朱孟錦,甘孟杰,陳傲,李鳳歌,湯諹

［作者單位］昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚病與性病學(xué)科,云南 昆明 650032

增生性瘢痕(hypertrophic scar,HS)的主要特點是纖維化增加、膠原蛋白沉積、微循環(huán)及血供改變等[1]。由于內(nèi)皮細胞增生凸入使微血管阻塞引起缺氧,刺激毛細血管擴張,內(nèi)皮細胞分化為肌成纖維細胞和成纖維細胞,大量膠原合成,纖維蛋白沉積,加重血管阻塞,最終導(dǎo)致增生性瘢痕的形成[2]。病變表現(xiàn)為隆起、表面光滑的暗紅色腫物,形態(tài)常與原始創(chuàng)面一致,初期可伴疼痛、瘙癢,后隨時間推移和血管再生,血氧供應(yīng)改善,瘢痕逐步成熟,可出現(xiàn)色澤變暗、體積萎縮、癥狀變輕。增生性瘢痕常對患者美觀造成影響,嚴重時還可影響患者身心健康。因此,建立合適的體內(nèi)、外模型有助于理解導(dǎo)致異常瘢痕形成的關(guān)鍵事件,并提供新的治療選擇。本文以增生性瘢痕為主體,就其體內(nèi)、體外模型研究進展作一綜述。

1 增生性瘢痕體內(nèi)模型

1.1兔耳解剖特異性部位增生性瘢痕的誘導(dǎo)——兔耳模型 目前的增生性瘢痕動物模型存在局限性,部分原因是缺乏準確、實用、可重復(fù)和經(jīng)濟的動物模型進行系統(tǒng)的研究。各種動物模型,包括豬、兔和鼠,已被用來復(fù)制皮膚損傷,但方法較為繁瑣。兔因其成本低、實驗皮膚面積充足、抗感染能力強而成為首選的模型動物。

既往最常用的兔瘢痕模型是兔耳模型,該模型是研究瘢痕組織行為的一種高度可靠、靈敏、實用的模型,常選用白色成年新西蘭母兔。

首先,在每只兔耳耳腹制造4個圓形全層皮膚創(chuàng)面,創(chuàng)面直徑約5～6 mm,累及表皮、真皮和軟骨膜[3]。切除皮膚全層會引發(fā)上皮化延遲,進而導(dǎo)致增生性瘢痕。研究顯示,建立增生性瘢痕兔耳模型選擇在兔耳腹側(cè)內(nèi)側(cè)緣中、下部位作為創(chuàng)口最為合適,此處瘢痕形成率高,持續(xù)時間長[4]。然而,此類模型并不理想,由于其創(chuàng)面均累及軟骨膜,而人皮膚損傷只需達到真皮淺層即可產(chǎn)生增生性瘢痕,并且該模型產(chǎn)生增生性瘢痕的厚度不如人明顯,部位也較為局限,持續(xù)時間短,因此,兔耳模型有待于進一步研究與發(fā)展。

1.2注射無水乙醇建立長期增生性瘢痕模型——兔背模型 無水乙醇可通過蛋白質(zhì)的脫水和變性對組織產(chǎn)生直接的細胞毒性作用,并在局部引發(fā)強烈的炎癥反應(yīng)[5]。無水乙醇被廣泛用于血管畸形的硬化治療,但這種治療方法可能會因肌肉纖維化而造成嚴重的并發(fā)癥[6]。慢性乙醇濫用可誘導(dǎo)骨骼肌、心臟及肝臟等多種器官的纖維化反應(yīng)[7-8]。鑒于上述發(fā)現(xiàn),通過向兔背部真皮內(nèi)注射99.5%無水乙醇(2 mL/kg),無水乙醇滲入皮下和淺筋膜,使真皮組織增厚,刺激真皮纖維增生,形成增生性瘢痕。其表現(xiàn)出人類增生性瘢痕的組織病理學(xué)特征,包括平行的膠原纖維取向,真表皮增厚,廣泛的膠原沉積和真皮附屬結(jié)構(gòu)的消失。注射無水乙醇后,免疫印跡分析兔背瘢痕中的Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表達明顯增加,其表達水平與免疫組織化學(xué)結(jié)果一致,符合人增生性瘢痕特征[9]。

