郭陽,于波

特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis,AD)是一種慢性、復(fù)發(fā)性、需長期治療的炎癥性皮膚病,以劇烈瘙癢為主要特征,通常患者會合并過敏性鼻炎、哮喘等其他特應(yīng)性疾病,患者心理及經(jīng)濟(jì)雙重負(fù)擔(dān)加重［1-2］。AD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前認(rèn)為與免疫應(yīng)答異常、皮膚屏障受損、遺傳易感性等相關(guān)［1-4］,近年來隨著對皮膚微生態(tài)研究不斷深入,研究發(fā)現(xiàn)皮膚微生態(tài)在AD發(fā)病中起到一定作用［5］,其中金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,SA)作為重要病原在AD的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用［6］。

生物膜是細(xì)菌附著于生物或非生物表面時(shí),與其自身分泌的細(xì)胞外基質(zhì)成分共同形成的細(xì)胞群體,它有利于細(xì)菌持續(xù)定植、逃脫宿主免疫攻擊、抵抗藥物治療,并向其他部位播散［7］。既往基于人群的研究顯示,AD患者皮膚表面所定植的SA形成了生物膜［8-9］,且患者皮膚表面SA形成生物膜能力與AD嚴(yán)重程度及皮膚屏障功能顯著相關(guān)［8］。此外,SA生物膜擴(kuò)散及其慢性定植可能是AD病情復(fù)發(fā)的重要誘因［10］。目前SA生物膜導(dǎo)致AD發(fā)病的機(jī)制研究較少,僅有少數(shù)研究聚焦SA生物膜形成的相關(guān)蛋白組分,如SpA蛋白可刺激人角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α,并可通過結(jié)合TNF受體Ⅰ,激活A(yù)P-1和NF-κB信號通路,產(chǎn)生多種促炎因子［11］。但SA生物膜與AD發(fā)病關(guān)系的機(jī)制尚未完全闡明,因此有必要對SA生物膜導(dǎo)致AD發(fā)病的關(guān)鍵基因、通路進(jìn)行探索,并找尋潛在治療靶點(diǎn)及藥物。本研究通過對人類永生化表皮(HaCaT)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,篩選SA生物膜對HaCaT細(xì)胞基因表達(dá)影響的差異表達(dá)基因,探索關(guān)鍵基因及通路,進(jìn)一步對AD患者的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行二次探索性分析,并篩選潛在治療藥物。

1 材料與方法

1.1數(shù)據(jù)獲取 在國家生物技術(shù)信息中心的Gene Expression Omnibus(GEO)平臺(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)獲取基因芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)。本研究擬在HaCaT細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,比較SA生物膜實(shí)驗(yàn)組與對照組的差異表達(dá)基因,找尋潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)基因,在該平臺檢索到符合條件的數(shù)據(jù)集為 GSE32920數(shù)據(jù)集。實(shí)驗(yàn)組中HaCaT細(xì)胞被SA生物膜處理,對照組為空白對照組,每組3個(gè)復(fù)孔。將基于此數(shù)據(jù)集所找到的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因,在人體皮膚組織樣本中進(jìn)行二次探索性分析,所需人體數(shù)據(jù)集的入選標(biāo)準(zhǔn)為同時(shí)包含AD患者、健康對照的皮膚組織樣本、且不同數(shù)據(jù)集之間樣本信息一致度好,最終所采用的兩個(gè)數(shù)據(jù)集為GSE16161和GSE32924。

1.2差異表達(dá)基因的篩選 使用R語言的limma包,采用貝葉斯法進(jìn)行差異基因的篩選,選擇標(biāo)準(zhǔn)如下:以差異倍數(shù)(fold change,FC)表示實(shí)驗(yàn)組與對照組基因表達(dá)的差異倍數(shù),若|log2FC| >1.0 且校正后P<0.05,即差異表達(dá)顯著上調(diào)2倍或顯著下調(diào)2倍認(rèn)為是差異表達(dá)基因。

