張 一，李小燕，牛麗敏，李 慧,*，沈 鉑，陳文波,*，上官靜雨

（1.中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司，老年營養(yǎng)食品研究北京市工程實驗室，營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點實驗室，北京 102209；2.南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023；3.河北科技大學食品與生物學院，河北 石家莊 050000；4.回瀾威士忌蒸餾科技（成都）有限公司，四川 邛崍 611500）

威士忌是世界上最受消費者喜愛的蒸餾酒之一，以大麥等谷物為原料，經過大麥發(fā)芽、糖化、發(fā)酵、蒸餾、桶陳、復配等工藝制得。經過長期發(fā)展，全球已經形成了5 個重要的威士忌產區(qū)：蘇格蘭、愛爾蘭、美國、加拿大和日本[1-2]。不同產區(qū)的威士忌因原料、工藝、氣候、水質等因素的影響差異較大。根據(jù)原料差異，威士忌可初步分為麥芽威士忌和谷物威士忌[3]，其中，麥芽威士忌的主要產區(qū)在蘇格蘭和日本。在蘇格蘭，威士忌生產廠家超過100 家，包括被譽為“單一麥芽威士忌中的勞斯萊斯”的麥卡倫[4]。日本威士忌最早是模仿學習蘇格蘭威士忌的釀造流程，經過百余年的發(fā)展也逐漸形成自己的風格特點。當前最受歡迎的日本威士忌產自三得利和一甲等廠家[5-6]，其中日本第一家生產單一麥芽威士忌的蒸餾廠—三得利旗下的山崎威士忌的風格與蘇格蘭威士忌比較接近，富含成熟水果芳香，但香氣更加甘醇[7]。

近年來，威士忌的研究主要集中在風味方面。Lee等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，蘇格蘭威士忌所具有的水果味、堅果味、肥皂味與異戊酸乙酯、威士忌內酯、月桂酸乙酯等物質密切相關，并據(jù)此開發(fā)了威士忌感官評價風味輪，為消費者識別判斷威士忌風味特點和行業(yè)監(jiān)管提供了一個有效方法。伍思佳等[9]認為威士忌的香氣可分為原料香[10-11]、發(fā)酵香[12]、蒸餾香和陳釀香[13]，與己醛、壬醛、辛酸乙酯、癸酸乙酯、丁香酚等物質密切相關。Poisson團隊[14-15]以美國產區(qū)的波本威士忌為研究對象，發(fā)現(xiàn)了45 種風味化合物，其中26 種風味化合物氣味活度值（odor activity value，OAV）大于1。

目前關于不同產區(qū)威士忌香氣特點的相對較少，國內威士忌研究起步較晚，對威士忌關鍵香氣成分組成的認識及工藝控制點的把控經驗也相對不足。開展不同威士忌的風味特點研究十分必要。本研究以具有代表性的2 款麥卡倫威士忌和2 款山崎威士忌為研究對象，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜（headspace-solid phase micro extraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）聯(lián)用技術并結合OAV與生產工藝研究其關鍵香氣成分組成，并通過二維層析聚類分析與主成分分析（principal component analysis，PCA）進一步挖掘蘇格蘭威士忌與日本威士忌的香氣特點，以期為國產威士忌高品質發(fā)展提供理論參考和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

研究所用4 款威士忌酒樣品來自蘇格蘭麥卡倫和日本山崎酒廠，酒標年齡分別為12 a和18 a，均由WBA威士忌商學院提供。4 款威士忌酒樣品編號分別為M-1（麥卡倫12 a，乙醇體積分數(shù)40%）、M-2（麥卡倫18 a，乙醇體積分數(shù)43%）、S-1（山崎12 a，乙醇體積分數(shù)43%）、S-2（山崎18 a，乙醇體積分數(shù)43%）。

氯化鈉（分析純）國藥集團藥業(yè)股份有限公司；1,2,3-三氯丙烷（色譜純）北京曼哈格生物科技有限公司；正構烷烴（色譜純）上海安譜實驗科技股份有限公司；純水均從Milliq凈化系統(tǒng)獲得。

