褚莉,齊元春,孫利,李秀玲,段樹(shù)卿

作者單位: 067000 河北省承德市,頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司(褚莉、齊元春、孫利、李秀玲、段樹(shù)卿) 067000 河北省承德市,河北省中藥新輔料技術(shù)創(chuàng)新中心(褚莉、齊元春、李秀玲、段樹(shù)卿)

兒童清肺丸是兒科臨床常用內(nèi)服丸劑,其組方由麻黃、黃芩、炒苦杏仁、石膏、甘草、蜜桑白皮、瓜蔞皮、板藍(lán)根、橘紅等22味中藥材組成,具有化痰、止咳、解表、清肺功能,臨床上用于小兒風(fēng)寒外束、肺經(jīng)痰熱所致的面赤身熱、痰多黏稠、咳嗽氣促、咽痛聲啞等癥,療效顯著[1]。兒童清肺丸現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國(guó)藥典》2020年版一部,含量測(cè)定項(xiàng)下規(guī)定對(duì)黃芩苷進(jìn)行檢測(cè)[1]。除丸劑的常規(guī)檢驗(yàn)外,兒童清肺丸質(zhì)量控制相關(guān)文獻(xiàn)中,有采用薄層色譜法對(duì)兒童清肺丸中麻黃及黃芩進(jìn)行定性鑒別,或采用高效液相色譜法對(duì)兒童清肺丸中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿進(jìn)行含量測(cè)定[2-3];藥效學(xué)試驗(yàn)研究表明,兒童清肺丸具有良好的鎮(zhèn)咳、化痰、平喘、解熱、抗炎及抑菌作用[4-7]。黃芩中的主要活性成分黃芩苷、漢黃芩苷等,具有清熱抑菌、抗炎解毒作用[8-9],與該藥藥理作用一致。結(jié)合分子生物學(xué)及化學(xué)方法對(duì)兒童清肺丸的物種組成進(jìn)行鑒定研究,建議將馬兜鈴酸Ⅰ含量作為評(píng)價(jià)兒童清肺丸的控制指標(biāo)性成分之一[10]。本研究建立高效液相色譜法測(cè)定兒童清肺丸中漢黃芩苷的含量測(cè)定方法,報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1 200型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫,DAD檢測(cè)器);色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18柱(4.6×150 mm,5 μm);十萬(wàn)分之一電子分析天平(梅特勒—托利多,型號(hào):XSE205DU);數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器,型號(hào):KQ-500DE)。

1.2 試藥 對(duì)照品漢黃芩苷(批號(hào):111760-201502,濃度:98.0%),來(lái)源于上海詩(shī)丹德生物技術(shù)有限公司;兒童清肺丸(批號(hào)分別為:W00101,W00102,W00103,W00104,W00105,W00106)來(lái)源于頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司;乙腈(色譜純,美國(guó)Fisher);磷酸(分析純,天津佳興化工玻璃儀器工貿(mào)有限公司);乙醇(分析純,天津佳興化工玻璃儀器工貿(mào)有限公司);水為三級(jí)反滲法制得純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);流動(dòng)相為乙睛-0.4%磷酸溶液(27∶73);流速為1.0 ml/min;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣體積為10 μl;檢測(cè)波長(zhǎng)為276 nm;理論塔板數(shù)按漢黃芩苷峰計(jì)算應(yīng)≥5 000。

2.2 溶液配制

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備:精密稱取漢黃芩苷對(duì)照品適量,使用70%乙醇溶液溶解,制成濃度為0.05 mg/ml的漢黃芩苷對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備:取兒童清肺丸樣品適量,制成小顆粒狀,混勻,取顆粒狀的兒童清肺丸1.5 g,進(jìn)行精密稱定,放置于50 ml具塞錐形瓶中,加入70%乙醇溶液25 ml,密塞后稱重,進(jìn)行超聲處理(功率500 W、頻率40 kHz)45 min,冷卻至室溫再次稱重,使用70%乙醇溶液補(bǔ)重,搖勻,濾過(guò),續(xù)濾液再用0.45 μm濾膜過(guò)濾,即為供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備:取兒童清肺丸處方中除黃芩藥材的其他藥材按比例及工藝制備缺黃芩陰性對(duì)照樣品,按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。