1.3GO功能富集分析及KEGG通路富集分析 根據(jù)上述所篩選出的差異表達(dá)基因,進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,其中GO分析包括生物過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)、細(xì)胞定位(cellular component,CC)三個(gè)層面,所采用工具為DAVID平臺,以錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,FDR)校正后P<0.05為閾值篩選后進(jìn)行可視化展示。

1.4蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及hub基因篩選 使用在線分析工具STRING對差異表達(dá)基因進(jìn)行分析,預(yù)測差異基因?qū)?yīng)蛋白之間的互作關(guān)系,獲得蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖(protein-protein interaction,PPI),并將分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件,使用CytoHubba插件計(jì)算Degree值選擇Top20的hub基因,另使用MCODE插件對差異基因進(jìn)行聚類分析。

1.5關(guān)鍵靶點(diǎn)基因篩選及二次探索性分析 在兩個(gè)二次探索性分析數(shù)據(jù)集中,按照相同標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選,將此三個(gè)數(shù)據(jù)集所選出的差異表達(dá)基因取交集,以韋恩圖展示。在此基礎(chǔ)上,再與上述hub基因取交集,所得即為關(guān)鍵靶點(diǎn)基因,并以箱線圖展示其在二次探索性分析數(shù)據(jù)集中的表達(dá)情況。此外,在兩個(gè)二次探索性分析數(shù)據(jù)集中,按照相同方法進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,并進(jìn)行比較討論。本研究流程圖如圖1所示。

圖1 研究流程圖

1.6治療藥物預(yù)測 使用Connectivity Map(CMap)平臺進(jìn)行治療藥物的預(yù)測,該平臺可基于差異表達(dá)基因,與參考數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,計(jì)算出Score值,該值的取值范圍為-100～100,其絕對值越大,表示與參考數(shù)據(jù)庫相似程度越高。本研究以Score值<-95為標(biāo)準(zhǔn),篩選可用于治療SA生物膜皮膚感染的潛在藥物。

2 結(jié)果

2.1差異表達(dá)基因的篩選結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與對照組細(xì)胞相比,依照差異表達(dá)基因的篩選標(biāo)準(zhǔn),共找到754個(gè)顯著差異表達(dá)基因,對其分布繪制火山圖(圖2a),其中包括上調(diào)差異基因404個(gè),下調(diào)差異基因350個(gè),其中top60差異表達(dá)基因熱圖見圖2b。

Volcano plots of differentially expressed genes; Heatmaps of differentially expressed genes (top 30)

2.2GO功能富集分析結(jié)果 上調(diào)的差異表達(dá)基因功能富集分析結(jié)果顯示,主要富集于炎癥反應(yīng)、ERK1和ERK2級聯(lián)的正向調(diào)控RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體、轉(zhuǎn)錄因子AP-1復(fù)合體等(圖3a),下調(diào)的差異表達(dá)基因功能富集分析結(jié)果顯示,主要富集于蛋白結(jié)合等(圖3b)。

Bar chart of GO enrichment analysis for up-regulated genes; Bar chart of GO enrichment analysis for down-regulated genes

2.3KEGG通路富集分析結(jié)果 上調(diào)差異表達(dá)基因參與的主要信號通路富集于IL-17信號通路、TNF信號通路、MAPK信號通路、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等炎癥通路(圖4a),下調(diào)差異表達(dá)基因參與的主要信號通路富集于HIV-1感染、人巨細(xì)胞病毒感染等(圖4b)。

Bubble diagram of KEGG enrichment analysis for up-regulated genes; Bubble diagram of KEGG enrichment analysis for down-regulated genes

2.4蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及hub基因篩選情況 使用STRING對差異表達(dá)基因進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,PPI網(wǎng)絡(luò)圖所示,可見差異表達(dá)基因之間存在廣泛的蛋白互作關(guān)系(圖5a)。進(jìn)一步使用Cytoscape軟件CytoHubba插件找尋hub基因,計(jì)算PPI網(wǎng)絡(luò)中的各個(gè)節(jié)點(diǎn)Degree值,依照Degree值排序,獲取top20的hub基因,top20 hub基因及其相互作用網(wǎng)絡(luò)見圖5b。此外,使用Cytoscape軟件MCODE插件對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行差異基因的聚類分析,聚類結(jié)果見圖5c,可見差異基因聚集為兩類。

