王迪, 何祥, 楊劍

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 麻醉科, 貴州 貴陽(yáng) 550004; 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 麻醉學(xué)院, 貴州 貴陽(yáng) 550004; 3.貴州省人民醫(yī)院 麻醉科, 貴州 貴陽(yáng) 550004 )

異丙酚因其具有誘導(dǎo)快速穩(wěn)定、蘇醒迅速及術(shù)后惡心嘔吐發(fā)生率低等特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于嬰幼兒的全身麻醉手術(shù)[1-2]。然而,有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,異丙酚誘導(dǎo)可致新生大鼠神經(jīng)元細(xì)胞焦亡,與異丙酚激活NOD樣受體家族Pyrin域蛋白-3(NOD-like receptor family,pyrin domain containing 3,NLRP3)炎性小體途徑有關(guān)[3-5]。NLRP3炎性小體是一種細(xì)胞內(nèi)蛋白復(fù)合物,在許多病理學(xué)中已成為炎癥的關(guān)鍵介質(zhì),微生物和危險(xiǎn)信號(hào)激活NLRP3后,導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和IL-18的釋放,以及Gasdermin-D蛋白(gasdermin-D protein,GSDMD)介導(dǎo)的焦亡[6]。GSDMD介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡是一種促炎類型的程序性細(xì)胞死亡,其特征是NLRP3炎性小體激活,同時(shí)下游天冬氨酸特異性半胱天蛋白酶-1(aspartate-Specific caspase 1,Caspase-1)被激活,影響細(xì)胞膜的通透性,釋放IL-1β和IL-18等炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生炎癥反應(yīng),進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞焦亡[7-10],而神經(jīng)元炎癥反應(yīng)和細(xì)胞焦亡會(huì)引起認(rèn)知功能障礙[11]。因此,接受異丙酚麻醉后,可能會(huì)對(duì)新生兒神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生損害。探索降低異丙酚麻醉后對(duì)新生大鼠神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生焦亡的具體機(jī)制,可深入了解降低異丙酚引起的不良反應(yīng)提供一定的理論依據(jù)。右美托咪定是一種高選擇性α2受體激動(dòng)劑,具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抑制炎癥反應(yīng)的作用,臨床上常用于鎮(zhèn)靜、麻醉等[12]。不過(guò),目前右美托咪定對(duì)大腦神經(jīng)元細(xì)胞焦亡的改善機(jī)制還沒(méi)有完全清楚。研究發(fā)現(xiàn),通過(guò)激活蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)的活性,右美托咪定可以改善神經(jīng)元的炎癥反應(yīng)[13],還可以抑制NLRP3炎性小體途徑的炎癥反應(yīng),改善神經(jīng)元細(xì)胞焦亡[14-15]。A激酶錨定蛋白150(a-kinase anchoring protein 150,AKAP150)作為A激酶錨定蛋白家族成員,在PKA水平上調(diào)控其活性,通過(guò)將PKA錨定于適當(dāng)?shù)牡孜?提高磷酸化效率和信號(hào)傳導(dǎo)的準(zhǔn)確性,在信號(hào)傳遞中起著重要的作用[16-18]。因此,本研究在前期研究的基礎(chǔ)上[19],對(duì)發(fā)育期SD大鼠進(jìn)行異丙酚和AKAP150腺病毒處理,構(gòu)建發(fā)育期大鼠細(xì)胞焦亡及AKAP150敲除模型,并通過(guò)右美托咪定預(yù)處理,探討AKAP150在右美托咪定改善異丙酚誘導(dǎo)的發(fā)育期大鼠海馬組織細(xì)胞焦亡中的作用,為促進(jìn)右美托咪定在減輕神經(jīng)元細(xì)胞焦亡領(lǐng)域中的應(yīng)用提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 7 d齡健康新生SD大鼠40只,體質(zhì)量14～18 g,雌雄不限,購(gòu)自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2019-0010],所有大鼠均分籠飼養(yǎng)于恒溫標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房,12 h光照,環(huán)境安靜,溫度20～24 ℃,濕度50%～65%,標(biāo)準(zhǔn)飼料,自由飲食、飲水,定期更換墊料,保持動(dòng)物房干凈整潔。本研究已獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2001633)。