2.3 空白試驗(yàn) 分別精密吸取“2.2.1”“2.2.2”“2.2.3”項(xiàng)下的對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件,依次進(jìn)行色譜分析測(cè)定,記錄色譜圖。結(jié)果顯示,在該色譜條件下,漢黃芩苷峰和相鄰雜峰良好分離,陰性對(duì)照樣品對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)干擾,見(jiàn)圖1、圖2、圖3。

圖1 漢黃芩苷對(duì)照品空白試驗(yàn)色譜圖

圖2 供試品空白試驗(yàn)色譜圖

圖3 陰性樣品空白試驗(yàn)色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察 取漢黃芩苷對(duì)照品適量,精密稱定,加70%乙醇分別制成濃度為9.92、24.75、39.68、49.60、74.40 μg/ml的對(duì)照品溶液,按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,進(jìn)樣量為10 μl,以對(duì)照品的峰面積值為縱坐標(biāo)(Y),以對(duì)照品的濃度值為橫坐標(biāo)(X),進(jìn)行線性回歸分析并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為Y=4 479.4X-15.097,r=0.999 8。試驗(yàn)結(jié)果表明,漢黃芩苷在9.92～74.40 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下漢黃芩苷(0.049 6 mg/ml)對(duì)照品樣品溶液,按上述色譜條件進(jìn)樣,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄色譜圖峰面積,計(jì)算RSD值。結(jié)果顯示,漢黃芩苷峰面積的RSD值為0.09%,提示儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取兒童清肺丸(批號(hào):W00101)粉末樣品9份,精密稱定,1～3每份1.25 g,4～6每份2.5 g,7～9每份5.0 g,按上述供試品溶液制備方法平行制備樣品溶液,按上述色譜條件進(jìn)樣,記錄色譜圖峰面積,計(jì)算樣品中漢黃芩苷含量及RSD值。結(jié)果顯示,本批兒童清肺丸中漢黃芩苷平均含量為0.57 mg/g,RSD值為1.55%(n=9),提示該樣品處理方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取復(fù)方石韋片樣品適量,按上述供試品溶液制備方法平行制備樣品溶液,按上述色譜條件進(jìn)樣,分別于0、1、2、3、4、5、6、7、8 h時(shí)進(jìn)樣,記錄色譜圖峰面積,計(jì)算RSD值。結(jié)果顯示,漢黃芩苷峰面積的RSD值為0.23%,提示復(fù)方石韋片供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性符合要求。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的同批次兒童清肺丸樣品約0.75 g,精密稱定,共9份,分別加入3種不同濃度的漢黃芩苷對(duì)照品適量,混勻,按上述供試品溶液制備方法平行制備樣品溶液,按上述色譜條件進(jìn)樣,記錄色譜圖峰面積,計(jì)算加樣回收率及RSD值,結(jié)果顯示,漢黃芩苷平均加樣回收率為100.92%,RSD值為1.08%。提示該方法準(zhǔn)確度良好,見(jiàn)表1。

表1 漢黃芩苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 檢測(cè)限 取標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液中濃度最低的對(duì)照品溶液,逐級(jí)稀釋對(duì)照品溶液,按上述色譜條件進(jìn)樣,測(cè)得信噪比為3∶1時(shí),確定檢測(cè)限為0.000 072 38 μg。

2.10 定量限 取標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液中濃度最低的對(duì)照品溶液,逐級(jí)稀釋對(duì)照品溶液,按上述色譜條件進(jìn)樣,測(cè)得信噪比為10∶1時(shí),確定定量限為0.000 258 5 μg。

2.11 樣品含量測(cè)定 取待測(cè)的6批兒童清肺丸樣品,按上述供試品溶液制備方法平行制備樣品溶液,按上述色譜條件進(jìn)樣,計(jì)算樣品含量。結(jié)果顯示,6批兒童清肺丸中漢黃芩苷含量為0.55～0.64 mg/g,見(jiàn)表2。

表2 兒童清肺丸樣品含量測(cè)定結(jié)果 (mg/g)

