苗小康,謝俊秋,楊雯樂,竇建琳,韓 儉

(1蘭州大學基礎醫(yī)學院實驗教學中心, 蘭州 730000; 2蘭州大學基礎醫(yī)學院病原生物學教研室)

科學技術尤其生命科學領域不斷變革發(fā)展,以及人民群眾對更高水平的醫(yī)療衛(wèi)生服務的需求,對醫(yī)學學科的發(fā)展提出了新的要求,因此新醫(yī)科應運而生。國務院辦公廳關于加快醫(yī)學教育創(chuàng)新發(fā)展的指導意見明確指出,推進“醫(yī)學+X”多學科背景的復合型創(chuàng)新拔尖人才培養(yǎng),培養(yǎng)高層次拔尖創(chuàng)新醫(yī)學人才[1]。創(chuàng)新性醫(yī)學人才的培養(yǎng)是多方位的,基礎知識、基本技能的融會貫通是其中重要的一面。按照庫恩的觀念,創(chuàng)新也需以學科范式為基礎,是對舊范式的超越和突破,基礎是創(chuàng)新的根本[2]。醫(yī)學微生物實驗是一門理論結合實踐的課程,是醫(yī)學生必修的醫(yī)學基礎課程。醫(yī)學微生物實驗課程對醫(yī)學生的教育更具有顯然的重要意義。要學好這門課程,從基本概念、原理著手是必然之道。本文將基于化學和計算機學科的分子動力學模擬技術引入醫(yī)學微生物實驗,以幫助學生提高對熱力滅菌實驗基本原理的理解,以期拋磚引玉。

熱力滅菌在醫(yī)學微生物實驗教學中是重要基礎內容,作為最常用的滅菌方法,其在幾乎所有涉及微生物的實驗中都發(fā)揮了基礎性作用。各種實驗器材、培養(yǎng)基的熱力滅菌是微生物實驗的常規(guī)及必須程序,是實現無菌操作的重要手段。利用熱力滅菌滅廢微生物培養(yǎng)物及其他感染性材料是保障生物安全的最重要措施之一。此外,熱力滅菌的理論中涉及微生物的結構及生理等基礎知識,因此,學習熱力滅菌也是對醫(yī)學微生物前期基礎知識的一次有效回顧和應用。綜上,有必要重視熱力滅菌的實驗教學。

熱力滅菌主要利用高溫對微生物菌體組成物質的結構破壞從而使其生理功能喪失,進而導致微生物死亡達到滅菌效果[3,4]。在實驗教學中,教師可以通過滅菌前后的效果對比使學生對熱力滅菌有直觀感受。而更深入的滅菌機制都發(fā)生在微觀層面,但是這些微觀層面的現象無法直觀地呈現給學生。這就阻礙了學生從微觀到宏觀的思維過程,不利于知識的全面掌握及應用。

分子動力學模擬技術利用計算機軟硬件,在分子層面模擬真實世界中不易觀察的現象。這些技術對多個學科的研究產生了重要影響。隨著技術及硬件條件的提高,分子動力學模擬技術正在被越來越多地應用于教學中[5]。熱力滅菌在微觀機理層面發(fā)生的變化主要是蛋白、核酸等生物活性物質在高溫下變性失活,而這些變化過程可以利用分子動力學模擬技術得以實現。本文介紹利用分子動力學模擬技術獲得這些微觀變化過程及其在熱力滅菌教學中的應用。

1 模擬研究

1.1 模擬思路

熱力滅菌破壞微生物的結構并使蛋白、核酸等生物大分子變性。因此,本文選取微生物的蛋白、脫氧核糖核酸(DNA)以及細胞膜模型作為模擬對象,分別模擬它們在高溫水環(huán)境中的變化過程。選取變化過程中的特征結構作為熱力滅菌微觀機制的直觀展示。