綜上所述,無水乙醇誘導(dǎo)的兔背模型可以作為增生性瘢痕的一種新的、成功的、可重復(fù)性的長期動物模型,該模型易實現(xiàn),纖維性增生可持續(xù)1個月以上,瘢痕明顯,為進一步研究增生性瘢痕的發(fā)病機制提供了一個可行和有用的工具。然而,該模型的局限性在于它不能永久地模擬人增生性瘢痕的特征。在以往的研究中,最常用、公認的兔瘢痕模型是兔耳模型,該模型是增生性瘢痕病理學(xué)研究的前沿,但需要去除軟骨膜以延遲創(chuàng)面愈合,隨后的增生性瘢痕不僅與皮膚細胞有關(guān),還與軟骨細胞對創(chuàng)面的反應(yīng)有關(guān)。

兔背注射無水乙醇模型與兔耳模型相比,無水乙醇組手術(shù)時間明顯短于兔耳模型組,且易于重復(fù)實現(xiàn)。無水乙醇組纖維化增生持續(xù)時間較長,平均持續(xù)時間接近30 d,且60 d時瘢痕仍較明顯。而兔耳模型組術(shù)后30 d,瘢痕開始變平,顏色開始退色,60 d時創(chuàng)面幾乎完全愈合,因此兔背注射無水乙醇模型更有利于探討瘢痕形成的機制[9]。

1.3紅色雌性杜洛克豬模型 豬模型因其傷口愈合過程、愈合時間與人相似,可為培養(yǎng)和分析提供充足的組織標本,且表皮/真皮厚度、神經(jīng)成分和毛發(fā)密度等方面與人的皮膚特征相似而成為研究增生性瘢痕的模型[10-12]。此外,在多個豬創(chuàng)傷模型研究中,創(chuàng)傷后所形成的瘢痕特征,包括厚度和充血,在臨床上與人增生性瘢痕最相似[13]。免疫學(xué)上,異種移植和無細胞豬生物皮膚替代品通常用于燒傷患者和腹壁重建[13]。

Harunari等[14]在紅色雌性杜洛克豬(female red duroc pig,FRDP)背部皮膚制造7 cm×7 cm傷口后形成的瘢痕中發(fā)現(xiàn),肌成纖維細胞、肥大細胞和膠原結(jié)節(jié)數(shù)量增加,與人增生性瘢痕相似。2017年,Blackstone等[15]在FRDP皮膚上建立了燒傷誘導(dǎo)的增生性瘢痕模型,并將燒傷傷口與刀傷傷口進行了比較,結(jié)果表明燒傷模型產(chǎn)生的瘢痕更類似于人增生性瘢痕。2018年,DeBruler等[10]建立了一種燒傷切除自體移植模型,FRDP全層燒傷后移植自體網(wǎng)狀中厚皮,形成了與人增生性瘢痕相似的外觀和結(jié)構(gòu)。組織學(xué)上,FRDP深層切除創(chuàng)面顯示膠原纖維紊亂和膠原結(jié)節(jié)。此外,在豬身上切除皮瓣下的肌腱膜后橢圓形切除皮膚,可導(dǎo)致增生性瘢痕,其宏觀/微觀和生化特征類似于人增生性瘢痕[16]。

但豬體型大、費用昂貴、操作及圈養(yǎng)難度大,導(dǎo)致實驗進展困難。盡管正常的豬皮與人類皮膚最相似,但產(chǎn)生的增生性瘢痕在外觀上與人也不完全相同,比如其產(chǎn)生過程無明顯發(fā)紅的色澤。

1.4切除肉膜聯(lián)合煤焦油誘導(dǎo)增生性瘢痕模型——豚鼠模型 煤焦油可通過化學(xué)刺激或其對生物系統(tǒng)的毒性作用刺激開放性傷口,導(dǎo)致瘢痕肥大。并且豚鼠比豬、裸鼠更便宜,也容易飼養(yǎng)。

Aksoy等[16]在豚鼠軀干背側(cè)環(huán)狀切除形成傷口,后于傷口兩側(cè)進行肉膜切除,僅于一側(cè)創(chuàng)面涂煤焦油。僅切除肉膜造成的傷口,在4周內(nèi)愈合,形成紅斑和邊緣隆起的瘢痕,但葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)活性不高。切除肉膜聯(lián)合煤焦油處理的豚鼠創(chuàng)面愈合后形成了具有增生性瘢痕特有的形態(tài)和生化特性的瘢痕。

豚鼠增生性瘢痕具有與人增生性瘢痕相似的病理特征:粗大不規(guī)則的膠原束、膠原結(jié)節(jié),真皮內(nèi)有肌成纖維細胞,周圍有致密的膠原纖維聚集體,葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)活性高于正常瘢痕和正常皮膚的G6PD酶活性等。

