何建春,裴昌貞,楊 雷,趙峻英,謝 嬌,李 雪△

重慶市大足區(qū)人民醫(yī)院:1.檢驗科;2.睡眠心身中心,重慶 402360

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)是一種具有易感性、多重耐藥性及強致病性的病原菌[1]。常常引起軟組織創(chuàng)口感染和肺部感染等,甚至引起血流感染等嚴重感染[2]。因其耐藥性及致病性等特性引起臨床治療難度大,預后更差,導致患者住院時間更長,患者病死率也更高。有研究報道,MRSA耐藥及毒力基因可通過SCCmec基因盒在菌株間轉(zhuǎn)移和傳播,使敏感菌獲得耐藥性,毒力弱的菌通過這種方式獲得更強的致病能力,不僅引起高致病性MRSA出現(xiàn),增加治療難度,而且易造成MRSA暴發(fā)流行,導致不同地區(qū)MRSA流行株呈現(xiàn)出區(qū)域性分布,各地流行克隆株也不同,加上該菌耐藥性在轉(zhuǎn)移傳播過程中易出現(xiàn)變異,極大增加其治療難度,應引起臨床高度重視[3]。據(jù)中國細菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng)(CHINET)公布數(shù)據(jù)顯示,MRSA檢出率由2005年的69.0%下降到2020年的31.0%,同時其他研究也表明,MRSA檢出率也呈現(xiàn)下降趨勢[4-5]。因此,本研究通過對本院MRSA臨床特征、生物膜、多位點序列分型(MLST)、耐藥機制、毒力機制及危險因素等多角度多方向進行綜合性研究,旨在為預防和控制MRSA感染提供科學依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1菌株來源 以本院2016-2020年檢出感染金黃色葡萄球菌患者(762例)為研究對象。共培養(yǎng)出非重復金黃色葡萄球菌為762株,其中,甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA) 392株(MSSA組),MRSA 370株(MRSA組);另選擇同期臨床基本資料及臨床特征相匹配的住院患者送檢細菌培養(yǎng),其培養(yǎng)結(jié)果為無細菌生長的患者(370例)作為對照組用于危險因素分析。對于生物膜、MLST、耐藥及毒力機制研究,本研究選擇2020年分離檢出的共95株MRSA用于此研究。

1.2細菌鑒定和藥敏試驗 標本采集、運送和檢驗均按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第4版要求完成,金黃色葡萄球菌經(jīng)Vitek 2全自動微生物系統(tǒng)對其進行鑒定和藥敏試驗,藥敏結(jié)果判讀參考美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)。質(zhì)控菌株是金黃色葡萄球菌 ATCC29213,購自國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心。

1.3菌株DNA提取 選擇天根細菌基因組DNA提取試劑盒提取MRSA的DNA。先向菌體中加入110 μL緩沖液GA和70 μL溶菌酶,混勻后37 ℃處理60 min;再加入20 μL蛋白酶K和220 μL緩沖液GB,70 ℃放置10 min后加入220 μL無水乙醇,混勻后加入吸附柱中,離心;再加入500 μL緩沖液GD離心,最后加入無菌蒸餾水,離心得到DNA溶液,分裝并保存在-20 ℃。

1.4MLST及構(gòu)建進化樹 MLST分析需進行PCR擴增,其步驟為按照文獻[6]中引物序列分別合成金黃色葡萄球菌7個管家基因引物,反應體系為50 μL體系,反應條件為預變性(94 ℃ 5 min)、變性(94 ℃30 s)、退火(55 ℃ 90 s)、延伸(72 ℃ 90 s)、30次循環(huán)和再次延伸(72 ℃10 min),PCR產(chǎn)物于4 ℃保存并送公司測序。將上述測序結(jié)果在MLST官方網(wǎng)站上進行序列比對,得到每個菌的ST型別。最后通過MEGA7.0軟件進行MRSA系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建,得到對應圖表。

1.5PCR檢測相關(guān)基因 PCR擴增所需模板為上述DNA,引物參考文獻[6]設計并送生工公司合成,擴增基因包括耐藥基因[mecA、mecC、aac(6′)/aph(2″)、Aph(3)-Ⅲ、ant(4′)-Ⅰa、tetM和qnrA]、毒力基因(PVL、fnbA、SEA、SEB和hla)和生物膜基因(icaA、sarA和fnbB),擴增體系為25 μL體系,具體操作如上述1.4,將PCR產(chǎn)物進行電泳并用凝膠成像觀察。