1.2 模擬方法

分子動力學模擬的軟件多種多樣。本文使用開源免費的GROMACS軟件包進行分子模擬,模擬結果的分析也使用GROMACS包中自帶的分析工具[6]。

1.2.1 蛋白質模擬 為了與教學更貼切的同時考慮模擬時長,本文選擇大腸埃希菌(E.coli)的肽脫甲酰基酶(Peptide deformylase,PDB ID:2W3T)作為代表蛋白質進行模擬。2W3T結構中包含167個氨基酸殘基,約2 700原子。獲得的PDB結構文件只保留蛋白殘基部分。為了保障變性后蛋白不與自身鏡像發(fā)生相互作用,將處理過的蛋白結構溶在邊長15 nm的立方水盒子中,導致總原子數有36萬之多。之后用鈉離子中和蛋白攜帶的負電荷,使整個系統保持電中性。經過兩次梯度下降法,使體系收斂于原子最大受力小于1 000,再進行100 ps的NVT系綜平衡(限制蛋白中原子運動)。模擬溫度為1 000 K,熱浴使用V-rescale,并根據麥克斯韋分布產生初速度。長程靜電作用利用PME方法,短程靜電和范德華力的截斷值設為1 nm。最后以平衡后的最終結構為起始結構,以1 fs步長進行1 ns的模擬,模擬參數與平衡時一致。

1.2.2 核酸模擬 核酸的模擬選擇了人心桿菌(Cardiobacteriumhominis)的一段18堿基對的DNA片段(PDBID:6ROS)。DNA片段溶于由21 154個水分子和34個鈉離子構成的邊長8.5 nm的立方盒子中。利用梯度下降法使體系中原子最大受力小于100,以達到能量最小化目的。之后利用同蛋白質模擬相同參數對核酸進行100 ps平衡及1 ns模擬,除在熱浴中對DNA和溶液分組控溫。

1.2.3 細胞膜模擬 本文利用CHARMM-GUI網絡服務構建了包含96個1-棕櫚酰-2-油酰磷脂酰甘油(POPG)、1-棕櫚?；?2-油?；字Ｒ掖及?POPE)、108個鈉離子、12個氯離子及5 149個水分子的革蘭陽性細菌質膜模型[7]。首先,按照CHARMM-GUI給出的分步模擬參數,對細胞膜進行能量最小化和平衡模擬。由于網站給出的平衡模擬時間太短,本文以前步最后模擬結構為起始,繼續(xù)平衡模擬300 ns,得到了在常溫常壓下充分平衡的細胞膜結構。其次,將常溫常壓下的平衡結構置于1 000 K的NVT系綜中進行1 ns的高溫模擬,體系熱浴為berendsen并且分為膜和溶液兩組分別控溫,其他模擬參數同蛋白質的模擬。

1.3 模擬結果

1.3.1 蛋白質模擬結果 分子動力學模擬是將體系中的原子作為一個個質點,依據牛頓力學求算不同時刻這些原子的位置得到體系隨時間變化的動力學信息。我們將模擬過程中不同時刻的各個原子位置與其初始狀態(tài)的位置進行比較,可以評價不同時刻體系的變化程度。這種原子位置變化的比較通常用RMSD值來表征,當RMSD值的變化不再劇烈波動時說明模擬體系到達了某個階段的穩(wěn)定態(tài)也即動力學模擬較為充分[8]。如圖1A所示對肽脫甲?；傅哪M可以用作動力學分析。肽脫甲?；傅恼Ｈ壗Y構中含有α螺旋、beta折疊及l(fā)oop等二級結構,整體呈球狀(如圖1B中0 ps所示)?；匦霃绞且粋€表征模擬體系緊實程度的物理量,半徑越小說明致密性越好即蛋白質結構就越穩(wěn)定。從圖1C中可以看出在模擬的初始階段蛋白結構有較明顯的松弛的趨勢;模擬后期,盡管結構還在變化,但是其回旋半徑繞均值波動。蛋白質的變性在微觀層面還體現在蛋白質二級和三級的劇烈變化以致于失去了穩(wěn)定狀態(tài)下的正常結構,包括螺旋結構的解螺旋、beta折疊中片層的解離等。圖1C中的代表性結構摘選自肽脫甲?；傅哪M軌跡,隨著時間的延長,可以觀察到蛋白質結構中各種二級結構逐漸消失,整體結構也較初始結構有了明顯的膨大。這樣的結構已經與正常結構發(fā)生很大的偏差,其正常功能也將隨之喪失。

圖1 高溫下蛋白質模擬結果

1.3.2 脫氧核酸模擬結果 高溫可以使得核酸變性,從而達到殺滅細菌的作用。脫氧核酸的變性指核酸雙螺旋鏈上堿基之間的氫鍵斷裂,堿基間的堆積力遭到破壞,進一步雙鏈解離。DNA正常的結構發(fā)生變化后,細菌的正常生理功能即被破壞,細菌死亡[9]。圖2所示為一段正常結構的DNA在高溫下發(fā)生變性、雙鏈解離的過程。伴隨多數堿基間氫鍵的斷裂,雙螺旋結構很快就發(fā)生了扭曲,在不到1ns的模擬時間內雙鏈完全解離。