Protein interaction network diagram for differentially expressed genes; Protein interaction network diagram for hub genes (top 20); Cluster diagram for differentially expressed genes

2.5關(guān)鍵靶點(diǎn)基因篩選及二次探索性分析 按照相同流程對兩個(gè)基于人體皮膚組織檢測的二次探索性分析數(shù)據(jù)(GSE16161和GSE32924)進(jìn)行分析,找尋差異表達(dá)基因。兩個(gè)數(shù)據(jù)集中樣本均為皮膚組織活檢樣本,均為白種人,納入分析的均為慢性AD急性加重、且4周內(nèi)未進(jìn)行治療的患者以及健康志愿者。數(shù)據(jù)集GSE16161和GSE32924納入分析的分別包括9名AD患者+9名健康對照、13名AD患者+9名健康對照。分析發(fā)現(xiàn),GSE16161數(shù)據(jù)集中共找到2 993個(gè)顯著差異表達(dá)基因,含1 418個(gè)上調(diào)基因、1 575個(gè)下調(diào)基因,差異基因火山圖、top60差異表達(dá)基因熱圖分別見圖6a～6b。GSE32924數(shù)據(jù)集中共找到1 042個(gè)顯著差異表達(dá)基因,含516個(gè)上調(diào)基因、526個(gè)下調(diào)基因,差異基因火山圖、top60差異表達(dá)基因熱圖分別見圖6c～6d。對三個(gè)數(shù)據(jù)集的差異表達(dá)基因取交集,上調(diào)及下調(diào)差異表達(dá)基因的韋恩圖分別見圖7a～7b。在此基礎(chǔ)上,再與上述top 20的hub基因取交集,所得即為關(guān)鍵靶點(diǎn)基因,據(jù)此最終確定了3個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)基因,為:MMP-1、CXCL1以及EGR1,均為顯著上調(diào)的差異表達(dá)基因。上述3個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)基因在二次探索性分析數(shù)據(jù)集中的表達(dá)情況見圖8,可見在AD患者人體皮膚組織中均顯著上調(diào)。

Volcano plots of differentially expressed genes in dataset GSE16161; Heatmaps of differentially expressed genes (top 30) in dataset GSE16161; Volcano plots of differentially expressed genes in dataset GSE32924; Heatmaps of differentially expressed genes (top 30) in dataset GSE32924

Note: AD_1 indicated dataset GSE16161, AD_2: dataset GSE32924, SA_biofilm indicated dataset GSE32920, AD indicated atopic dermatitis, SA indicated Staphylococas aureus.

Note:**P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001, AD indicated atopic dermatitis, NC indicated normal control group.

2.6富集分析二次探索性分析情況 對兩個(gè)基于人體皮膚組織檢測的二次探索性分析數(shù)據(jù)集(GSE16161和GSE32924)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO功能富集分析顯示,差異表達(dá)基因主要富集于有絲分裂姐妹染色單體分離、DNA復(fù)制等(圖9)。KEGG通路富集分析(圖10)顯示,細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中差異表達(dá)基因所富集的炎癥信號通路中,IL-17信號通路和TNF信號通路在兩個(gè)二次探索性分析數(shù)據(jù)集中同樣顯著上調(diào)。

GO enrichment analysis in dataset GSE16161; GO enrichment analysis in dataset GSE32924

KEGG enrichment analysis in dataset GSE16161; KEGG enrichment analysis in dataset GSE32924

2.7治療藥物預(yù)測結(jié)果 將細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中|log2FC|前100位顯著上調(diào)、顯著下調(diào)的共計(jì)200個(gè)差異表達(dá)基因上傳至CMap平臺,進(jìn)行預(yù)測計(jì)算,根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)Score值<-95,共獲得14種小分子化合物(表1),此14種小分子化合物可能成為SA生物膜皮膚感染致AD的潛在預(yù)防或輔助性治療藥物。