1.6生物膜形成能力檢測 用結(jié)晶紫染色法在96孔板中進行生物膜測定。將菌比濁到0.5麥氏,后加入200 μL菌懸液到96孔板中,做3個平行孔。37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h;吸掉培養(yǎng)液,加200 μL PBS沖洗3次,再加入100 μL甲醇固定15 min,風干,再用1%結(jié)晶紫染色5 min,移除染液并反復沖洗,風干,隨后加冰乙酸100 μL作用30 min,溶解結(jié)晶紫。用酶標儀在570 nm測定反應孔吸光度。其中,陰性對照僅加培養(yǎng)液,A值為每個菌3個平行孔吸光度的平均值,而臨界Ac值為陰性對照平均值+其3倍標準差。生物膜形成能力可分為4種,分別為無生物膜形成(A≤Ac),弱生物膜形成(Ac4Ac)[7]。

1.7采集病例資料 采用病例-病例-對照方式分析MRSA感染危險因素,統(tǒng)計臨床病歷系統(tǒng)和檢驗科實驗室信息系統(tǒng)中關(guān)于金黃色葡萄球菌感染患者相關(guān)資料,包括年齡、性別、基礎疾病(肺部疾病、肝膽疾病、腫瘤、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、心血管疾病和泌尿系統(tǒng)疾病)、低蛋白血癥、相關(guān)感染(創(chuàng)面感染、導管相關(guān)感染、尿路感染、肺部感染和腹腔感染)、侵入性操作(感染前手術(shù)史、呼吸機輔助通氣、導尿管和引流管)和半年內(nèi)抗菌藥物使用史等情況。

1.8統(tǒng)計學處理 采用SPSS22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料用n(%)表示,并行χ2檢驗,多因素分析采用Logistic回歸模型(逐步前進法),P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1MRSA檢出率分布 2016-2020年本院共檢出金黃色葡萄球菌824株,去重后,得到762株金黃色葡萄球菌,其中MRSA共370株,占48.56%(370/762)。2016-2020年MRSA每年檢出率依次為48.25%(69/143)、54.35%(75/138)、42.50%(51/120)、48.19%(80/166)和48.72%(95/195),除2018年MRSA檢出率稍低外,其他年的MRSA檢出率均在48.00%以上。

2.2MRSA檢出科室及標本類型分布 從科室分布看,MRSA檢出最多的前5個科室依次為普外科69株(18.65%,69/370)、耳鼻喉科47株(12.70%)、兒科43株(11.62%)、骨科40株(10.81%)和內(nèi)分泌科27株(7.3%)。從標本種類看,膿液標本最多,為142份(38.38%),其次為分泌物,為124份(33.51%),最后為痰液,為66份(17.84%)。

2.3MRSA藥敏試驗分析 金黃色葡萄球菌對各種抗菌藥物耐藥率明顯不同,耐藥率在80%以上的抗菌藥物為青霉素、頭孢西丁、苯唑西林和紅霉素,對利奈唑胺、替考拉寧和萬古霉素均敏感。兩組間青霉素、紅霉素、克林霉素和四環(huán)素的耐藥率比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 2016-2020年MRSA對常見抗菌藥物的藥敏情況[n(%)]

2.495株MRSA的ST分型結(jié)果分析 95株MRSA的MLST結(jié)果共檢出16個ST型別。3個ST型別檢出率在10%以上,分別是ST88占37.89%(36/95)、ST951占24.21%(23/95)和ST59占17.89%(17/95),累計占全部菌株的80%(76/95),剩余菌ST型別僅占20%,新的ST型別未檢出。見表2。將MRSA的ST型別進行遺傳進化樹構(gòu)建,從遺傳進化樹可以看出未出現(xiàn)明顯的聚類現(xiàn)象。見圖1。

注:不同的標本種類用對應顏色的圓圈顯示,分別為痰液用黃色顯示,膿液用藍色顯示,分泌物用綠色顯示,血液用紅色顯示,引流物用紫色顯示。

表2 95株MRSA等位基因編碼和序列型

2.595株MRSA生物膜形成能力檢測 將95株MRSA進行生物膜形成能力檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),強生物膜形成的菌為8株,占8.42%;中等生物膜形成的菌最多,為71株(74.73%);弱生物膜形成的菌為10株(10.53%);無生物膜形成的為6株(6.32%)。見圖2。