圖2 高溫下DNA模擬結果

1.3.3 細胞膜模擬結果 細胞膜的主要成分是各種磷脂分子,不同類型的細菌含有的磷脂種類和數量不盡相同,但磷脂分子會隨著溫度的升高而運動增強的特性卻是一致的。本文以常用的革蘭陽性菌的模式細胞膜為對象研究高溫對其影響。生理條件下細胞膜的運動在一定范圍內,因此維持細胞形態(tài),并為細胞提供了與外界隔絕的屏障。正常情況下水分子主要通過水通道蛋白進出細胞[10],當細胞膜運動增強結構發(fā)生變化,水分子就會直接通過細胞膜進出細胞,大量的水分子自由進出細胞將導致細胞失去正常的滲透壓而死亡。本文的模擬結果表明,在高溫下,隨著模擬時間的延長,細胞膜中的水分子數量增加,同時細胞膜的厚度也有所變化。這些結果都表明高溫對細胞膜正常結構的破壞作用(圖3,黑色箭頭所示為膜中水分子)。

圖3 高溫下細胞膜模擬結果

2 模擬結果教學應用

細菌正常生理需要大量的酶參與。肽脫甲?；甘且环N金屬蛋白酶,廣泛存在于細菌體內。在細菌合成蛋白的過程中可以脫除甲硫氨酸上的甲酰基,從而使細菌能夠合成出功能化的蛋白質。脫除甲酰基的過程是細菌合成蛋白的必須過程[11]。當肽脫甲?；傅慕Y構發(fā)生重大變化后其功能會喪失進而導致細菌不能合成所需蛋白質而死亡。課堂講授時,教師很難對蛋白結構的變化有具體的描述,而高溫模擬結構變化的展示則可以使學生更直接地觀察到高溫滅菌時蛋白質變性的具體景象;結合這一蛋白的功能和結構變化將使學生對高溫滅菌的原理擁有深刻理解。

核酸也是生命的基本物質,其發(fā)揮功能也要基于正常的結構。本文所選核酸為細菌中一段CG含量較高的片段,CG含量高的核酸雙鏈結合力更強[12],需要更劇烈的作用才能使其破壞。教學過程中通過本文所示的高溫下核酸雙鏈解離過程,結合核酸的復制、轉錄等機制引導學生體會非正常結構核酸導致的功能紊亂,從而直觀體會高溫對核酸較強的變性作用,進而加深對高溫滅菌原理的印象。

細胞膜作為細胞的基本組成部分是細胞正常生理的基本保障,但在細菌的高溫滅菌中較少提及。本文所示細胞膜中水分子的變化過程間接反映了其結構的穩(wěn)定性變化,結合細胞膜正常生理功能,可以拓展學生對高溫滅菌中細胞的多方面變化的理解。此外,通過分子模擬得到上述結構變化過程的軌跡信息,將軌跡信息轉變?yōu)閯赢嬔菔臼箤W生了解到高溫滅菌的動態(tài)過程。這將極大地增加課堂的吸引力,從而提升教學效果。

醫(yī)學微生物實驗作為醫(yī)學生的基礎課程之一,對培養(yǎng)醫(yī)學生認識掌握感染性疾病基礎具有重要的支撐作用[13]。醫(yī)學生掌握扎實的醫(yī)學微生物知識是其培養(yǎng)訓練過程的必須要求。醫(yī)學知識內容龐雜,學生任務繁重,因此使用更多的新穎性、交叉融合性的教學手段對增強學生學習興趣,提高學習效率將會起到事半功倍的效果。

在醫(yī)學教育邁入高質量發(fā)展的新時代,國家對醫(yī)學教育提出了系統的指導意見,其中醫(yī)學教育創(chuàng)新是基本原則之一。創(chuàng)新教育教學方法是醫(yī)學教育創(chuàng)新的重要方面,對提高醫(yī)學人才培養(yǎng)質量具有直接作用。教學方法創(chuàng)新形式豐富多樣,而內涵則在于提高學生對知識的理解運用能力。教學方法的創(chuàng)新在一定程度上依賴于交叉學科的發(fā)展,當相關學科的技術發(fā)展能夠被較為便捷地應用于目標學科時,應適時地改革創(chuàng)新教學方法從而提高學生掌握知識的能力。本文將能表現出微觀過程的分子動力學模擬應用于實驗教學中,期望這種教學方式能為更多教學創(chuàng)新的產生提供經驗。