1.2 儀器與設備

GC-MS-2020NX GC-MS聯(lián)用儀（配備AOC-6000三位一體自動進樣器、20 mL SPME/頂空樣品瓶及安全瓶蓋）、SPME fiber Carboxen/DVB/PDMS固相微萃取頭（50/30 μm，2 cm）島津企業(yè)管理（中國）有限公司；ME204/04型電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理

參考文獻[16]并進行適當修改：用蒸餾水將所有樣品稀釋調節(jié)乙醇體積分數(shù)至5%。取5 mL待測樣品于頂空瓶中，加入3 g氯化鈉，之后準確加入三氯丙烷（10 mg/L）內標溶液150 μL，迅速擰緊并封好瓶塞，搖勻待測。

1.3.2 GC條件

色譜柱：InertCap UI-Wax（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持3 min，以10 ℃/min速率上升到150 ℃，隨后以4 ℃/min速率上升到230 ℃，保持8 min；載氣：99.999%高純度氦氣；載氣流速：1 mL/min；進樣口溫度：250 ℃。

1.3.3 MS條件

電離方式：電子電離；電子能量：70 eV；發(fā)射電流：200 μA；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；接口溫度：280 ℃；掃描方式：全掃描模式；質量范圍：30～500 Da。

1.3.4 揮發(fā)性化合物定性分析

根據(jù)峰面積大小篩選分析GC-MS風味物質總離子流圖，自動識別信噪比大于200的峰并進行匹配度篩選，得到匹配度大于80%的物質，再結合NIST 14譜庫檢索進行保留指數(shù)（retention index，RI）定性[17]。

RI定性：將樣品與正構烷烴（C7～C40）在相同色譜條件下進樣分析，計算RI值，并與文獻中RI進行對比，將絕對值相差100以內的確定為同一化合物。計算公式如下：

式中：n和n+1分別為目標物流出前后正構烷烴的碳原子數(shù)；t為目標物的保留時間；tn和tn+1為對應正構烷烴的保留時間。

1.3.5 揮發(fā)性化合物定量分析

揮發(fā)性化合物相對含量[18]：根據(jù)定性結果，對GC-MS中信噪比大于200的峰的峰面積求和作為總揮發(fā)性化合物峰面積，采用面積歸一化法計算不同類型揮發(fā)性化合物的相對含量，計算公式如下：

揮發(fā)性化合物質量濃度：采用三氯丙烷作為內標進行半定量[19]，即假定各物質的響應值與內標相同，通過各揮發(fā)性化合物與內標物峰面積的比值與內標質量濃度，計算出各揮發(fā)性化合物質量濃度，計算公式如下：

1.3.6 OAV計算

與風味數(shù)據(jù)庫（https://www.femaflavor.org/flavorlibrary）的揮發(fā)性化合物香氣特征進行比對，篩選風味化合物。根據(jù)威士忌酒樣中揮發(fā)性化合物的質量濃度和各化合物在水溶液中的嗅覺閾值[20]，OAV計算公式如下：

將OAV≥1的化合物視作對樣品香氣品質具有貢獻作用的物質，其值越大代表其貢獻性越大，是樣品中的關鍵風味化合物[21]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結果與分析

2.1 威士忌揮發(fā)性化合物結構特征分析

采用HS-SPME-GC-MS聯(lián)用技術對比分析4 款麥芽威士忌的揮發(fā)性化合物組成，共鑒定出243種揮發(fā)性化合物，包括酯類88 種、醇類40 種、醛類16 種、酸類13 種、酮類11 種和其他化合物74 種。由圖1a可知，揮發(fā)性化合物相對含量最高的是酯類、酸類和醇類化合物，3 類物質在4 款威士忌酒中的相對含量可達到90%以上。對相對含量最高的酯類、酸類和醇類化合物濃度進一步分析表明，酯類化合物在S-1、S-2、M-1、M-2中質量濃度分別為93.40、86.67、61.90 mg/L和92.53 mg/L。酸類化合物在S-1、S-2中質量濃度分別為40.58、40.32 mg/L，在M-1、M-2中質量濃度分別為33.68 mg/L和34.06 mg/L。醇類化合物在S-1、S-2、M-1、M-2中的質量濃度分別為25.27、22.20、24.32、35.04 mg/L（圖1b）。4 款威士忌酒酸類和醇類化合物之間質量濃度差異不顯著，但M-1中酯類化合物質量濃度顯著低于S-1、S-2、M-2中的酯類化合物質量濃度。

