李 帥,韓 雪,馬文靜,徐 蓉,王昌敏△

1.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院檢驗科,新疆烏魯木齊 830001;2.烏魯木齊市中醫(yī)醫(yī)院檢驗科,新疆烏魯木齊 830002;3.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院腫瘤科,新疆烏魯木齊 830001

肺癌是全球最常見的惡性實體腫瘤之一,其中非小細胞肺癌(NSCLC)占80%～85%[1-3]。隨著精準(zhǔn)治療的不斷發(fā)展,NSCLC患者抗程序性死亡受體1(PD-1)及程序性死亡配體1(PD-L1)治療取得顯著進展[4-6]。有研究顯示,腸道菌群與肺癌密切相關(guān),腸道菌群可影響宿主的免疫狀態(tài),增加惡性腫瘤的易感性,且腸道微生物群可影響抗PD-1/PD-L1治療療效[7-8]。目前國內(nèi)針對NSCLC患者抗PD-1/PD-L1治療反應(yīng)與腸道菌群多樣性的相關(guān)研究較少,基于此,本研究分析NSCLC患者抗PD-1/PD-L1治療療效及其腸道菌群特征,旨在為提高臨床抗PD-1/PD-L1治療療效提供新思路及新方法。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年1月至2022年1月新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院收治的81例NSCLC患者作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合NSCLC診斷標(biāo)準(zhǔn)[9];(2)年齡18～75歲;(3)臨床資料完整;(4)接受抗PD-1/PD-L1治療。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并嚴(yán)重心、腦、腎等器官功能障礙;(2)合并其他惡性腫瘤;(3)合并血液系統(tǒng)、自身免疫系統(tǒng)疾病;(4)入院前6個月內(nèi)接受抗菌藥物、腸道微生態(tài)制劑治療;(5)合并潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病等消化系統(tǒng)疾病;(6)既往行消化道手術(shù);(7)合并嚴(yán)重精神-神經(jīng)系統(tǒng)疾病不能配合;(8)妊娠期及哺乳期女性。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審核并批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號:KY20191223416),患者或家屬對本研究知情并簽署同意書。

1.2方法 記錄患者年齡、性別等臨床資料,于入院后完善相關(guān)檢查,次日清晨開始治療前留取新鮮糞便,置于含脫氧核糖核酸穩(wěn)定劑的采集管中,分裝至EP管中,保存于-80 ℃冰箱中備用,進行菌群分析。所有患者均接受抗PD-1/PD-L1治療,直至疾病進展或出現(xiàn)無法忍受毒性,每6周評估1次患者對抗PD-1/PD-L1治療的反應(yīng),并從首次記錄之日起不少于4周的后續(xù)評估中確認(rèn)。根據(jù)實體腫瘤療效評估標(biāo)準(zhǔn)1.1,將患者分為應(yīng)答組及無應(yīng)答組兩組,其中應(yīng)答組為腫瘤部分緩解或病情穩(wěn)定,無應(yīng)答組為治療及隨訪過程中出現(xiàn)病情進展[8]。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1臨床資料 根據(jù)電子病歷系統(tǒng)收集患者年齡、體重指數(shù)(BMI)、性別、腫瘤分期、分級及合并基礎(chǔ)疾病等。

