宋漢韜,劉小娟,2,劉 芳,2,常 莉,2,滕 潔,2△

1.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院檢驗(yàn)科,四川成都 610041;2.四川大學(xué)婦兒疾病與出生缺陷教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川成都 610041

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一,發(fā)病率在女性惡性腫瘤中居第二位,近年來有年輕化趨勢(shì),嚴(yán)重危害女性健康。據(jù)統(tǒng)計(jì),每年約有27.5萬女性最終死于宮頸癌。1995 年,世界衛(wèi)生組織(WHO) 指出高危型人乳頭瘤病毒(HPV)的持續(xù)性感染是宮頸癌的主要病因,長(zhǎng)期感染可使患宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)增加 250 倍[1-2]。宮頸癌早期常無明顯的癥狀和體征,一旦出現(xiàn)陰道流血、排液等癥狀時(shí)多提示宮頸癌已進(jìn)展到中晚期階段且有侵犯周圍組織和器官甚至發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能,此時(shí)患者多已失去最佳治療時(shí)機(jī)。因此,對(duì)宮頸癌的精準(zhǔn)診斷,尤其對(duì)高危人群的早期癌前篩查就具有極為重要的意義。目前針對(duì)宮頸病變篩查的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段主要包括基于分子生物學(xué)的HPV核酸檢測(cè)技術(shù)、基于形態(tài)學(xué)的液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè)技術(shù)和基于病理學(xué)的組織活檢技術(shù),可分別從病因、細(xì)胞病變、組織病變實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。作為及早遏制宮頸癌發(fā)生的最早期篩查技術(shù),核酸檢測(cè)技術(shù)標(biāo)本易得、結(jié)果可靠、操作簡(jiǎn)便、臨床實(shí)用性較高,主要分為DNA檢測(cè)和RNA檢測(cè)。DNA檢測(cè)針對(duì)雙鏈環(huán)狀的HPV本身,而RNA檢測(cè)針對(duì)被激活的癌基因E6、E7過表達(dá)后轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的E6/E7 mRNA[3]。雖然二者的意義明確,但是兩種方法的檢測(cè)策略與臨床疾病進(jìn)展相關(guān)性的研究還有待進(jìn)一步深入。本研究以宮頸病變的病理診斷為標(biāo)準(zhǔn),通過對(duì)比619例行宮頸病變篩查女性的HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)結(jié)果,探討兩種方法在宮頸病變篩查中的診斷價(jià)值和意義,為實(shí)現(xiàn)宮頸癌早期預(yù)防和精準(zhǔn)診斷提供幫助?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2021年9月至2022年8月于四川大學(xué)華西第二醫(yī)院進(jìn)行宮頸病變篩查的619例患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)在同一時(shí)間采集標(biāo)本進(jìn)行HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA和宮頸液基細(xì)胞學(xué)技術(shù)(TCT)檢查或組織活檢且病例資料完善;(2)性生活史超過1年;(3)既往未接受過任何形式的宮頸治療;(4)所有納入患者均對(duì)各項(xiàng)宮頸癌篩查檢測(cè)知情同意;(5)非妊娠女性。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)有任意一項(xiàng)檢查結(jié)果來自外院;(2)既往有HPV感染史或任何手段宮頸治療史;(3)存在其他臟器惡性腫瘤;(4)曾有全身化療或盆腔放射治療史;(5)標(biāo)本采集不滿意的患者。

1.2儀器與試劑 HPV DNA:檢測(cè)板和采樣工具包均購(gòu)置于QIAGEN公司;實(shí)驗(yàn)使用QIAGEN DML3000冷光儀檢測(cè)相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度,使用Microplate Heater 1恒溫加熱器為探針雜交提供條件;HPV E6/E7 mRNA:檢測(cè)試劑和采樣工具包購(gòu)置于HOLOGIC公司。檢測(cè)一體機(jī)為HOLOGIC公司全自動(dòng)核酸檢測(cè)系統(tǒng)PANTHER。

1.3方法

1.3.1HPV DNA檢測(cè) 標(biāo)本采集:窺陰器暴露宮頸,用一次性宮頸刷深入宮頸管,向同一方向旋轉(zhuǎn)6～10周,將已經(jīng)刷取下脫落細(xì)胞的宮頸刷放入裝有細(xì)胞保存液的采集管中進(jìn)行漂洗。

