孫 兵,陶 韜

重慶大學附屬涪陵醫(yī)院:1.重癥醫(yī)學科;2.呼吸與危重癥醫(yī)學科,重慶 408000

急性胰腺炎(AP)是胃腸道疾病的主要并發(fā)癥,15%～20% AP患者會發(fā)生重癥急性胰腺炎(SAP),SAP會引發(fā)和加劇全身炎癥反應[1]。SAP發(fā)展會導致炎癥細胞因子的釋放,從而導致腸屏障損傷,除此之外,還增加腸道通透性,促進細菌感染,導致腸道屏障受損[2]。因此,防治SAP誘導的腸損傷對于治療SAP具有重要意義。柴胡皂苷A是一種三萜類皂苷,具有許多藥理學特性,包括抗炎和抗氧化作用[3]。柴胡皂苷A是清一湯的主要成分,而清一湯在中國用于SAP的治療已有數(shù)十年,近期發(fā)現(xiàn),清一湯可以對SAP引起的腸黏膜損傷發(fā)揮保護作用[4]。LI等[5]研究發(fā)現(xiàn),柴胡皂苷A可以通過調節(jié)腸道微生物群變化減緩大鼠SAP進展的作用,但是關于柴胡皂苷A在SAP大鼠腸損傷上的作用機制鮮少報道。肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)/肌球蛋白輕鏈 2(MLC2)信號通路是腸道炎癥損傷研究的重要通路之一,有研究報道,下調MLCK/MLC2信號通路可以減輕炎癥,改善腸道屏障損傷進而治療腸易激綜合征大鼠[6]。本研究旨在探討柴胡皂苷A調節(jié)MLCK/MLC2信號通路對SAP大鼠腸損傷的影響。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物 6周齡雄性SPF級SD雄性大鼠(220±20)g,生產許可證號:SCXK(粵)2021-0059,購自廣州銳格生物科技有限公司,本研究嚴格遵循動物實驗學的3R原則。

1.2儀器與試劑 柴胡皂苷A購自成都瑞芬思德丹生物科技有限公司;MLCK/MLC2通路激活劑iE-DAP購自北京達科為生物技術有限公司;白細胞介素(IL)-1β試劑盒、IL-6試劑盒、脂肪酶(LIP)試劑盒、二胺氧化酶(DAO)試劑盒、谷胱甘肽(GSH)試劑盒購自博輝生物科技(廣州)有限公司;淀粉酶(AMY)試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司;腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒購自上海廣銳生物科技有限公司;緊密連接蛋白-1(Zo-1)、閉鎖蛋白(occludin)、MLCK、磷酸化MLC2(p-MLC2)、MLC2和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)等抗體均購自Abcam公司。

1.3動物模型及分組 隨機選擇10只大鼠作為假手術組,其他大鼠參考文獻[7]建立SAP大鼠模型,脫毛后,用2%戊巴比妥鈉腹膜內麻醉大鼠,劑量為30.0 mg/kg,并固定在手術臺上。剖腹手術后,將1 mL注射器緩慢插入胰膽管,注入5%?；悄懰徕c溶液,以0.1 mL/min的注射速率注入大鼠胰腺組織。然后,拔出針頭,逐層封閉腹腔。當大鼠出現(xiàn)毛發(fā)暗淡、呼吸急促、喘息、肺部聽診雜音、血清AMY水平明顯升高等癥狀時,表明SAP大鼠模型構建成功。假手術組除不注射?；悄懰徕c溶液到胰膽管外,其他步驟相同。將構建成功的SAP大鼠模型隨機平分為SAP組、柴胡皂苷A組(腹腔注射10.0 mg/kg的柴胡皂苷A)、iE-DAP組(腹腔注射3.5 mg/kg MLCK/MLC2通路激活劑iE-DAP)、柴胡皂苷A+iE-DAP組(腹腔注射10.0 mg/kg柴胡皂苷A+3.5 mg/kg iE-DAP),每組均10只大鼠[5,8-9]。假手術組和SAP組注射等量生理鹽水。每天1次,連續(xù)注射1周。

1.4標本采集 藥物處理結束12 h后,將大鼠麻醉,通過腹主動脈收集3 mL血液,經離心機3 000 r/min離心20 min,獲得血清用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測。隨后,將大鼠處死收集回腸組織,一部分回腸組織固定于4%多聚甲醛中用于HE染色,一部分回腸組織保存在-80 ℃冰箱用于ELISA檢測及蛋白質免疫印跡(Western blot)檢測。

