彭加兵,張鳳,范慢利,樊宗兵,王夢,嚴(yán)安定

半夏屬于天南星科半夏屬植物,能干濕化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié),其生品有毒,臨床上多經(jīng)炮制而廣泛應(yīng)用,《中國藥典》歷版載之[1-3]。潁半夏產(chǎn)于安徽省阜陽地區(qū)潁上縣、阜南縣一帶,為半夏道地品種[4-6]。調(diào)查研究發(fā)現(xiàn),不同產(chǎn)地的半夏藥材品質(zhì)差異較大,而《中華人民共和國藥典(2020版)》只收錄顯微鑒別和薄層鑒別,無含量指標(biāo)的記載,導(dǎo)致含量均一性等不可控,最終影響臨床療效,因此制定相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尤為重要[1,7]。文獻檢索發(fā)現(xiàn),半夏主要含有核苷類、生物堿和揮發(fā)油等,其中核苷類成分具有多種生物活性,如抗病毒、抗腫瘤、抗心律失常等,可作為指標(biāo)成分測定半夏含量[8-12]。目前關(guān)于半夏中核苷類成分的含量測定的報道文獻相對較少且測定的種類也較少,同時鑒于該藥產(chǎn)量低,用量大,野生資源少,栽培資源質(zhì)量得不到保證。因此,本研究建立高效液相色譜(HPLC)法同時測定不同產(chǎn)地半夏中7種核苷類成分含量的方法,為半夏的品質(zhì)控制提供理論基礎(chǔ)。報道如下。

1 儀器與試藥

超聲波清潔機;安捷綸1200高效能液相色譜儀;高速離心機;十萬分之一電子天平。對照品:鳥苷、胸腺嘧啶核苷、肌苷、尿苷、腺嘌呤、腺苷、尿嘧啶(批號分別為:BZP1496、BZP2002、BZP1502、BZP1517、BZP1537、BZP1500、BZP1917),均購自合肥博美生物科技有限公司,均≥98%;甲醇和乙腈為色譜純;其余試劑均為純解析。半夏樣本分別購自安徽省潁上縣、重慶市秀山土家族苗族自治縣、河北省安國市和山東省菏澤市,共4批(編號分別為BX-001、BX-002、BX-003、BX-004),經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)附屬阜陽醫(yī)院主任中藥師鑒定為半夏正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 選用C18色譜柱(賽默飛,5 μm,4.6 mm×250 mm);流動相為乙腈(A)-0.05%磷酸溶液(B),梯度洗脫(0～10 min,0.5%A～1.0%A;10～15 min,1.0%A～1.5%A; 15～30 min,1.5%A～5.5%A; 30～35 min,5.5%A～10.0%A; 35～45 min,10.0%A～15.0%A; 45～50 min,15.0%A～20.0%A);流速為1.0 ml/min;波長250 nm;柱溫30 ℃;其進樣量為10 μl,色譜圖見圖1、圖2。

注:1.尿嘧啶;2.尿苷;3.腺嘌呤;4.肌苷;5.鳥苷;6.胸腺嘧啶核苷;7.腺苷圖1 混合對照品HPLC圖

2.2 混合對照品溶液的制備 精確稱取鳥苷、胸腺嘧啶核苷、肌苷、尿苷、腺嘌呤、腺苷、尿嘧啶對照品,加10%甲醇溶解定容,分別得到濃度為0.225 9、0.264 8、0.161 4、0.208 2、0.188 8、0.111 3、0.205 0 mg/ml的母液。再分別取各對照品母液0.5 ml,分別置于2、5、10、15、20、100 ml棕色量瓶中,加10%甲醇定容,既得工作液。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取過60目篩半夏粉末2 g,加入10%甲醇10 ml,稱量,超聲抽取45 min(功率250 W,頻率35 kHz),冷卻后稱量,加入10%甲醇,補足減損量,搖勻,離心5 min(10 000 r/min),上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾,即得。

2.4 線性關(guān)系考察 按本文色譜條件測定,分別精確吸取各濃度的混合對照品溶液10 μl,記錄色譜峰面積。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,進行線性回歸,以混合對照品質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo),峰區(qū)(Y)為縱坐標(biāo)?；貧w方程和線性區(qū)間見表1。研究表明,在各自的濃度范圍內(nèi),各化合物之間有良好的線性關(guān)系。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.5 精密度實驗 按本文色譜條件連續(xù)6次測定,每次精確吸收混合對照品溶液10 μl進樣,計算得到RSD。經(jīng)測定,峰域內(nèi)鳥苷、胸腺嘧啶核苷、肌苷、尿苷、腺嘌呤、腺苷、尿嘧啶的RSD分別為0.74%、0.81%、1.07%、0.90%、0.67%、0.70%、0.94%,表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性實驗 按本文色譜條件在0、3、6、9、10、12、15、17、19、24 h分別取樣10 μl測定編號為BX-001的供試品溶液,計算RSD。結(jié)果在24 h內(nèi)供試品溶液中,鳥苷、胸腺嘧啶核苷、肌苷、尿苷、腺嘌呤、腺苷、尿嘧啶的峰區(qū)RSD分別為0.93%、0.83%、1.07%、1.25%、1.17%、1.28%、1.23%,具有較好的穩(wěn)定性。