1.3.2腸道菌群分析 所有患者留取入院時患者清晨大便標(biāo)本200 g后使用密封盒內(nèi)密封,并于-80 ℃環(huán)境中保存。取樣過程中嚴(yán)格遵循無菌取樣原則。使用快速DNA提取檢測試劑盒(北京天根生化)提取大便中的總DNA,操作過程嚴(yán)格遵守試劑盒操作流程,而后將標(biāo)本委托北京諾賽基因組研究中心有限公司進行16S rRNA測序分析與菌群鑒定:經(jīng)質(zhì)檢合格后使用16S rRNA V4區(qū)引物進行27個循環(huán)的PCR。產(chǎn)物經(jīng)NanoDrop檢測合格后使用HiSeq第二代高通量測序平臺(美國Illumina公司)進行雙端測序。測序完成后采用Silva數(shù)據(jù)庫對標(biāo)本進行物種比對和注釋,使用BugBase進行表型預(yù)測。主要分析腸道菌群結(jié)構(gòu)及其α多樣性。腸道菌群α多樣性指標(biāo)包括菌群豐度指標(biāo)(Chao1指數(shù)和ACE指數(shù))及均勻度指標(biāo)(香農(nóng)-威納指數(shù)和辛普森多樣性指數(shù))。其中Chao1指數(shù)與ACE指數(shù)越大代表物種總數(shù)越多,香農(nóng)-威納指數(shù)值越大,說明腸道菌群多樣性越高。辛普森多樣性指數(shù)值越大,說明腸道菌群多樣性越低。采用主坐標(biāo)分析(PCoA)法比較兩組腸道菌群結(jié)構(gòu)及其β多樣性,采用Weight UniFrac計算法計算第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)貢獻率,采用線性判別分析(LDA)評估每組物種豐度差異,LDA評分>2為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.3.3抗PD-1/PD-L1治療療效 根據(jù)患者無進展生存期(PFS)評估患者抗PD-1/PD-L1治療療效。

1.4隨訪 對所有患者進行為期1年隨訪,前3個月每個月于門診進行隨訪,后每3個月通過微信、電話及門診隨診等對患者進行隨訪,記錄患者疾病進展、惡化及死亡情況。

2 結(jié) 果

2.1隨訪結(jié)果 隨訪過程中有5例患者失聯(lián),按脫落處理,最終納入患者76例,其中應(yīng)答組42例(截止1年隨訪終點均未出現(xiàn)疾病進展),無應(yīng)答組34例(中位PFS為5個月)。

2.2兩組臨床資料比較 應(yīng)答組吸煙患者比例顯著低于無應(yīng)答組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.648,P=0.031)。見表1。

表1 兩組患者臨床資料比較或n(%)]

2.3NSCLC患者腸道菌群α多樣性比較 無應(yīng)答組Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)及香農(nóng)-威納指數(shù)患者低于應(yīng)答組,辛普森多樣性指數(shù)高于應(yīng)答組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組患者腸道菌群α多樣性比較

2.4NSCLC患者腸道菌群β多樣性比較 采用PCoA對腸道菌群β多樣性結(jié)構(gòu)進行分析,PC1貢獻率為70.36%,PC2貢獻率為16.63%,提示應(yīng)答組患者腸道菌群β多樣性高于無應(yīng)答組。見圖1。

圖1 NSCLC患者腸道菌群β多樣性比較

2.5NSCLC患者腸道菌群不同類群差異分析 在屬水平,NSCLC患者擬桿菌屬豐度最高,與應(yīng)答組相比,無應(yīng)答組瘤胃球菌屬、羅氏菌屬及擬桿菌屬豐度較高;與無應(yīng)答組相比,而應(yīng)答組另枝菌屬、普雷沃氏菌屬、雙歧桿菌屬、毛螺旋菌屬、毛螺菌屬及志賀菌屬豐度較高(P<0.05)。見圖2。

圖2 菌群差異分析

2.6患者腸道菌群α多樣性指標(biāo)與PFS的相關(guān)性 Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)及香農(nóng)-威納指數(shù)與PFS呈正相關(guān)(r=0.526、0.579、0.539,均P<0.05),而辛普森多樣性指數(shù)與PFS呈負相關(guān)(r=-0.867,P<0.001)。

3 討 論

肺癌是全世界癌癥相關(guān)死亡的主要原因,病死率約23%,盡管肺癌的診斷及治療已取得初步成功,但肺癌預(yù)后情況仍不樂觀,晚期肺癌患者5年總生存率不足5%[10]。隨著精準(zhǔn)治療時代的來臨,抗PD-1/PD-L治療將晚期肺癌患者5年生存率增加至20%,顯著改善患者預(yù)后,為腫瘤患者的治療帶來希望[11-12]。近年來研究顯示,微生物群在維持宿主健康方面起著至關(guān)重要的作用,與癌癥發(fā)作、發(fā)展及對治療的反應(yīng)相關(guān),為提升免疫治療提供新思路[13-15]。