圖1 不同威士忌樣本中各類揮發(fā)性化合物相對含量（a）和質量濃度（b）Fig.1 Proportions (a) and concentrations (b) of various volatile compounds in different whisky samples

2.2 威士忌風味化合物的鑒定

為明確4 款威士忌中的香氣化合物，對檢測得到的243 種揮發(fā)性成分進行OAV分析并篩選得到58 種風味化合物，其中酯類25 種、醇類13 種、醛類10 種、酮類5 種、酸類3 種、其他類2 種（表1）。一般來說，OAV越大說明該化合物對酒體的總體香氣貢獻越大，OAV≥1說明該化合物對酒體的總體香氣有直接貢獻。

表1 威士忌風味物質信息、OAV及風味描述特點Table 1 OAV and aroma description characteristics of aroma components in whisky samples

由表1可知，S-1、S-2、M-1、M-2威士忌酒中分別有32、31、35、36 種OAV≥1的風味化合物。4 種威士忌中含有31 種共有OAV≥1的組分，包括酯類17 種、醇類7 種、醛類4 種、酮類1 種、酸類2 種。

酯類物質是4 款威士忌中種類最多、OAV最高的風味化合物，大部分呈現(xiàn)花香、果香的特點，是威士忌酒的重要香氣物質。辛酸乙酯在4 款酒中OAV均較高，OAV在773.67～1374.77之間，能賦予威士忌果味（香蕉味、梨味）和果酒味。癸酸乙酯和月桂酸乙酯OAV范圍分別在264.61～371.74和25.79～56.17之間，能賦予威士忌甜味、果味、肥皂味。兩款日本威士忌中異戊酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯OAV最高，分別是1445.40、1990.11（S-1）和1512.70、1912.74（S-2），這兩種酯類物質賦予了山崎威士忌更強的蘋果味。此外，雖然丁酸乙酯、己酸乙酯、丁酸甲酯在4 款威士忌中都是重要的香氣物質，但在山崎威士忌中的OAV遠高于麥卡倫威士忌，使山崎威士忌表現(xiàn)出更濃郁的菠蘿香氣。乙酸苯乙酯在兩款麥卡倫威士忌中OAV較高，賦予麥卡倫威士忌更強的玫瑰花味、蜂蜜味。酯類化合物的合成與麥芽原料中的不飽和脂肪酸、糖化工藝、發(fā)酵工藝等密切相關，麥芽中的不飽和脂肪酸和麥角甾醇會抑制酵母細胞膜上乙醇乙酰轉移酶的活性，從而抑制脂肪酸乙酯類化合物的合成[24]。通過制麥工藝及發(fā)酵工藝的調整，可控制麥芽中不飽和脂肪酸含量及酵母細胞膜中不飽和脂肪酸和麥芽甾醇的積累[24]，進而顯著影響脂肪酸乙酯類的種類和濃度[25]。此外，低溫發(fā)酵及用發(fā)酵液直接蒸餾也可保留更多的酯類物質[26]。

醇類化合物主要來源于麥汁（谷物糖化液）發(fā)酵過程中氨基酸代謝或糖代謝產物，在酒中可以起到增味助香的作用[27-28]。4 款威士忌中共有的OAV最高的醇類化合物是1-癸醇，范圍在16.61～31.92之間，其次是異戊醇，范圍在6.47～7.21之間，這兩種物質能賦予威士忌柑橘香氣和雜醇味。金合歡醇、反式-橙花叔醇是4 款威士忌中重要的醇類物質，但在麥卡倫威士忌中的OAV遠高于山崎威士忌，使麥卡倫威士忌表現(xiàn)出更強的花香味。兩款山崎威士忌中，1-癸醇和正己醇OAV明顯高于麥卡倫威士忌，賦予山崎威士忌更濃郁的柑橘風味。

