朱凡君 韋何雯 郭躍平 費(fèi)建楓

摘 要：本研究旨在開(kāi)發(fā)一種基于上轉(zhuǎn)換熒光納米材料的免疫層析法，以快速檢測(cè)水產(chǎn)品中的恩諾沙星含量。上轉(zhuǎn)換熒光納米材料具備特殊的光學(xué)性質(zhì)，能夠提升方法的靈敏度和準(zhǔn)確性。在抗體偶聯(lián)pH值、標(biāo)記熒光納米粒徑、檢測(cè)線包被蛋白濃度達(dá)到最佳條件時(shí)，該技術(shù)方法的檢出限為12.01 ng·mL-1，加標(biāo)回收率為95.73%～115.03%，變異系數(shù)為7.78%～22.17%，檢測(cè)過(guò)程約10 min。本方法為水產(chǎn)品中恩諾沙星的檢測(cè)提供了參考，為檢驗(yàn)方法的擴(kuò)展提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料；免疫層析法；恩諾沙星；快速檢測(cè)

Rapid Detection of Metronidazole by Immunochromatography with Upconversion Nanoparticles

Abstract： The purpose of this study was to develop an immunochromatography method based on upconversion fluorescent nanomaterials to rapidly detect the content of enrofloxacin in aquatic products. Upconversion fluorescent nanomaterials have special optical properties which can improve the sensitivity and accuracy of detection. Upconverted immunochromatography strips were prepared under optimal conditions by optimizing the antibody-conjugated pH， screening the labeled particle size， and determining the coating concentration. The detection limit of this technical method is 12.01 ng·mL-1， the recovery rate of spike is 95.73%～115.03%， the coefficient of variation is 7.78%～22.17%， and the detection process can only take about 10 minutes. This method provides a reference for the determination of enrofloxacin in aquatic products， and provides a basis for the expansion of the test method.

Keywords： up-conversion nanomaterials; immunochromatography; enrofloxacin; rapid detection

恩諾沙星屬喹諾酮類(lèi)抗生素，是一種廣譜抗菌藥物，具有殺菌作用，主要用于治療動(dòng)物的感染性疾病，其作用原理為抑制細(xì)菌的DNA回旋酶，從而阻止細(xì)菌的DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，起到殺菌作用[1-2]。常用于水產(chǎn)品感染性疾病及臨床上細(xì)菌感染性疾病的防治，以保障動(dòng)物的健康和生產(chǎn)性能[3]。而恩諾沙星會(huì)通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，可能對(duì)人體健康產(chǎn)生潛在風(fēng)險(xiǎn)[4]。因此，對(duì)于恩諾沙星殘留的檢測(cè)顯得尤為重要。目前，恩諾沙星殘留的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[5]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[6]，這些方法雖然重復(fù)性好、檢出限低，但樣品前處理麻煩，且整個(gè)檢測(cè)周期長(zhǎng)、檢測(cè)儀器昂貴、對(duì)操作人員要求高，不適于大批量樣本和現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)[7-8]。免疫層析技術(shù)是一種基于抗原-抗體特異性結(jié)合的快速檢測(cè)技術(shù)，具有檢測(cè)周期短、操作簡(jiǎn)便、靈敏高、特異強(qiáng)、成本低等優(yōu)點(diǎn)，可適用于大批量樣本和現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)[9-10]。而時(shí)間分辨、量子點(diǎn)、上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料在免疫層析技術(shù)中得到了廣泛發(fā)展和開(kāi)發(fā)應(yīng)用。免疫層析產(chǎn)品也從定性檢測(cè)發(fā)展成了用設(shè)備定量檢測(cè)，避免了因人眼觀察檢測(cè)線的有無(wú)或深淺帶來(lái)的人為主觀判讀誤差，使檢測(cè)結(jié)果更加可靠、準(zhǔn)確。本研究以鑭系上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料為免疫標(biāo)記物，采用近紅外光作為激發(fā)光源，具有穿透能力強(qiáng)、避免生物樣品的自體干擾等特點(diǎn)，開(kāi)發(fā)一種靈敏度高、特異性好、抗干擾性強(qiáng)、可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)水產(chǎn)品中恩諾沙星的免疫層析試紙條。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白（BSA）、羊抗兔IgG、兔IgG、恩諾沙星抗原、Tween-20、Triton X-100，生工生物工程（上海）股份有限公司；三羥甲基氨基甲烷、酪蛋白酸鈉，N-羥基丁二酰亞胺（NHS）和1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺（EDC），上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

硝酸纖維素膜（NC膜），德國(guó)賽多利斯公司；玻璃纖維，上海杰一生物技術(shù)有限公司；上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料，杭州勝行生物科技有限公司；DNA混合儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；高速離心機(jī)，塞洛捷克公司；熒光免疫分析儀，上海沫亙科技中心。