圖2 MRSA的生物膜形成能力情況

2.695株MRSA相關(guān)基因檢測結(jié)果分析 PCR結(jié)果顯示:在耐藥基因中,95株MRSA均攜帶mecA基因(100%),然后依次為:Aph(3)-Ⅲ基因57例(60.00%),aac(6′)/aph(2″)基因27例(28.42%),未檢出mecC及qnrA基因;在毒力基因中,FnbA基因攜帶最多,為93例(97.89%),然后是Hla基因為90例(94.74%),SEB基因為83例(87.37%),PVL基因最少為9例(9.47%);在生物膜基因中,SarA基因攜帶最多,為93例(97.89%),然后是icaA基因為90例(94.74%),最少為fnbB基因,為88例(92.63%)。

2.7MRSA感染的單因素分析 單因素分析結(jié)果顯示,MRSA組患者吸煙、低蛋白血癥、轉(zhuǎn)院、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、創(chuàng)面感染、肺部感染、感染前手術(shù)史、引流管和半年內(nèi)抗菌藥物使用史的構(gòu)成比顯著高于MSSA組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。MRSA組患者吸煙、轉(zhuǎn)院、低蛋白血癥、腫瘤、創(chuàng)面感染、腹腔感染、感染前手術(shù)史、和呼吸機輔助通氣的構(gòu)成比顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 MRSA感染的單因素分析[n(%)]

2.8MRSA組患者感染的Logistic回歸分析 將2.7中P<0.05單因素變量納入Logistic回歸分析,與MSSA組患者相比,低蛋白血癥、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、創(chuàng)面感染和半年內(nèi)抗菌藥物使用史是MRSA組患者感染的獨立危險因素(P<0.05)。與對照組患者相比,轉(zhuǎn)院、創(chuàng)面感染和腫瘤是MRSA組患者感染的獨立危險因素(P<0.05)。見表4、5。

表4 MRSA組 vs. MSSA組患者感染的Logistic回歸分析

表5 MRSA組 vs.對照組患者感染的Logistic回歸分析

3 討 論

由于有研究已檢出耐萬古霉素金黃色葡萄球菌,因此MRSA已成為臨床抗感染治療重難點[8-9]。本研究結(jié)果顯示,近5年本院MRSA檢出率為48.56%(370/762),明顯高于文獻[4]結(jié)果,也高于楊斌等[10]報道陜西省榆林市8家醫(yī)院的MRSA檢出率(20.2%)。產(chǎn)生這種差異結(jié)果原因可能與各地區(qū)臨床醫(yī)生使用不同抗菌藥物種類等有一定關(guān)系,提示今后工作中應加強監(jiān)控以減少MRSA。本研究還發(fā)現(xiàn)MRSA檢出與標本來源有關(guān)。膿液和分泌物分別占38.38%和33.51%,合計達71.00%以上,顯示MRSA感染主要以傷口感染為主,與有關(guān)報道結(jié)果一致[11]。MRSA檢出率最高科室為普外科,可能與MRSA常引起創(chuàng)口感染特性有關(guān)。從藥敏結(jié)果來看,MRSA對青霉素和紅霉素的耐藥率均在80%以上,也與MRSA攜帶100%mecA相符合,因mecA編碼的PBP-2a不僅能促進細胞壁形成,還與β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物低親和性,導致對青霉素普遍耐藥。未發(fā)現(xiàn)對萬古霉素和利奈唑胺耐藥細菌,由于萬古霉素有腎毒性及耳毒性等不良反應,治療時通過時間-依賴性殺菌,需監(jiān)測血藥濃度。利奈唑胺具有不發(fā)生交叉耐藥特性,治療MRSA效果明顯,可優(yōu)先考慮,也可與萬古霉素聯(lián)合用藥,以防止耐萬古霉素MRSA出現(xiàn)。院感暴發(fā)是MRSA最重要的關(guān)注點之一,而監(jiān)管院感暴發(fā)最常用手段是進行分子同源性分析,對分析MRSA傳播源頭和發(fā)現(xiàn)主要流行株有重要作用。MLST是同源性分析方法之一,適用于長時間全球分子流行病學監(jiān)控,準確反映各地MRSA主要流行株[12]。本研究發(fā)現(xiàn),本院MRSA流行型別是ST88、ST951和ST59,與文獻[13]結(jié)果基本相同,而與文獻[14]結(jié)果有些差異。