酸類化合物是威士忌中的重要揮發(fā)性化合物，以酵母代謝產生的辛酸、癸酸、月桂酸等脂肪酸為主。由于酸類化合物閾值較高，對威士忌有風味貢獻的酸類化合物較少。4 款威士忌中共有兩種OAV＞1的酸類化合物，分別是癸酸和辛酸，OAV范圍分別在9.21～10.92和0.98～1.79之間。酸類化合物具有奶酪發(fā)酵的酸腐味，可協(xié)調威士忌的酒體、風味和口感。

醛酮類化合物主要來源于脂肪氧化和氨基酸降解。4 款威士忌中共有的醛酮類化合物有大馬士酮、反式-2-壬烯醛和壬醛。大馬士酮OAV范圍在243.43～306.38，是威士忌中玫瑰花香味和蜂蜜味的風味來源[14]，其中麥卡倫威士忌中大馬士酮OAV高于山崎威士忌。反式-2-壬烯醛和壬醛的OAV范圍分別在22.30～51.15和18.97～24.18之間，具有黃油味、堅果味的風味特點[29-30]。山崎威士忌中的正己醛OAV高于麥卡倫威士忌，賦予山崎威士忌更強的水果風味。

上述數(shù)據(jù)表明，日本山崎威士忌和蘇格蘭麥卡倫威士忌具有豐富的果香味和花香味，這也是它們在世界范圍內獲得廣泛認可的原因之一。

2.3 威士忌二維層次聚類分析

聚類分析利用合并算法計算各變量間的距離，距離越小，相似度越高，將距離最近的2 個數(shù)據(jù)點或類別進行組合，生成樹狀圖，將結果更加直觀地表現(xiàn)出來[16]。本研究采用WARD方法對威士忌中58 種風味化合物OAV進行層次聚類分析。

從圖2可看出，58 種風味化合物被分為6 組，以不同顏色加以區(qū)分，其中顏色越紅說明該風味化合物在威士忌中具有更強的典型性[16]。多數(shù)酯類化合物OAV在山崎威士忌中較高，如2-甲基丁酸乙酯、丁酸乙酯、異戊酸乙酯等，主要呈水果香味和甜香味等特點，乙酸苯乙酯、辛酸異戊酯、棕櫚酸甲酯等物質OAV在麥卡倫威士忌中較高，主要呈花香味、菠蘿味等風味特點。山崎威士忌中有代表性的醇類化合物是正己醇、正辛醇、2-庚醇、2-壬醇等物質，主要呈青草味、柑橘味，麥卡倫威士忌中有代表性的醇類化合物是金合歡醇、反式-橙花叔醇等物質，主要呈花香味、柑橘味。大馬士酮是麥卡倫威士忌中的典型酮類風味化合物，能賦予其蜂蜜味和玫瑰花味，與上述風味化合物分析鑒定結果（表1）一致。通過對比風味化合物的相似程度，可非常直觀地將麥卡倫威士忌與山崎威士忌有效區(qū)分為兩組，明確了山崎威士忌與麥卡倫威士忌中的風味物質差異及其特點。

圖2 4 款威士忌中風味物質雙向層次聚類圖Fig.2 Two-dimensional hierarchical clustering dendrogram of aroma substances in fouy whisky samples

2.4 PCA對不同威士忌的鑒別

對4 種威士忌中具有OAV的風味物質進行PCA，分析結果見表2。4 款威士忌中風味物質PCA得分圖及載荷圖見圖3。

表2 4 款威士忌中風味物質PC的方差貢獻率Table 2 Variance contribution rates of first three principal components for aroma components in four whisky samples

圖3 4 款威士忌酒中風味化合物PCA得分圖（a）和載荷圖（b）Fig.3 PCA score (a) and loading plots (b) of aroma compounds in four whisky samples

PCA是一種通過降維將多個變量變?yōu)樯贁?shù)綜合變量，用簡化的數(shù)據(jù)反應原始變量的大部分信息的統(tǒng)計方法[31]。當累計貢獻率超過80%時，通常認為兩種PC基本包含樣品的信息。在4 種威士忌58 種風味化合物中，共提取出3 個特征值大于1的PC，其中前兩個PC的方差貢獻率分別為65.1%和21.2%，累計方差貢獻率已經達到86.3%，綜合了4 款威士忌中風味物質的大部分信息。