1.1.2主要儀器和試劑 超微量紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(杭州米歐儀器有限公司),PCR儀(杭州米歐儀器有限公司),臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湖南可成儀器設(shè)備有限公司),電泳儀電源(北京龍方科技有限公司),垂直電泳槽(北京六一儀器廠),eBlotTML1 快速濕轉(zhuǎn)儀(金斯瑞生物科技股份有限公司),Multiskan FC型酶標(biāo)儀(Thermo scientific),透射電子顯微鏡(HITACHI,HT7700);AKAP150腺病毒由復(fù)百澳(蘇州)生物醫(yī)藥科技有限公司設(shè)計(jì)并合成,丙泊酚中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液(北京費(fèi)森尤斯卡比醫(yī)藥有限公司),鹽酸右美托咪定注射液(揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司),胞漿胞核蛋白提取試劑盒(南京凱基生物),所有抗體和引物設(shè)計(jì)合成均購(gòu)自武漢華研生物科技有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1動(dòng)物分組及模型建立 40只健康SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法均分對(duì)照(control,Con)組、異丙酚(propofol,Pro)組、右美托咪定預(yù)先給藥(dexmedetomidine was preadministered,DP)組及AKAP150腺病毒+DP(A-kinase anchoring protein 150 adenovirus+DP,ADP)組。Con組大鼠腹腔注射與藥物處理組等容量的生理鹽水;Pro組大鼠首次腹腔注射異丙酚50 mg/kg,待大鼠翻正反射恢復(fù)后,即刻追加異丙酚50 mg/kg;DP組大鼠腹腔注射右美托咪定25 μg/kg,20 min后按Pro組給藥方案對(duì)大鼠進(jìn)行異丙酚麻醉;ADP組大鼠予AKAP150腺病毒腹腔注射,注射結(jié)束后1 h按DP組方案對(duì)大鼠進(jìn)行藥物處理。

1.2.2標(biāo)本采集 “1.2.1”項(xiàng)下Con組大鼠于注射結(jié)束后2 h、其余組大鼠麻醉蘇醒后2 h,采用頸椎脫臼法處死,取海馬組織,于-80 ℃低溫保存供后續(xù)研究檢測(cè)。

1.2.3透射電鏡下觀察海馬組織超微結(jié)構(gòu)變化 取各組大鼠海馬組織,2.5%戊二醛固定液固定,餓酸固定,磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)沖洗3次,梯度乙醇脫水,丙酮滲透,包埋,制成60～80 nm超薄切片,鈾鉛雙染色各8 min,放入銅網(wǎng)盒內(nèi)室溫干燥過(guò)夜,將切片置于透射電子顯微鏡下觀察,采集圖像分析。

1.2.4蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)檢測(cè)海馬組織AKAP150、磷酸化PKA(phosphorylation-PKA,p-PKA)、NLRP3、GSDMD 、IL-1β及IL-18蛋白的表達(dá) 取“1.2.2”項(xiàng)下各組大鼠海馬組織,加細(xì)胞裂解液充分裂解,4 ℃下12 000 r/min離心5 min,取上清液分裝于0.5 mL離心管,置于-20 ℃保存;聚氰基丙烯酸正丁酯(bicin choninic acid,BCA)試劑盒測(cè)定蛋白濃度,加樣緩沖液,加熱,冷卻后上樣,依次經(jīng)過(guò)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、漂洗,加一抗(GAPDH 1∶2 000、AKAP5 1∶1 000、NLRP3 1∶1 000、GSDMD 1∶1 000、IL-1β 1∶1 000、IL-18 1∶1 000及p-PKA 1∶1 000)過(guò)夜;洗滌緩沖液(tris-buffered saline and tween,TBST)洗滌5次,加相應(yīng)的加辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記二抗(1∶10 000),室溫?fù)u床孵育2 h;TBST洗滌5次,增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(enhanced chemiluminescence,ECL)發(fā)光試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光、顯影、定影及沖洗膠片,用ipp分析膠片灰度值,以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光PCR(quantitative reverse transcription PCR,RT-qPCR)檢測(cè)海馬組織AKAP150、PKA、NLRP3、GSDMD、IL-1β及IL-18 mRNA表達(dá) 取“1.2.2”項(xiàng)下各組大鼠海馬組織100 mg提取總RNA,測(cè)定總濃度,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成反轉(zhuǎn)錄DNA(complementary DNA,cDNA)。以cDNA產(chǎn)物作為模版,配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為正向引物0.4 μL、反向引物0.4 μL、cDNA 10 μL及滅菌水4.8 μL;反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性(95 ℃ 10 min)1次循環(huán),變性(95 ℃ 15 s)40次循環(huán),退火延伸(60 ℃ 60 s)40次循環(huán),溶解曲線采集(60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s)1次循環(huán),用2-ΔΔCt分析相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄情況。引物序列見(jiàn)表1。