3 討 論

3.1 不同提取溶劑的對(duì)比選擇 根據(jù)黃酮類化合物性質(zhì),難溶于水,可溶于甲醇、乙醇,易溶于乙酸乙酯、乙醚等有機(jī)溶劑的性質(zhì),本研究參照相關(guān)文獻(xiàn)[10-17],分別考察了甲醇溶劑、70%甲醇溶劑、50%甲醇溶劑、乙醇溶劑、70%乙醇溶劑和50%乙醇為溶劑測(cè)定漢黃芩苷含量,結(jié)果甲醇溶劑、70%甲醇溶劑、50%甲醇溶劑、70%乙醇溶劑、50%乙醇溶劑的含量測(cè)定結(jié)果基本一致,由于甲醇溶劑毒性相較其他溶劑大,50%乙醇溶劑較其他溶劑溶液黏,不易過(guò)濾,因此選用70%乙醇溶劑為提取溶劑。

3.2 不同提取溶劑體積的對(duì)比選擇 本研究考察了不同提取液(70%乙醇溶劑)體積分別為10 ml、25 ml、50 ml時(shí)對(duì)樣品含量測(cè)定結(jié)果的影響,結(jié)果顯示,當(dāng)提取液體積為25 ml與50 ml時(shí)測(cè)得樣品中漢黃芩苷的含量無(wú)明顯差異,且均高于10 ml體積提取液時(shí),說(shuō)明提取溶劑加入25 ml的提取液已將樣品提取完全。

3.3 不同提取時(shí)間的對(duì)比選擇 本研究考察了不同超聲時(shí)間:超聲15、30、45、60 min對(duì)樣品含量測(cè)定結(jié)果的影響,結(jié)果顯示超聲時(shí)間為30、45、60 min時(shí)測(cè)得樣品漢黃芩苷含量無(wú)明顯差異,且均高于15 min超聲時(shí)間時(shí),說(shuō)明超聲提取時(shí)間為30 min時(shí)提取液已將樣品提取完全。

3.4 不同檢測(cè)波長(zhǎng)的對(duì)比選擇 取漢黃芩苷對(duì)照品,精密稱定,用70%乙醇溶液配制成適宜濃度的對(duì)照品溶液,采用高效液相色譜儀,DAD檢測(cè)器在200～400 nm進(jìn)行光譜掃描。結(jié)果表明,漢黃芩苷在276 nm的波長(zhǎng)處有最大吸收,因此選擇276 nm作為測(cè)定波長(zhǎng),見(jiàn)圖4。

圖4 漢黃芩苷全波長(zhǎng)掃描紫外吸收光譜

3.5 不同流動(dòng)相的對(duì)比選擇 本研究參照相關(guān)文獻(xiàn)[18-20],分別考察了(1)甲醇—水—磷酸(45∶55∶0.2)作為流動(dòng)相;(2)乙腈-0.4%磷酸溶液(27∶73)作為流動(dòng)相;(3)乙腈—水—磷酸(25∶75∶0.2)作為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫。結(jié)果:甲醇—水—磷酸(45∶55∶0.2)作為流動(dòng)相,可得到較好的分離效果,但漢黃芩苷出峰時(shí)間較晚。乙腈-0.4%磷酸溶液(27∶73)作為流動(dòng)相,漢黃芩苷分離度、出峰時(shí)間都較好。乙腈—水—磷酸(25∶75∶0.2)作為流動(dòng)相,漢黃芩苷的分離度低于甲醇—水—磷酸(45∶55∶0.2)、乙腈-0.4%磷酸溶液(27∶73)。因此選用乙腈-0.4%磷酸溶液(27∶73)作為流動(dòng)相。

綜上所述,本研究建立的兒童清肺丸中漢黃芩苷的含量測(cè)定方法,經(jīng)方法學(xué)考察,表明該方法專屬性強(qiáng),精密度高,重復(fù)性好,準(zhǔn)確性高,可用于兒童清肺丸中漢黃芩苷的含量測(cè)定,同時(shí)為兒童清肺丸的質(zhì)量控制提供參考,對(duì)提高兒童清肺丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),提高整體質(zhì)量控制水平,保證藥物療效穩(wěn)定起到積極作用。

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