由圖3a可看出，4 款威士忌分別位于圖的不同區(qū)域，表明4 款威士忌各具獨特的風味特點。PC1方差貢獻率最高，其中山崎威士忌位于PC1正半軸，麥卡倫威士忌位于PC1負半軸，兩款威士忌明顯區(qū)分，說明不同酒廠生產的威士忌存在較大的差異性。載荷圖如圖3b所示，乙酸乙酯、苯甲酸乙酯等11 種酯類、5 種醇類物質及7 種其他物質在PC1正半軸的載荷矩陣大于0.9，與山崎威士忌呈正相關。反式-橙花叔醇、金合歡醇、月桂醇及乙酸苯乙酯4 種風味物質在PC1負半軸的載荷矩陣大于0.9，與麥卡倫威士忌呈正相關。載荷圖表明山崎威士忌具有更加豐富的風味物質組成，麥卡倫威士忌的香氣特點則更加單一純凈。影響單一麥芽威士忌風味的因素較多，如麥芽類型、蒸餾方式等[9]。據(jù)官方披露的資料顯示，山崎蒸餾廠使用大量木桶進行開放式發(fā)酵，保證酵母等微生物能夠產生更豐富的風味物質[32]。山崎配備了多種不同類型的蒸餾器和橡木桶，為山崎威士忌獨特的風味特點奠定了基礎。麥卡倫蒸餾廠則使用小巧精細的蒸餾設備，只摘取少量酒液作為酒心，并且?guī)缀跛性贫荚谘├蛲爸惺斐桑瑥亩炀土他溈▊愅考杉儍舻南銡馓攸c。PC2方差貢獻率占21.2%，僅壬醛、月桂酸乙酯、丙位癸內酯、異戊醛4 種風味化合物在PC2中載荷矩陣大于0.9，說明桶齡可能是威士忌風味品質的次要影響因素。Kew等[33]認為陳釀時間雖然會改變威士忌中的化學組成，但不同橡木桶的活性對威士忌的影響同樣至關重要。因此，生產威士忌時也應充分考慮橡木桶帶來的影響。

4 款威士忌樣品中，S-1位于得分圖的第1象限，與2-戊酮、1-癸醇等物質比較接近，賦予S-1甜味、果酒味、柑橘味等風味特點。S-2威士忌位于第4象限，與2-甲基-3-戊酮、反式-2-壬烯醛等物質比較接近，賦予S-2黃油味、薄荷味等風味特點。M-1位于第3象限，與正辛醛、十三醛等物質接近，賦予M-1更濃郁的柑橘味。M-2位于第2象限，與大馬士酮、乙酸苯乙酯等物質接近，賦予M-2更濃郁的花香味。

3 結論

本實驗采用頂空固相微萃取提取4 款威士忌中的揮發(fā)性成分，通過GC-MS共篩選出243 種揮發(fā)性化合物，結合OAV進一步分析，篩選出58 種風味化合物及其風味特點。山崎威士忌含有OAV更高的異戊酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、1-癸醇等物質，表現(xiàn)出更明顯的果香味。麥卡倫威士忌含有OAV更高的乙酸苯乙酯、金合歡醇、反式-橙花叔醇等物質，呈現(xiàn)更明顯的花香味。二維層次聚類分析有效區(qū)分了麥卡倫威士忌與山崎威士忌，明確了山崎威士忌與麥卡倫威士忌中的風味物質差異及其風味特點。PCA結果表明4 款威士忌各具特點，不同酒廠生產的威士忌風味組分之間存在較大的差異性，這是威士忌生產過程中眾多因素影響的結果。威士忌的風味比較復雜，呈現(xiàn)果香、花香、油香等特點，但風味物質的來源及組成尚不完全清晰，后續(xù)工作可結合風味物質的生成機理，優(yōu)化生產工藝，進一步提升國產威士忌的品質。