綜上所述,豚鼠實驗性增生性瘢痕具有與人增生性瘢痕相似的病理特征和生化特性。這個實驗性的瘢痕模型是一種新的、實用的、經(jīng)濟的模型,可研究增生性瘢痕的病理生理學(xué)和治療方法的有效性。但煤焦油的毒性效應(yīng)導(dǎo)致的死亡率是該模型的一個缺點,可以通過將煤焦油的用量限制在剛好覆蓋傷口和正常皮膚的邊緣,等待數(shù)日使傷口邊緣附著在胸壁上,以防止煤焦油擴散至肉膜和胸壁肌肉組織之間的死腔中,從而將死亡率降至最低,并盡可能使用雄性動物,以減少動物損失[16]。

1.5人增生性瘢痕裸鼠模型

1.5.1人全厚皮膚移植 楊東運等[17]在裸鼠背部制作2.0 cm×1.5 cm的全層皮膚缺損創(chuàng)面,移植人的全厚皮膚,皮片存活后用加熱過的銅棒進行深度燙傷,移植物干痂脫落后產(chǎn)生與人增生性瘢痕類似的瘢痕增生,且持續(xù)時間長,因此能觀察創(chuàng)面愈合至增生性瘢痕形成的全過程,對進一步深入研究增生性瘢痕的發(fā)病機制有重要意義。此外,將剝離的中厚皮片移植到裸鼠身上,異種移植的小鼠出現(xiàn)了類似于人增生性瘢痕的紅色、隆起、有光澤的瘢痕,與正常皮膚和成熟瘢痕相比,增生性異種瘢痕中肥大細胞密度增加[18],毛囊等附屬器結(jié)構(gòu)和網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)消失,成纖維細胞增多,平行于表面的螺旋狀膠原纖維增多,肌成纖維細胞減少,核心蛋白聚糖減少,二聚糖表達增加[19]。這些瘢痕在形態(tài)、組織學(xué)和免疫組織化學(xué)上與人增生性瘢痕一致,平均持續(xù)時間為135 d。然而,尚不清楚這種瘢痕形成過程是否與人增生性瘢痕的形成過程完全一致。2011年,Wang等[20]將正常人腹部中厚皮膚或全厚皮膚移植到無菌小鼠背部的全厚切除傷口上,在移植2個月后形成了類似于人增生性瘢痕的凸起的、較厚的紅色瘢痕。此外,與全厚皮膚相比,移植中厚皮膚所形成的瘢痕更大,這與中厚皮膚中巨噬細胞、肥大細胞和纖維細胞數(shù)量顯著增加有關(guān)[20]。因此,該模型為研究增生性瘢痕的形成和測試新的治療方案提供了一種很有前景的技術(shù)。

1.5.2增生性瘢痕組織直接移植 有學(xué)者將增生性瘢痕植入裸鼠皮下,移植物可存活3個月左右,其體積隨時間逐漸增大,且原增生性瘢痕特性保持不變[21]。Qiu等[22]在裸鼠的肩胛間區(qū)植入人增生性瘢痕,此移植物保留人類瘢痕的形態(tài)、組織型特征和活力超過50 d,表現(xiàn)為具有人增生性瘢痕特有的硬度,增厚并局限于植入部位,密集的膠原束束縛在網(wǎng)狀真皮中。

但將人瘢痕組織植入免疫缺陷動物體內(nèi),會使其與體內(nèi)環(huán)境隔離,且動物自身的免疫缺陷使其發(fā)病率和死亡率均較高,阻礙了動物模型的發(fā)展[23]。

綜上所述,目前增生性瘢痕體內(nèi)模型主要有兔模型(兔背、兔耳)、FRDP模型、豚鼠模型和裸鼠模型,每種模型都有其各自的特點,但均需要進一步的完善。因此,一種理想的增生性瘢痕體內(nèi)模型,其建立遠非一日之功,有待于進一步的研究。