檢測(cè)原理:QIAGEN公司高危型人乳頭瘤病毒核酸檢測(cè)試劑盒(雜交捕獲二代法,簡(jiǎn)稱HC2)是基于微孔板上抗體的特異性捕獲和由酶催化的化學(xué)發(fā)光信號(hào)放大原理,應(yīng)用全長(zhǎng)8 000個(gè)堿基對(duì)的RNA探針進(jìn)行體外核酸雜交,可同時(shí)定性檢測(cè)被WHO確認(rèn)的13種高危型HPV亞型,包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68型。操作步驟:(1)按2∶1比例,向采集管(保存液1 mL)中加入500 μL變性裂解液,充分振蕩混勻后置于65 ℃水浴鍋孵育45 min(校準(zhǔn)品和質(zhì)控品的處理同標(biāo)本)使標(biāo)本充分裂解,釋放標(biāo)本中HPV DNA單鏈;(2)用探針稀釋液稀釋全長(zhǎng)病毒RNA探針,向微孔板中每孔分配25 μL稀釋好的探針,依次加入75 μL裂解后的標(biāo)本至各孔中充分混勻,置于65 ℃金屬浴孵育1 h使RNA探針和HPV 病毒靶DNA充分雜交形成RNA-DNA雜交體;(3)將微孔板中的液體全部轉(zhuǎn)入捕獲板中,并于搖床上以1 100～1 200 r/min震蕩1 h,使RNA-DNA雜交體被包被在微孔板上的特異性抗體捕獲;(4)吸出液體棄掉,在吸水紙上用力拍打至干;(5)向捕獲板各孔加75 μL堿性磷酸酶溶液,室溫靜置30 min,使固相界面的雜交體與堿性磷酸酶結(jié)合;(6)用預(yù)先配置的清洗液反復(fù)清洗捕獲板,盡量保證每孔沖洗的力度和時(shí)間一致,每板平均清洗6～8次,再次在吸水紙上用力拍打至干;(7)向充分清洗后的捕獲板各孔中加入75 μL顯色液,室溫、避光放置15 min后,用QIAGEN DML3000冷光儀檢測(cè)相對(duì)化學(xué)發(fā)光值信號(hào)并記錄結(jié)果。

1.3.2高危型HPV E6/E7 mRNA檢測(cè) 標(biāo)本采集:同HC2,將采樣后的拭子置于HOLOGIC公司HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)專用的新柏氏保存液中待檢。檢測(cè)原理:HOLOGIC公司Aptima HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)是基于轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù),以HPV致癌基因E6/E7的mRNA為檢測(cè)靶標(biāo),通過對(duì)標(biāo)本裂解、目的mRNA捕獲、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增和雜交保護(hù)測(cè)定對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè),可篩查14 種高危型HPV亞型,分別包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68型。檢測(cè)流程:將保存液中的液體充分混勻,吸取1 mL加入配套的標(biāo)本裂解管中,通過Aptima一體機(jī)和HPV E6/E7定性檢測(cè)試劑檢測(cè)標(biāo)本是否存在HPV mRNA。

1.3.3TCT檢查 TCT檢查采用頸管刷收集宮頸外口及宮頸管的脫落細(xì)胞于裝有保存液的小瓶中,后經(jīng)自動(dòng)化系統(tǒng)處理制成薄層細(xì)胞涂片,再經(jīng)95%酒精固定、HE染色,最后進(jìn)行光鏡檢查。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理,計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分率表示,組間比較用χ2檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各年齡段患者兩種方法檢測(cè)的陽(yáng)性率比較 619例患者中HPV DNA檢測(cè)的陽(yáng)性率為64.78%(401/619),HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)的陽(yáng)性率為60.74%(376/619)。將619例患者按年齡分為<20歲、20～<30歲、30～<40歲、40～<50歲、50～<60歲和≥60歲6個(gè)年齡段,統(tǒng)計(jì)各年齡段患者HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)結(jié)果。宮頸病變篩查主要以30～<40歲和40～<50歲的性活躍人群為主。619例患者中因<20歲患者偏少僅占3例,兩種方法檢測(cè)的陽(yáng)性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。其余各年齡段患者HPV DNA檢測(cè)的陽(yáng)性率均高于HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)的陽(yáng)性率,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各年齡段患者兩種方法檢測(cè)的陽(yáng)性率比較

2.2不同組織病理結(jié)果中HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)的陽(yáng)性率比較 619例患者根據(jù)病理結(jié)果進(jìn)行程度分級(jí),分別是炎癥組、意義不明的非典型鱗狀細(xì)胞(ASCUS)組、低度鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)組、高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)組和鱗/腺癌組。HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)的陽(yáng)性率均隨宮頸病變級(jí)別的升高而升高。炎癥組HPV DNA檢測(cè)的陽(yáng)性率(55.46%)高于HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)的陽(yáng)性率(29.21%),而ASCUS組、LSIL組、HSIL組和鱗/腺癌組HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)的陽(yáng)性率均顯著高于HPV DNA檢測(cè)的陽(yáng)性率,ASCUS組、LSIL組、HSIL組和鱗/腺癌組兩種方法檢測(cè)的陽(yáng)性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同組織病理結(jié)果中HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)的陽(yáng)性率比較