2.7 重復(fù)性實驗 精密稱取編號為BX-001半夏粉末2 g,平行稱定6份,按照本文供試品溶液的制備方法制備供試溶液,在本文色譜條件測定條件下,測定半夏中鳥苷含量6.144 0 mg/g,RSD為1.03%;胸腺嘧啶核苷含量5.565 8mg/g,RSD為0.89%;肌苷含量3.046 3 mg/g,RSD為0.92%;尿苷含量25.082 5 mg/g,RSD為1.09%;腺嘌呤含量8.879 8 mg/g,RSD為1.18%;腺苷含量2.112 2mg/g,RSD為1.24%;尿嘧啶含量9.656 2 mg/g,RSD為1.11%,結(jié)果表明此方法具有良好的重復(fù)性。

2.8 加樣回收率實驗 按照本文供試品溶液的制備方法制備供試溶液,精密稱取6份已知含量編號為BX-001半夏粉末,每份1 g,分別加入7種核苷的對照品,加入量與樣品中待測成分含有量相當(dāng),計算回收率,見表2。

表2 加樣回收試驗結(jié)果 (n=6)

2.9 測定半夏核苷類成分含量 根據(jù)本文色譜條件測定,各取10 μl供試品溶液和混合對照品溶液,在半夏試樣中按線性方程求出目標(biāo)成分的含量,見表3。

表3 半夏樣品指標(biāo)成分含量測定結(jié)果 (mg/g,n=3)

3 討 論

3.1 核苷類成分含量比較 半夏化學(xué)成分含量受產(chǎn)地影響較大,其結(jié)果影響療效[13]。研究發(fā)現(xiàn),7種核苷類成分在不同產(chǎn)地的半夏總含量差異較大,從高到低依次為河北省安國市(70.297 0 mg/g)、安徽省潁上縣(60.486 8 mg/g)、山東省菏澤市(27.995 4 mg/g)、重慶市秀山土家族苗族自治縣(16.014 6 mg/g),其中安徽省潁上縣產(chǎn)地半夏所含尿嘧啶、尿苷和腺嘌呤均高于其他產(chǎn)地半夏,河北省安國市所產(chǎn)半夏中肌苷、鳥苷、胸腺嘧啶核苷和腺苷含量均高于其他產(chǎn)地半夏。結(jié)果表明河北省安國市和安徽省潁上縣產(chǎn)地半夏種植前景較好,但由于取樣數(shù)量相對較少,該數(shù)據(jù)是否具有代表性,有待擴大試驗批次和產(chǎn)地進一步研究。

3.2 提取方法選擇 研究發(fā)現(xiàn),從半夏中提取核苷類成分常用提取溶劑為純水,提取方法為超聲提取法[11,13-14]。本實驗考察了甲醇—水(100%甲醇,75%甲醇,50%甲醇,30%甲醇,10%甲醇,純水)6種不同比例溶劑對提取核苷類成分的影響,結(jié)果顯示以10%甲醇溶液對核苷類成分的提取效果最佳。浸出法對比了回流提取法和超聲提取法,結(jié)果顯示超聲提取法較好。超聲條件考察了功率、頻率、提取時間,最優(yōu)條件確定為功率250 W,頻率35 kHz,提取45 min。

3.3 色譜條件優(yōu)化 研究發(fā)現(xiàn),常采用甲醇—水、乙腈—水、乙腈—0.05%磷酸溶液作為流動相,260 nm為檢測波長,檢測半夏多種核苷類成分的含量[4,13,15]。本實驗將作為流動相的甲醇—水、乙腈—水、乙腈—0.05%磷酸溶液分別進行梯度洗脫,在各核苷類成分的峰型和分離度均較好的情況下,乙腈—0.05%磷酸溶液作為流動相。本實驗在流動相為乙腈—0.05%磷酸溶液條件下采用賽默飛C18色譜柱進行條件優(yōu)化,最終確定本文色譜條件。此外,本文對混合對照品溶液利用二極管陣列檢測器(DAD)進行全波長掃描,各檢測成分在波長250 nm和本文色譜條件下吸收較好、峰形最優(yōu)、基線平穩(wěn),最終確定本文檢測波長。

綜上所述,本研究建立的HPLC法同時測定不同產(chǎn)地半夏中7種核苷類成分含量的方法簡單快捷,所用的色譜條件通用性強,同時該方法具有良好的穩(wěn)定性、重復(fù)性和精密度,既定性又定量,多指標(biāo)含量測定為完善半夏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了科學(xué)依據(jù)。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突