2 增生性瘢痕體外模型

目前已有大量研究增生性瘢痕的動物模型,但這些模型與人皮膚在生理、免疫環(huán)境及傷口愈合過程等方面有顯著差異,因此構(gòu)建體外模型十分重要。

2.1細胞培養(yǎng) 細胞培養(yǎng)技術(shù)是從瘢痕中分離出真皮來源的細胞,如成纖維細胞、內(nèi)皮細胞,及表皮來源的角質(zhì)形成細胞,并將它們二維培養(yǎng)在塑料基質(zhì)/培養(yǎng)皿上[24]。細胞培養(yǎng)有助于更好地了解增生性瘢痕中成纖維細胞的活性,角質(zhì)形成細胞隨后參與瘢痕形成的過程(通過旁分泌信號),以及生物標記物表達。二維細胞培養(yǎng)模型已廣泛應(yīng)用于瘢痕研究,主要包括兩種培養(yǎng)類型:來自皮膚或不同類型瘢痕的成纖維細胞的單一培養(yǎng),以及這些成纖維細胞與另一種細胞類型(如角質(zhì)形成細胞或免疫細胞)的共培養(yǎng)。

在早期,細胞模型僅為單層細胞環(huán)境,即比較正常組織和瘢痕組織中的成纖維細胞,或?qū)⒄Ｆつw成纖維細胞分化為瘢痕表型。但皮膚是由多種細胞組成的,通過Transwell技術(shù)把成纖維細胞與角質(zhì)形成細胞共培養(yǎng),可研究二者間相互作用及影響[25]。然而,這些基于單層細胞培養(yǎng)的機制不能完全概括整個皮膚中存在的組織結(jié)構(gòu)、細胞和基質(zhì)的相互作用以及細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。

2.2器官培養(yǎng) 三維器官培養(yǎng)模型,如成纖維細胞填充的膠原晶格(FPCL)和器官型培養(yǎng)模型,能更好體現(xiàn)人體皮膚的體內(nèi)三維微環(huán)境,且已被證明對瘢痕形成的研究是有用的。FPCL模型由三維膠原基質(zhì)組成,它通過一個稱為“晶格收縮”的過程收縮;器官型培養(yǎng)模型是通過分離和培養(yǎng)人體皮膚瘢痕的不同細胞類型來產(chǎn)生器官型皮膚,形成多細胞層[26]。

2.2.1FPCL模型 FPCL模型已成為研究三維基質(zhì)中細胞-結(jié)締組織相互作用的相關(guān)工具。Bell等首次描述了利用FPCL模型對成纖維細胞收縮進行的體外研究,以了解傷口收縮和瘢痕攣縮的相關(guān)機制。該模型可研究來自不同瘢痕類型的成纖維細胞與真皮樣基質(zhì)中膠原蛋白的相互作用,有可能闡明傷口收縮和瘢痕攣縮的相關(guān)機制[27]。

2.2.2器官型培養(yǎng)模型 器官型培養(yǎng)模型包括Ⅰ型膠原基質(zhì)中成纖維細胞的簡單培養(yǎng)和完全分層的多細胞培養(yǎng)模型。簡單的器官型培養(yǎng)模型包括在牛/鼠Ⅰ型膠原基質(zhì)中培養(yǎng)增生性瘢痕成纖維細胞,不含任何表皮角質(zhì)形成細胞。另一種器官型培養(yǎng)模型將真皮成纖維細胞和表皮角質(zhì)形成細胞進行共培養(yǎng),并進行氣-液界面培養(yǎng),以允許表皮分層。即將皮膚成纖維細胞培養(yǎng)到更復(fù)雜的細胞外基質(zhì)成分衍生的基質(zhì)(如牛膠原蛋白-糖胺聚糖聚合物基質(zhì))上,后培養(yǎng)角質(zhì)形成細胞,以形成結(jié)構(gòu)更為堅固的真皮支架,使其具有完全分層的表皮成分[28]。

2.2.3全皮膚器官培養(yǎng)模型 將人增生性瘢痕外植體植入濃縮的膠原凝膠基質(zhì)中,結(jié)果表明,包埋在膠原凝膠基質(zhì)中的增生性瘢痕外植體在形態(tài)上保存良好,且在氣-液界面具有表皮的外植體形態(tài)要優(yōu)于膠原浸泡的外植體[24]。