表1 藥物預(yù)測結(jié)果

3 討論

SA作為導(dǎo)致AD患者皮膚微生態(tài)紊亂的關(guān)鍵因子,可通過多種機(jī)制參與AD病理生理過程［6］:SA的α毒素和蛋白酶能夠溶解角質(zhì)層并在角質(zhì)形成細(xì)胞穿孔,破壞皮膚屏障;SA產(chǎn)生的腸毒素A(staphylococcal enterotoxin A,SEA)、腸毒素B(staphylococcal enterotoxin B,SEB)和毒性休克綜合征毒素-1(toxic shock syndrome toxin-1,TSST-1)等可以作為超抗原直接激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子;SA脂蛋白可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞合成胸腺基質(zhì)淋巴生成素(thymic stromal lymphopoietin,TSLP)進(jìn)而誘發(fā)Th2炎癥反應(yīng);SA可形成生物膜附著于皮膚表面,促進(jìn)其持續(xù)定植、逃脫人體免疫攻擊［12］。目前關(guān)于SA生物膜與AD發(fā)病的探討,多為人群層面的SA成膜能力與AD疾病及其嚴(yán)重程度、屏障功能等指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性分析［8-9］,揭示了AD患者皮膚定植SA形成生物膜以及二者存在一定關(guān)聯(lián)的現(xiàn)象,而相關(guān)分子機(jī)制尚未完全闡明。本研究基于GEO數(shù)據(jù)庫的GSE32920數(shù)據(jù)集,采用生物信息學(xué)方法分析及篩選SA生物膜對HaCaT細(xì)胞基因表達(dá)影響的差異表達(dá)基因共754個(gè),其中顯著上調(diào)404個(gè)、顯著下調(diào)350個(gè)。進(jìn)一步進(jìn)行GO功能富集分析、KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn),差異表達(dá)基因主要參與炎癥反應(yīng)等過程,所參與的信號通路主要富集于IL-17信號通路、TNF信號通路等炎癥通路。此外,通過進(jìn)一步的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、hub基因篩選以及在兩個(gè)人體數(shù)據(jù)集的二次探索性分析,最終確定了3個(gè)潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)基因,為:MMP1、CXCL1以及EGR1,上述炎癥通路在二次探索性分析中同樣顯著上調(diào)。

本研究發(fā)現(xiàn)SA生物膜對HaCaT細(xì)胞的基因表達(dá)影響涉及共計(jì)754個(gè)差異表達(dá)基因,這些差異基因主要在炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用,其中主要富集的通路有:IL-17信號通路、TNF信號通路等。在兩個(gè)AD患者的數(shù)據(jù)集中開展的二次探索性分析,結(jié)果顯示上述炎癥通路在二次探索性分析數(shù)據(jù)集中同樣顯著上調(diào)。IL-17是一種促炎細(xì)胞因子,由Th17細(xì)胞所產(chǎn)生,既往研究發(fā)現(xiàn)AD患者外周血中Th17細(xì)胞、IL-17水平顯著升高［13］,特應(yīng)性皮炎評分(scoring atopic dermatitis,SCORAD)分值與IL-17水平呈顯著正相關(guān)［14］。TNF是一種促炎細(xì)胞因子,體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TNF-α可誘導(dǎo)產(chǎn)生AD樣表現(xiàn)［15］。上述炎癥通路多在AD的慢性皮損病變中發(fā)揮重要作用［1］,結(jié)合本研究的分析結(jié)果,SA生物膜可能通過上調(diào)炎癥相關(guān)通路參與AD的慢性病變過程。