表1 熒光定量PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for fluorescent quantitative polymerase chain reaction

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)特征

Con組大鼠海馬組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常;Pro組、ADP組大鼠海馬組織損傷程度較高,主要表現(xiàn)為細(xì)胞膜破損嚴(yán)重,形成孔道;DP組大鼠海馬組織損傷程度較輕,細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)基本完整。見(jiàn)圖1。

注：箭頭表示細(xì)胞膜。

2.2 海馬組織中AKAP150、p-PKA、NLRP3、GSDMD、IL-1β及IL-18 蛋白的表達(dá)

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示(圖2),與Con相比,Pro組、DP組及ADP組大鼠海馬組織AKAP150、p-PKA蛋白表達(dá)均下調(diào)(P<0.05),NLRP3、GSDMD、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)均上調(diào)(P<0.05);與Pro組相較,DP組大鼠海馬組織AKAP150、p-PKA蛋白表達(dá)均上調(diào),NLRP3、GSDMD 、IL-1β及IL-18蛋白表達(dá)均下調(diào)(P<0.05);與DP組相比,ADP組大鼠海馬組織AKAP150、p-PKA蛋白表達(dá)均下調(diào),NLRP3、GSDMD 、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)均上調(diào)(P<0.05)。

注：A為各蛋白的電泳結(jié)果,B為各蛋白的定量結(jié)果;(1)與Con組比較,P<0.05;(2)與Pro組比較,P<0.05;(3)與DP組比較,P<0.05。

2.3 海馬組織中AKAP150、PKA、NLRP3、GSDMD、IL-1β及IL-18 mRNA的表達(dá)

RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示(圖3),與Con相比,Pro組、DP組、ADP組大鼠海馬組織AKAP150、PKA mRNA表達(dá)均下調(diào)(P<0.05),NLRP3、GSDMD 、IL-1β及IL-18 mRNA表達(dá)均上調(diào)(P<0.05);與Pro組相比,DP組大鼠海馬組織AKAP150、PKA mRNA表達(dá)均上調(diào)(P<0.05),NLRP3、GSDMD 、IL-1β及IL-18 mRNA表達(dá)均下調(diào)(P<0.05);與DP組相比,ADP組大鼠海馬組織AKAP150、PKA mRNA表達(dá)均下調(diào)(P<0.05),NLRP3、GSDMD 、IL-1β及IL-18 mRNA表達(dá)均上調(diào)(P<0.05)。

注：(1)與Con組比較,P<0.05;(2)與Pro組比較,P<0.05;(3)與DP組比較,P<0.05。

3 討論

越來(lái)越多的研究表明,異丙酚麻醉會(huì)造成新生大鼠海馬組織細(xì)胞焦亡[19-20]。這意味著,異丙酚麻醉可能會(huì)對(duì)新生兒產(chǎn)生神經(jīng)毒性,從而影響其大腦認(rèn)知功能。細(xì)胞焦亡是一種炎癥性程序性細(xì)胞死亡,其特征是由炎癥小體NLRP3觸發(fā)并由GSDMD蛋白執(zhí)行,造成細(xì)胞膜穿孔,進(jìn)而引起細(xì)胞死亡,在死亡的過(guò)程中釋放炎性因子IL-1β和IL-18,導(dǎo)致并放大炎癥反應(yīng),這也被認(rèn)為是細(xì)胞焦亡的經(jīng)典信號(hào)通路[21]。