1.5各組血清AMY、LIP、DAO、炎癥因子水平檢測 使用ELISA試劑盒檢測各組血清AMY、LIP、DAO水平及IL-1β、IL-6和TNF-α水平。

1.6HE染色檢測各組大鼠回腸組織病理變化 將固定在4%多聚甲醛的各組大鼠回腸組織標本包埋在石蠟中,用旋轉切片機切成4 μm薄片,切片用1%蘇木精和1%伊紅染料染色后在光學顯微鏡下觀察各組大鼠回腸組織病理形態(tài)。各組大鼠回腸組織病理評分采用Chiu評分法,最高評分為5分,具體評分標準:0分為黏膜絨毛正常; 1分為出現(xiàn)充血堵塞現(xiàn)象;2分為上皮下間隙延伸,上皮層從固有層適度抬起;3分為絨毛側面有大量上皮隆起;4分為絨毛脫落,固有層和擴張的毛細血管暴露;5分為固有層消化和崩解,出血和潰瘍[10]。

1.7ELISA法檢測各組大鼠回腸組織氧化應激指標水平 收集上述保存在-80 ℃冰箱的各組大鼠回腸組織,經研磨儀研磨后按照ELISA試劑盒說明書檢測各組大鼠回腸組織GSH、MDA及SOD水平。

1.8Western blot檢測腸道屏障相關蛋白及MLCK/MLC2通路相關蛋白表達 收集回腸組織在RIPA裂解緩沖液中勻漿提取總蛋白。蛋白質樣品(40 μg)在預制的10%SDS聚丙烯酰胺凝膠上分離。電泳后,將蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯膜中,用5%脫脂牛奶封閉后,將膜與一抗Zo-1(1∶1 000)、occludin(1∶1 000)、MLCK(1∶1 000)、p-MLC2(1∶1 000)、MLC2(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)抗體,4 ℃孵育一夜;次日加入二抗,室溫孵育1 h,加入電化學發(fā)光顯色試劑顯影后。使用Image J軟件分析目的蛋白的灰度值。

2 結 果

2.1柴胡皂苷A組對各組大鼠AMY、LIP、DAO及炎癥因子水平的影響 與假手術組相比,SAP組AMY、LIP、DAO、IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與SAP組相比,柴胡皂苷A組AMY、LIP、DAO、IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著降低,而iE-DAP組AMY、LIP、DAO、IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與柴胡皂苷A組相比,柴胡皂苷A+iE-DAP組AMY、LIP、DAO、IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠AMY、LIP、DAO及炎癥因子水平比較

2.2柴胡皂苷A對各組大鼠回腸組織病理評分的影響 各組大鼠回腸組織病理形態(tài)見圖1。假手術組、SAP組、柴胡皂苷A組、iE-DAP組、柴胡皂苷A+iE-DAP組大鼠回腸組織病理評分依次為(0.03±0.01)、(2.24±0.35)、(0.88±0.09)、(3.97±0.58)、(2.09±0.20)分。假手術組大鼠回腸組織結構正常,與假手術組相比,SAP組大鼠病理檢查顯示回腸組織水腫、出血、絨毛頂點缺失、絨毛兩側上皮隆起,回腸組織病理評分顯著升高(P<0.05);與SAP組相比,柴胡皂苷A組大鼠回腸組織結構得到改善,回腸組織病理評分顯著降低(P<0.05),而iE-DAP組加重了上述病理表現(xiàn),回腸組織絨毛脫落,固有層和擴張的毛細血管暴露,固有層消化和崩解,出血和潰瘍,回腸組織病理評分顯著升高(P<0.05);柴胡皂苷A+iE-DAP組回腸組織損傷程度與SAP組相似,柴胡皂苷A+iE-DAP組較柴胡皂苷A組回腸組織病理評分顯著升高(P<0.05)。

2.3柴胡皂苷A對各組大鼠回腸組織GSH、MDA及SOD水平的影響 與假手術組相比,SAP組大鼠GSH、SOD水平顯著降低,MDA水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與SAP組相比,柴胡皂苷A組GSH、SOD水平顯著升高,MDA水平顯著降低,而iE-DAP組GSH、SOD水平顯著降低,MDA水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與柴胡皂苷A組相比,柴胡皂苷A+iE-DAP組GSH、SOD水平顯著降低,MDA水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠回腸組織GSH、MDA及SOD水平比較

2.4柴胡皂苷A對各組大鼠Zo-1、occludin蛋白水平的影響 與假手術組相比,SAP組Zo-1、occludin蛋白水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與SAP組相比,柴胡皂苷A組Zo-1、occludin蛋白水平顯著升高,而iE-DAP組Zo-1、occludin蛋白水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與柴胡皂苷A組相比,柴胡皂苷A+iE-DAP組Zo-1、occludin蛋白水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3、圖2。