本研究通過多步驟分析、篩選,最終找到了SA生物膜參與AD發(fā)病過程的3個(gè)潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)基因:MMP1、CXCL1以及EGR1。MMP1是基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)一員,MMPs可通過調(diào)節(jié)組織物理屏障、調(diào)節(jié)炎癥因子及在炎癥組織調(diào)節(jié)趨化因子水平等方式參與炎癥過程［16］。既往AD相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),MMP1在AD患者皮膚組織中高表達(dá)［17］,在AD患者血清中水平亦顯著升高［18］。CXCL1屬于CXC趨化因子家族,由中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等分泌,可對中性粒細(xì)胞起到趨化作用,在人體炎癥反應(yīng)中具有重要作用。體外研究發(fā)現(xiàn),Th17細(xì)胞可上調(diào)CXCL1水平［19］,其中IL-17A和IL-17F可誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞釋放CXCL1參與炎癥反應(yīng)［20］。AD相關(guān)臨床研究發(fā)現(xiàn),在度普利尤單抗治療后CXCL1水平顯著降低［21］。EGR1是早期生長反應(yīng)蛋白(EGR)家族的一員,是一種炎癥相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子,在皮膚炎癥反應(yīng)中同樣發(fā)揮重要作用,體外實(shí)驗(yàn)提示EGR1參與IL-33通過MAPK途徑對TSLP表達(dá)的調(diào)節(jié),從而參與AD的炎癥反應(yīng)過程［22］。此外,破壞EGR1的DNA結(jié)合可改善2,4-二硝基氯苯所誘導(dǎo)的皮膚炎癥［23］。

基于CMap平臺的計(jì)算發(fā)現(xiàn)14種小分子化合物可能成為SA生物膜皮膚感染致AD的潛在預(yù)防或輔助性治療藥物。其中,吳茱萸堿(evodiamine)是一種吲哚喹啉生物堿［24］,具有抗菌、抗炎活性。針對SA感染,evodiamine可通過下調(diào)NF-κB、MAPKs通路減弱巨細(xì)胞病毒再激活后SA誘發(fā)的重癥肺炎［25］;大鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)evodiamine可通過下調(diào)HMGB1/NF-κB/TLR-4通路,減少肺組織中的氣道炎癥和重構(gòu)［26］。PKC(蛋白激酶C)是一組磷脂依賴性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的蛋白激酶C激活可上調(diào)TSLP的基因表達(dá)［27］,因此蛋白激酶C抑制劑在皮膚抗炎治療中可能發(fā)揮一定作用。對于PKC抑制劑用于皮膚病及炎癥性感染性疾病領(lǐng)域,現(xiàn)有研究多關(guān)注chelerythrine(白屈菜紅堿,一種PKC抑制劑),研究發(fā)現(xiàn)chelerythrine可抑制小鼠耳部炎癥、抑制PGE2產(chǎn)生、降低COX2活性［28］,在急性肺損傷小鼠中可抑制TNF-α、IL-6、IL-1β的產(chǎn)生和氧化應(yīng)激［29］。PARP(聚ADP核糖聚合酶)是一種位于真核細(xì)胞中參與DNA修復(fù)的核酶,可增強(qiáng)咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病小鼠模型的炎癥嚴(yán)重程度［30］。既往研究顯示,PARP抑制劑對于創(chuàng)傷性腦損傷具有炎癥抑制作用,可減輕創(chuàng)傷性腦損傷小鼠的腦挫傷及水腫程度,抑制NF-κB激活所致鈣蛋白酶過度激活和炎癥因子的產(chǎn)生［31］。

本研究存在局限性。本研究基于生物信息學(xué)方法,在細(xì)胞層面所找到的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因僅在兩個(gè)基于人體皮膚組織檢測的外部數(shù)據(jù)集進(jìn)行二次探索性分析,尚未在AD患者SA感染炎癥皮損中進(jìn)行驗(yàn)證,因此本研究結(jié)果有待在后續(xù)機(jī)制探討研究中得以證實(shí)。

綜上所述,本研究通過生物信息學(xué)分析方法篩選SA生物膜對HaCaT細(xì)胞基因表達(dá)影響的差異表達(dá)基因、探索關(guān)鍵基因及通路,并在患者的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行二次探索性分析,找到3個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)基因:MMP1、CXCL1以及EGR1,為SA生物膜致AD發(fā)病的潛在關(guān)鍵基因,并預(yù)測出14種小分子化合物可能成為潛在藥物,這為后續(xù)探索SA生物膜致AD的發(fā)病機(jī)制及以此為切入點(diǎn)進(jìn)行藥物研發(fā)提供了線索。