2.3組織工程模型 van den Broek等[29]在含皮下脂肪來源的間充質(zhì)干細胞(Asc)和真皮成纖維細胞的真皮基質(zhì)上培養(yǎng)重建表皮,構(gòu)建增生性瘢痕的組織工程模型,即將Asc及真皮成纖維細胞種植在Transwell皿上,將健康角質(zhì)形成細胞種植于無細胞真皮基質(zhì)上,浸沒培養(yǎng)7 d后,將含角質(zhì)形成細胞的基質(zhì)置于Asc和成纖維細胞之上,使Asc和成纖維細胞遷移至基質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中進一步培養(yǎng),皮膚替代物形成后,加入燒傷創(chuàng)面滲出液或其他刺激因子,如趨化因子CCL27等培養(yǎng)24 h后進行測試。該方法特點是將ASC、真皮成纖維細胞及角質(zhì)形成細胞共同培養(yǎng),觀察3種細胞對不同刺激的反應(yīng),進而討論其在創(chuàng)面愈合中的不同作用,盡管該模型有所改進,但僅能代表脂肪組織外露的嚴重創(chuàng)傷(如燒傷等)引起的增生性瘢痕,而不能代表常規(guī)手術(shù)切除形成的病理性瘢痕[30]。

2.4人類皮膚等效物培養(yǎng)(人工皮) 細胞及器官培養(yǎng)不能準確再現(xiàn)體內(nèi)復(fù)雜的生理環(huán)境,動物模型的解剖生理結(jié)構(gòu)與人體不同,因此構(gòu)建人類皮膚等效物(human skin equivalent,HSE)來研究病理性瘢痕和其他皮膚病,以及促進愈合過程的重建手術(shù)顯得尤為重要。HSE是一種體外3D模型,它不僅可以模擬完全分層的表皮(包括基底層、棘層、顆粒層和角質(zhì)層),還可以模擬含有成纖維細胞的真皮層,這些多層和多細胞體外模型具有與原生人類皮膚相似的皮膚厚度和組織結(jié)構(gòu),是研究增生性瘢痕的合適模型[31]。該模型通常由成纖維細胞和初級角質(zhì)形成細胞以特定方式共同培養(yǎng)組成,可以形成一個類似于正常皮膚表皮的有組織細胞層[28]。應(yīng)用HSE模型建立深度燒傷創(chuàng)面愈合模型,用改良的烙鐵涂抹接觸燒傷(60 ℃、80 ℃、90 ℃),在燒傷后第1天和第7天觀察傷口,燒傷后HSE表現(xiàn)為與增生性瘢痕相似的形態(tài)和特征,如成纖維細胞增殖、膠原結(jié)節(jié)數(shù)量增加、真皮和表皮增厚、再上皮化等[31]。應(yīng)用HSE模型,可以研究細胞間、細胞與細胞外基質(zhì)間的相互作用,HSE已成為體外皮膚病研究的有利工具,有助于了解皮膚穩(wěn)態(tài)和傷口愈合的機制,從而找到幫助傷口愈合的有效治療方法以及進行瘢痕的研究[24]。隨著HSE的發(fā)展,瘢痕體外模型將在瘢痕發(fā)生發(fā)展機制及有效治療方案等研究方面發(fā)揮更大的效力。此模型的不足之處在于,HSE是人工制造的環(huán)境,缺乏皮膚組織的其他成分,如成熟的細胞外基質(zhì)、血管、炎性細胞、間質(zhì)因子等。因此,仍需進一步研究,建立更加合適、全面的增生性瘢痕體外模型。

綜上所述,增生性瘢痕體外模型目前主要包括細胞培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、組織工程模型以及HSE。細胞培養(yǎng)簡單經(jīng)濟,但無菌環(huán)境要求高,且成分單一,不能更好地進行深入研究。器官培養(yǎng)和細胞培養(yǎng)相比,保留了更多的細胞和結(jié)構(gòu),更具有實用性。組織工程模型是一項快速發(fā)展的技術(shù),它將細胞、工程和材料方法巧妙地結(jié)合起來代替生物功能,發(fā)掘潛力大。HSE可研究皮膚組分之間的相互作用,但組分不完整,有待進一步完善。

3 總結(jié)與展望

組織工程領(lǐng)域發(fā)展顯著,有望為克服現(xiàn)有瘢痕模型的缺點提供可能的解決方案。然而其仍存在一些局限性,例如無法監(jiān)測重建皮膚的長期演變,以及支持重建瘢痕組織中異常的成纖維細胞表型[26]。Sunaga等[30]建議,在未來的研究中,從人病理性瘢痕中產(chǎn)生永生化細胞系,以避免這種限制,從而有可能在保證表型的情況下進行長期實驗。另一個限制是,大多數(shù)組織工程皮膚模型不包括皮下組織層,也沒有血管化。因此,未來的工程皮膚模型應(yīng)包括更多的特征,以便在解剖學(xué)和功能(機械和生理學(xué))上模擬天然皮膚的所有特征。

利益沖突:所有作者均聲明無利益沖突