huán)境保持健康穩(wěn)態(tài)的機(jī)制，本質(zhì)上是要研究在對應(yīng)環(huán)境下功能基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控和功能蛋白活性調(diào)節(jié)的機(jī)制。對比健康和疾病狀態(tài)下蛋白表達(dá)調(diào)控機(jī)制的改變，并基于此開發(fā)相應(yīng)的藥物以糾正錯(cuò)誤的蛋白表達(dá)模式或?qū)⑹穷A(yù)防和治療相關(guān)疾病的有效策略。本研究基于DNA-pull down的基本原理，提供一種反向DNA-pull down技術(shù)，用于體外探究蛋白（轉(zhuǎn)錄因子/輔轉(zhuǎn)錄因子）與DNA（啟動(dòng)子）結(jié)合情況，為解析疾病發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供新的可選手段。

傳統(tǒng)DNA-pull down技術(shù)利用生物素標(biāo)記啟動(dòng)子，將標(biāo)記的啟動(dòng)子與靶轉(zhuǎn)錄因子/輔轉(zhuǎn)錄因子或核蛋白提取物孵育，然后通過鏈霉親和素偶聯(lián)的珠子捕獲啟動(dòng)子-轉(zhuǎn)錄因子/輔轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物，最終通過Western blot檢測靶轉(zhuǎn)錄因子/輔轉(zhuǎn)錄因子是否存在于沉淀物中，以此來證明啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄因子/輔轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合[10]。該技術(shù)以已知啟動(dòng)子來釣取靶蛋白，很多時(shí)候研究者可能想要探究已知轉(zhuǎn)錄因子/輔轉(zhuǎn)錄因子的靶DNA，這種情況下DNA-pull down技術(shù)則顯得捉襟見肘。為解決這一問題，本研究基于DNA-pull down技術(shù)基本原理，嘗試?yán)靡阎鞍讈矸聪蜥炄“蠨NA。將目的蛋白進(jìn)行異源表達(dá)后結(jié)合于偶聯(lián)對應(yīng)結(jié)合物的磁珠上，隨后以磁珠-目的蛋白復(fù)合物與靶DNA進(jìn)行孵育，收集復(fù)合物并用蛋白酶將蛋白裂解釋放釣取到的DNA，最終通過簡單的瓊脂糖凝膠電泳即可明確目的蛋白與靶DNA的結(jié)合情況。根據(jù)該方法的原理，若結(jié)合DNA文庫和測序技術(shù)，還可進(jìn)一步拓寬其應(yīng)用，以探究目的蛋白能結(jié)合的未知DNA。

反向DNA-pull down技術(shù)不需要ChIP那樣繁雜的操作步驟和特定抗體，不需要如EMSA技術(shù)標(biāo)記探針，也沒有酵母單雜交技術(shù)所必備的特殊酵母菌種、載體和培養(yǎng)體系。相對而言，反向DNA-pull down技術(shù)操作更為簡單，對實(shí)驗(yàn)條件要求更低。當(dāng)然，反向DNA-pull down技術(shù)也有缺點(diǎn)，如只能做到體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，而不能實(shí)時(shí)胞內(nèi)驗(yàn)證；需要對目的蛋白進(jìn)行異源表達(dá)，某些特殊蛋白未必能順利完成異源表達(dá)；盡管諸多轉(zhuǎn)錄因子在體外可直接與啟動(dòng)子結(jié)合[11-12]，然而某些轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合依賴轉(zhuǎn)錄因子的翻譯后修飾，如最常見的磷酸化等，本技術(shù)中轉(zhuǎn)錄因子來源于大腸桿菌異源表達(dá)，所得到的重組轉(zhuǎn)錄因子未必能夠在大腸桿菌胞內(nèi)獲得有效的磷酸化修飾，因此反向DNA-pull down技術(shù)對這類依賴翻譯后修飾而結(jié)合啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子適用性有限。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)空磁珠似乎有一定的DNA非特異性吸附現(xiàn)象（圖3C，Ctrl組），若目的蛋白與靶DNA結(jié)合較弱，這種非特異性吸附所帶來的背景信號很可能會干擾最終結(jié)果的判斷。為解決這一問題，我們推測在磁珠-目的蛋白復(fù)合物與靶DNA孵育之前增加一步“封閉”步驟是一種可行的方案，即在磁珠-目的蛋白復(fù)合物與靶DNA孵育前加入無關(guān)DNA占據(jù)非特異性吸附位點(diǎn)，以最大程度降低后續(xù)靶DNA與磁珠-目的蛋白復(fù)合物的非特異性結(jié)合。但高效封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)的DNA長度和序列還在試驗(yàn)探索階段。

綜上所述，本研究以PU.1 ETS結(jié)構(gòu)域-Ly96啟動(dòng)子為代表，建立反向DNA-pull down技術(shù)，為探究已知蛋白與靶DNA結(jié)合，探究疾病發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制提供了一種操作簡單、實(shí)驗(yàn)條件要求不高、成本較低的可選方案。

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[收稿日期] 2024-09-20

（本文編輯 " 王曉蘊(yùn)）