圖2 Western blot檢測各組Zo-1、occludin蛋白水平

表3 柴胡皂苷A對各組大鼠Zo-1、occludin蛋白水平的影響

2.5柴胡皂苷A對各組大鼠MLCK/MLC2信號通路蛋白水平的影響 與假手術組相比,SAP組MLCK、p-MLC2/MLC2蛋白水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與SAP組相比,柴胡皂苷A組MLCK、p-MLC2/MLC2蛋白水平顯著降低,而iE-DAP組MLCK、p-MLC2/MLC2蛋白水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與柴胡皂苷A組相比,柴胡皂苷A+iE-DAP組MLCK、p-MLC2/MLC2蛋白水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表4、圖3。

圖3 Western blot檢測MLCK/MLC2信號通路蛋白水平

表4 柴胡皂苷A對各組大鼠MLCK/MLC2信號通路蛋白水平的影響

3 討 論

有研究發(fā)現(xiàn)SAP主要起源于無菌性局部炎癥,可迅速升級為全身炎癥反應綜合征和器官衰竭[11]。已發(fā)現(xiàn)天然產物可有效預防SAP,清一湯是一種中草藥,主要用于治療SAP,已被證實可以通過保護腸道屏障發(fā)揮治療SAP的效果[4]。清一湯的主要活性成分是柴胡皂苷A,LI 等[5]研究證實,柴胡皂苷A可以通過促進有益菌的增殖,抑制有害菌的增殖來改善腸道屏障進而改善大鼠SAP。但是關于柴胡皂苷A在SAP大鼠腸損傷中的作用機制尚未明確。本研究結果發(fā)現(xiàn),SAP組大鼠病理檢查顯示回腸組織水腫、出血、絨毛頂點缺失、絨毛兩側上皮隆起,回腸組織病理評分顯著升高,提示SAP大鼠造模成功;與SAP組相比,柴胡皂苷A組大鼠回腸組織結構得到改善,表明柴胡皂苷A可能對SAP大鼠腸損傷起到改善效果。

IL-1β、IL-6和TNF-α在SAP的發(fā)病機制中起著至關重要的作用,TNF-α是炎癥反應中最早和主要的內源性介質[12]。SOD、MDA 和GSH 是用于評估人體氧化應激反應和抗氧化能力的3種物質。有研究表明,當身體經歷氧化應激反應時,MDA水平增加,而SOD和GSH水平降低[13]。SAP中胰腺濾泡破壞導致的血清LIP、AMY水平升高是SAP的重要表現(xiàn)之一[7]。本研究結果提示,柴胡皂苷A可能通過抑制氧化應激及炎癥反應,抑制胰腺濾泡分泌LIP、AMY,來改善SAP大鼠腸道炎癥損傷。

Zo-1在緊密連接和腸道通透性中發(fā)揮著不可或缺的作用,缺乏Zo-1導致腸道上皮細胞無法形成緊密連接[14-15]。本研究結果發(fā)現(xiàn),柴胡皂苷A治療后大鼠回腸組織Zo-1、occludin蛋白水平顯著升高,表明柴胡皂苷A可能通過增加Zo-1、occludin蛋白水平,改善腸道緊密連接進而改善腸道屏障。小腸通透性增加和細菌易位被認為是SAP相關腸道損傷的特征。作為一種有效的生物標志物,DAO 反映了小腸的完整性和黏膜功能。血清中 DAO 的活性可以作為評估腸道屏障功能的一種方法。此外,有研究表明,腸黏膜機械屏障的破壞導致大量DAO釋放[16]。本研究結果發(fā)現(xiàn),與SAP組相比,柴胡皂苷A組DAO水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),表明柴胡皂苷A可能通過改善腸道完整性進而改善SAP大鼠腸道屏障。

MLCK/MLC2信號通路是腸道炎癥的關鍵通路,XIE等[6]研究報道,通過抑制MLCK/MLC2途徑調節(jié)腸道炎癥和腸道屏障,可以緩解大鼠腸易激綜合征。HUANG等[17]發(fā)現(xiàn),通過下調MLCK/MLC2途徑可以通過防止腸道屏障功能障礙來緩解小鼠結腸炎。由此可見,MLCK/MLC2是研究腸道損傷的重要通路。本研究結果發(fā)現(xiàn),與SAP組相比,柴胡皂苷A組MLCK、p-MLC2/MLC2蛋白水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),提示柴胡皂苷A可能通過下調MLCK/MLC2通路起到治療大鼠SAP的效果。本研究結果還發(fā)現(xiàn),iE-DAP加重了腸道損傷,且iE-DAP消除了柴胡皂苷A對SAP大鼠腸道損傷的治療效果。

綜上所述,柴胡皂苷A可能通過下調MLCK/MLC2信號通路改善SAP大鼠腸道屏障及炎癥反應,從而對SAP大鼠腸道損傷起到改善作用。然而,關于柴胡皂苷A的最佳治療劑量,以及是否可以調控其他通路起到相同治療效果還需要研究者進一步探索。