mecA基因檢出率為100%,而未檢出mecC基因,這與國內(nèi)的研究結(jié)果相一致[15]。說明本院MRSA對β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥機制是由于mecA引起。Aph(3)-Ⅲ攜帶率為60%,氨基糖苷類抗菌藥物是臨床常用抗菌藥物,其主要耐藥機制是通過產(chǎn)生氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶等酶修飾該類藥物的羥基或氨基,使MRSA核糖體與之親和力下降而引起耐藥[15]。而毒力基因中,fnbA基因和hla基因檢出率最高,達97.89%和94.74%。黏附因子FnbA由FnbA基因編碼,主要為黏附聚集作用,在MRSA感染機體時發(fā)揮功能,同時還有助于幫助微生物識別機體某些免疫系統(tǒng)位點并起封閉作用[16]。而Hla基因編碼的毒力因子為一種常見外毒素,主要功能為收縮血管平滑肌,破壞機體溶酶體和紅細胞,使血流緩慢,引起局部組織缺血壞死而致病。生物膜分析發(fā)現(xiàn),中等生物膜形成能力占74.73%,提示絕大部分MRSA能形成生物膜,生物膜引起MRSA與定植部位不能直接接觸,而減輕機體炎癥反應,有助于MRSA逃避抗菌藥物和機體免疫系統(tǒng)殺滅。從生物膜基因分析發(fā)現(xiàn)SarA、icaA和fnbB攜帶率均在92%以上,與生物膜形成能力結(jié)果相一致。葡萄球菌輔助調(diào)節(jié)子SarA是一種調(diào)控因子,起黏附作用而促進MRSA形成生物膜;而icaA是胞間黏附基因操縱子之一,主要在生物膜形成過程中發(fā)揮作用。

本研究結(jié)果顯示,與MSSA組患者相比,MRSA組患者更易發(fā)生低蛋白血癥,是MRSA組患者感染的獨立危險因素之一。機體營養(yǎng)狀況常依照血清中白蛋白水平來評估,白蛋白水平越低代表機體營養(yǎng)狀況越差,患者免疫力低下。有研究發(fā)現(xiàn),存在感染的患者常伴有低蛋白血癥,從而易引發(fā)患者發(fā)生MRSA感染[17]。本研究結(jié)果顯示,創(chuàng)面感染也是MRSA組患者感染的獨立危險因素,MRSA常存在于環(huán)境中各個角落,當患者創(chuàng)面未做好消毒,或臨床醫(yī)生在進行清創(chuàng)過程中,未做好無菌操作特別是手衛(wèi)生消毒時,定植在物表上的MRSA就容易侵犯創(chuàng)面,引起創(chuàng)面感染。提示應重點關(guān)注手衛(wèi)生消毒和無菌操作等環(huán)節(jié),從而切斷MRSA感染途徑,降低MRSA機會性感染。半年內(nèi)抗菌藥物使用史也是MRSA組患者感染的獨立危險因素。有研究表明,MRSA感染與抗菌藥物種類和使用次數(shù)有一定關(guān)系[18]。一方面,抗菌藥物反復使用使細菌在抗菌藥物選擇壓力下逐步誘導耐藥基因產(chǎn)生而引起耐藥;另外,在抗菌藥物反復使用下,敏感菌不斷被殺滅,耐藥菌被保留而大量繁殖,使MRSA逐步取代成為優(yōu)勢菌和致病菌。

總之,本院MRSA檢出率高,以普外科檢出最多,膿液標本最常見,ST88為主要流行型別,中等生物膜形成最為常見,耐藥基因(主要攜帶mecA)、毒力基因(主要攜帶FnbA)和生物膜基因(主要攜帶SarA)攜帶率高,低蛋白血癥、創(chuàng)面感染和半年內(nèi)抗菌藥物使用史是MRSA組患者感染的獨立危險因素。建議臨床減少各種侵入性操作,合理使用抗菌藥物,加強MRSA監(jiān)控,定期消毒,以期達預防和控制MRSA感染和傳播目的。