因右美托咪定具有良好的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛及抗焦慮等作用,還能抑制炎癥反應(yīng)[22],在兒科醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用廣泛[23-25]。研究表明,神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生焦亡時(shí),NLRP3、GSDMD表達(dá)上調(diào),炎性因子IL-1β和IL-18的合成分泌增多[5-6]。右美托咪定可以通過(guò)NLRP3炎癥小體途徑減輕丙泊酚誘導(dǎo)的海馬組織細(xì)胞焦亡[4],當(dāng)PKA的活性增強(qiáng)時(shí),可以抑制NLRP3炎性小體介導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞焦亡[14]。最新研究表明,右美托咪定可通過(guò)上調(diào)PKA活性而改善神經(jīng)元的炎癥反應(yīng)及細(xì)胞焦亡,PKA參與了調(diào)控NLRP3炎癥小體引起的細(xì)胞焦亡和炎性反應(yīng),當(dāng)PKA活性增強(qiáng)時(shí),下游的NLRP3、IL-1β及IL-18表達(dá)下調(diào),從而減輕了神經(jīng)元炎性反應(yīng)和細(xì)胞焦亡[13,26-28]。而PKA的活性取決于A激酶錨定蛋白[29],該蛋白通常被認(rèn)為是PKA的支架蛋白,磷酸化事件通過(guò)與各種支架蛋白的相互作用來(lái)控制[17]。AKAP150屬于A激酶錨定蛋白家族成員,可精確地調(diào)控一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件的空間位置和時(shí)間順序,通過(guò)將PKA錨定于適當(dāng)?shù)牡孜锊⑿纬上鄳?yīng)的復(fù)合物,在PKA水平上調(diào)控其活性,提高磷酸化效率以及確保信號(hào)傳導(dǎo)的準(zhǔn)確性[16,18]。本研究結(jié)果顯示,異丙酚麻醉后的發(fā)育期大鼠,海馬組織AKAP150的表達(dá)明顯下調(diào),同時(shí)PKA活性也隨之下調(diào),細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、GSDMD以及炎性因子IL-1β、IL-18的表達(dá)明顯上調(diào)。右美托咪定預(yù)先給藥后,海馬組織AKAP150的表達(dá)明顯上調(diào),同時(shí)PKA活性也隨之上調(diào),細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、GSDMD以及炎性因子IL-1β、IL-18的表達(dá)明顯下調(diào)。為進(jìn)一步驗(yàn)證AKAP150與PKA、NLRP3、GSDMD以及炎性因子IL-1β、IL-18的相關(guān)性,通過(guò)腺病毒將AKAP150敲除后發(fā)現(xiàn),AKAP150的表達(dá)被抑制的同時(shí),PKA活性也隨之明顯下調(diào),細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、GSDMD以及炎性因子IL-1β、IL-18的表達(dá)則明顯上調(diào)。同時(shí),細(xì)胞焦亡的特征是膜孔形成,本研究中透射電鏡圖像分析表明,異丙酚麻醉后,海馬組織細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞,膜孔增加,右美托咪定預(yù)給藥后減輕了這一趨勢(shì)。綜上所述,有理由考慮,右美托咪定可能通過(guò)激活A(yù)KAP150表達(dá),增強(qiáng)了PKA的活化水平,抑制了細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、GSDMD的表達(dá),減少了海馬組織中炎性因子IL-1β和IL-18的合成和分泌,從而發(fā)揮出改善異丙酚所致的發(fā)育期大鼠海馬組織細(xì)胞焦亡的作用。因此,臨床上可考慮將右美托咪定視為一種具有潛力藥用前景的麻醉輔助用藥,但其作用機(jī)制和毒理性有待進(jìn)一步研究。