腸道菌群多樣性是指腸道內(nèi)定植的不同類型的微生物的數(shù)量及豐度分布,腸道菌群α多樣性是評價腸道菌群總體情況的有效指標(biāo),GOPALAKRISHNAN等[16]研究顯示,腸道菌群多樣性高的黑色素瘤患者其接受抗PD-1治療療效更優(yōu)。這與本研究結(jié)果相似。本研究結(jié)果通過對PFS與腸道菌群α多樣性指標(biāo)進行相關(guān)性分析,Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)及香農(nóng)-威納指數(shù)與PFS呈正相關(guān)(r=0.526、0.579、0.539,均P<0.05),而與辛普森多樣性指數(shù)呈負相關(guān)(r=-0.867,P<0.001)。HAKOZAKI等[17]等研究亦證實,總生存率較高的患者其腸道菌群α多樣性較高。此外,本研究結(jié)果顯示,應(yīng)答組患者腸道菌群β多樣性顯著高于無應(yīng)答組,這與SONG等[18]研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果顯示,無應(yīng)答組中瘤胃球菌屬、羅氏菌屬及擬桿菌屬富集,而普雷沃氏菌屬、雙歧桿菌屬等富集于應(yīng)答組。有研究報道,雙歧桿菌屬可增加促炎細胞因子腫瘤壞死因子的產(chǎn)生,顯著改善抗PD-L1治療后的腫瘤控制[19],這與本研究結(jié)果相似,對于應(yīng)答組患者,大多數(shù)富集細菌都為革蘭陰性菌,與免疫治療臨床反應(yīng)相關(guān),能顯著改善臨床療效[8,16]。普雷沃氏菌屬則與T細胞增殖有關(guān),在抗腫瘤環(huán)境下,免疫反應(yīng)的惡化可能有助于患者的免疫監(jiān)測能力[20-21]。而JIN等[21]進一步研究發(fā)現(xiàn),腸道微生物多樣性高的患者,其在外周記憶T細胞和自然殺傷細胞特征也顯著升高,提示腸道微生物組可能系介導(dǎo)記憶CD8+T細胞和自然殺傷細胞亞群來提升抗PD-1/PD-L治療療效。

此外,抗PD-1/PD-L治療因激活自身免疫,可能會導(dǎo)致免疫系統(tǒng)攻擊正常組織進而出現(xiàn)一系列獨特不良反應(yīng),如自身免疫性肺炎、肝炎等免疫治療相關(guān)不良反應(yīng),研究顯示,在擬桿菌門與黑色素瘤免疫治療出現(xiàn)的免疫相關(guān)不良反應(yīng)有關(guān),腸道擬桿菌可能通過上調(diào)黏膜IL-1β水平,從而誘發(fā)免疫相關(guān)結(jié)腸炎,影響患者治療[22-23]。本研究結(jié)果顯示,無應(yīng)答組患者的擬桿菌屬富集,出現(xiàn)此結(jié)果的原因可能與治療不良反應(yīng)影響后續(xù)治療相關(guān)。此外,應(yīng)答組吸煙患者比例顯著低于無應(yīng)答組,提示吸煙,甚至是既往吸煙史可能對患者腸道菌群多樣性產(chǎn)生影響,從而影響NSCLC患者抗PD-1/PD-L1治療療效。盡管目前關(guān)于抗PD-1/PD-L治療療效與腸道微生物群間的關(guān)系,仍有待進一步確認(rèn),但腸道菌群與抗PD-1/PD-L治療獲益間的聯(lián)系已初步得到學(xué)者認(rèn)可,腸道微生物群有望成為一種內(nèi)在生物傳感器,使抗PD-1/PD-L1治療更加敏感,以便改善患者臨床結(jié)局。

綜上所述,本研究結(jié)果顯示,腸道菌群多樣性與NSCLC患者接受抗PD-1/PD-L1治療反應(yīng)有關(guān),有望成為NSCLC治療潛在靶點。但本研究仍存在一定局限性,首先,本研究納入標(biāo)本有限,且僅為本院患者,故患者腸道菌群間可能存在局限性,此外,本研究隨訪時間較短,故患者腸道菌群與患者長期預(yù)后關(guān)系不慎明確,故應(yīng)進一步行多中心、大標(biāo)本的長期研究對患者進行進一步分析,以便為臨床治療提供新思路、新方法及有利的循證醫(yī)學(xué)支持。