2.3兩種方法對(duì)病理分級(jí)程度為HSIL以上患者診斷價(jià)值的評(píng)價(jià) 以研究對(duì)象病理學(xué)診斷結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn),將其病理分級(jí)程度為HSIL以上的患者(包括HSIL組和鱗/腺癌組患者)統(tǒng)歸為HSIL+患者,用兩種方法(HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA檢測(cè))對(duì)HSIL+患者的診斷效能進(jìn)行比較。如表3所示,HPV DNA檢測(cè)的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值均低于HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)結(jié)果,而兩種方法聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值均高于HPV DNA檢測(cè)或HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)的結(jié)果。兩種方法聯(lián)合檢測(cè)的特異度(38.67%)低于HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)的特異度(39.65%),但高于HPV DNA檢測(cè)的特異度(37.50%)。HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)的總體符合率均明顯高于HPV DNA檢測(cè)和兩種方法聯(lián)合檢測(cè)的總體符合率。

表3 HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)HSIL+患者的診斷效能評(píng)價(jià)(%)

3 討 論

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一, 90%以上的宮頸癌發(fā)生與HPV感染密切相關(guān)[4]。HPV共有200多種型別,根據(jù)致癌能力的大小可分為高危型HPV和低危型HPV[5]。低危型HPV主要與一些疣和輕度鱗狀上皮內(nèi)病變相關(guān),高危型HPV持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的主要原因[6]。目前臨床篩查癌前病變和宮頸癌的常用方法是TCT檢查和HPV DNA檢測(cè)[7]。其中,TCT 是目前唯一能夠替代傳統(tǒng)巴氏涂片,且在篩查癌前病變和宮頸癌較傳統(tǒng)巴氏涂片更科學(xué)、更準(zhǔn)確的一種宮頸防癌篩查技術(shù)。該技術(shù)雖然有效克服了傳統(tǒng)涂片固有的局限性如涂片質(zhì)量差、涂片時(shí)細(xì)胞丟失等,但是比較依賴閱片者對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的主觀判斷,缺少客觀標(biāo)準(zhǔn),若涂片標(biāo)本血液和黏液多也會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果,因此在臨床實(shí)際的應(yīng)用中有一定局限性。HPV DNA檢測(cè)是通過雜交捕獲技術(shù)或聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)HPV的衣殼蛋白和E1基因的高度保守區(qū)域?qū)崿F(xiàn)對(duì)病毒DNA的檢測(cè)。但是這只能反映病毒是否存在,無法判斷感染的活躍狀態(tài),也不能評(píng)估致癌風(fēng)險(xiǎn)[8]。WHO宮頸癌前病變篩查和治療指南明確提出增加HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)作為宮頸癌的篩查項(xiàng)目[9]。高危型HPV的持續(xù)感染可誘導(dǎo)E6/E7癌基因通過多種途徑改變細(xì)胞微環(huán)境,造成宮頸角質(zhì)細(xì)胞永生化[10-11];隨宮頸病變細(xì)胞的進(jìn)一步惡化,無包膜的雙鏈 HPV DNA可與人體基因組發(fā)生整合,病毒致癌活性被激活,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄過程表達(dá)高水平的 HPV E6/E7 mRNA,這是導(dǎo)致細(xì)胞高級(jí)別病變的基礎(chǔ)[12-13]。檢測(cè)編碼E6/E7癌蛋白的E6/E7 mRNA更具特異度且能直接反映HPV致癌基因的轉(zhuǎn)錄活性,便于篩選出可能發(fā)展為宮頸高級(jí)別病變的女性群體[14-15]。

本研究結(jié)果顯示,炎癥組HPV DNA檢測(cè)的陽(yáng)性率(55.46%)高于HPV E6/E7 mRNA(29.21%)檢測(cè),這主要是因?yàn)榻^大多數(shù)HPV感染屬于一過性或非持續(xù)性感染,病原體可通過機(jī)體免疫力的提高而清除,不會(huì)進(jìn)一步引起細(xì)胞或組織病變;隨著病變進(jìn)展,HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)的陽(yáng)性率明顯高于HPV DNA檢測(cè)的陽(yáng)性率,提示通過檢測(cè)HPV E6/E7 mRNA轉(zhuǎn)錄物的存在可反映HPV癌基因的活化狀態(tài)。與HPV DNA檢測(cè)相比,HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)不受HPV一過性感染的干擾,可以更加準(zhǔn)確地判斷疾病進(jìn)展,HPV DNA檢測(cè)陽(yáng)性的患者可通過HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)進(jìn)行精確分流。此外,值得關(guān)注的是,年齡<20歲患者的HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)的陽(yáng)性率均為100.00%,這可以在一定程度上證實(shí)過早開始性生活是誘發(fā)HPV感染的高危因素,但因該年齡段的患者偏少,缺乏統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述,本研究表明兩種方法聯(lián)合檢測(cè)既能提示HPV感染現(xiàn)狀,又能反映高危型HPV的致癌潛力,兩種方法在靈敏度和特異度方面的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)有利于早期、精準(zhǔn)預(yù)防宮頸癌的發(fā)生,避免對(duì)一過性 HPV感染導(dǎo)致良性病變的檢測(cè)和過度治療,降低HPV感染的漏診率和癌癥發(fā)生率,同時(shí)又能減輕患者的心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),提升女性群體的健康水平。