1.2 檢測(cè)原理

免疫層析將納米材料或熒光物質(zhì)標(biāo)記在檢測(cè)抗體/抗原上，樣本中的待測(cè)物質(zhì)可與標(biāo)記抗體（或抗原）、檢測(cè)線上的抗體（或抗原）發(fā)生特異性反應(yīng)，形成復(fù)合物并固定在檢測(cè)線上，在特定波長(zhǎng)的激發(fā)光照射下吸收能量，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)其回到基態(tài)時(shí)，以發(fā)射光的形式釋放能量，檢測(cè)器檢測(cè)發(fā)射光強(qiáng)度，而發(fā)光強(qiáng)度與檢測(cè)物質(zhì)的量相關(guān)，從而到達(dá)定量檢測(cè)的目的。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 條件優(yōu)化

（1）納米材料標(biāo)記pH值篩選。取3個(gè)離心管分別加入0.5 mg上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料溶液，在超聲條件下，使其充分分散。隨后將其離心（12 000 r·min-1，10 min）并去除上清液。通過(guò)加入1 mL嗎啉乙磺酸溶液（MES，50 mmol·L-1，pH=6.5）并在超聲條件下使其重懸。重復(fù)上述步驟1次。加入一定量EDC和NHS于上述重懸溶液中，使其表面羧基活化。接著放入DNA旋轉(zhuǎn)混合儀，離心去除上清液，用水混勻。再同樣步驟離心1次。接著加入不同pH值（pH=5.0、pH=7.0、pH=9.0）的緩沖溶液，超聲重懸。在離心管中加入恩諾沙星抗體，偶聯(lián)2～4 h或4 ℃過(guò)夜。加入適量的BSA以封閉空白位點(diǎn)，40 min后放入離心機(jī)離心（12 000×g，5 min），加入保存液，超聲重懸，重復(fù)上次步驟2～3次，最后得到修飾抗體后的熒光納米顆粒溶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）標(biāo)記納米材料粒徑篩選。取顆粒直徑不同的熒光納米材料（30 nm、60 nm和100 nm），在超聲條件下，使其充分分散，隨后將其離心（12 000 r·min-1，10 min）并去除上清液，加入1 mL MES溶液（50 mmol·L-1，pH=6.5）并在超聲條件下使其重懸，重復(fù)1次上述步驟。加入一定量EDC和NHS于上述重懸溶液中，使其表面羧基活化。接著放入DNA旋轉(zhuǎn)混合儀，離心去除上清液，用水混勻。再同樣步驟離心1次。在離心管中加入恩諾沙星抗體，偶聯(lián)2～4 h或4 ℃過(guò)夜。加入適量的BSA以封閉空白位點(diǎn)，40 min后放入離心機(jī)離心（12 000 r·min-1，5 min），加入保存液，超聲重懸，重復(fù)上次步驟2～3次，最后得到修飾抗體后的熒光納米顆粒溶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）檢測(cè)線包被濃度確定。用緩沖液配制得到不同濃度的恩諾沙星抗原（0.5 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、1.5 mg·mL-1和2.0 mg·mL-1），并分別將其包被于檢測(cè)線，同時(shí)將濃度為1.0 mg·mL-1羊抗兔IgG包被到NC膜上，在37 ℃條件下過(guò)夜孵育。將標(biāo)記抗體的復(fù)合物噴于結(jié)合墊上，用熒光免疫分析儀檢測(cè)結(jié)果，以陰性樣本和陽(yáng)性樣本響應(yīng)差值作為區(qū)分條件，差值越大，說(shuō)明該條件下的檢測(cè)效果越好。

1.3.2 樣本處理及檢測(cè)方法

（1）樣本處理。取10 g牛蛙腿肉樣本搗碎或攪碎，稱(chēng)取5 g于離心管中，加入5 mL樣本提取液，充分搖勻振蕩，并放入離心機(jī)離心（3 000 r·min-1，5 min），取上清液備用。

（2）檢測(cè)方法。測(cè)試前，先將該樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線錄入熒光免疫分析儀中。取100 ?L上清液與200 ?L樣本稀釋液充分混合搖勻，取100 ?L滴加于免疫層析試紙條上，測(cè)定其恩諾沙星含量。

1.3.3 試紙成品性能分析

（1）準(zhǔn)確性。取10 g牛蛙腿肉陰性樣本進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，在相同檢測(cè)條件下檢測(cè)5次，計(jì)算平均加標(biāo)回收率和變異系數(shù)（Coefficient of Variation，CV）。

（2）精密度。取一確認(rèn)陽(yáng)性的牛蛙樣本，進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算精密度。

（3）檢出限。檢出限=20次空白樣本平均值+3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)記抗體pH值確定

由表1可知，當(dāng)抗體標(biāo)記pH值為7.0時(shí)，陰性樣本和陽(yáng)性樣本之間的差值最大，說(shuō)明該條件下的檢測(cè)性能最為可靠。因此選擇pH值為7.0作為最優(yōu)標(biāo)記抗體pH值條件。

2.2 標(biāo)記納米材料粒徑確定

將粒徑為30 nm、60 nm、100 nm的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料使用掃描電鏡進(jìn)行表征，結(jié)果如圖1所示。在相同條件下標(biāo)記恩諾沙星抗體，對(duì)比檢測(cè)結(jié)果如表2所示，隨著納米材料粒徑增大，陰性樣本和陽(yáng)性樣本之間的差值也變大。在本方案中，納米材料粒徑在100 nm時(shí)為最優(yōu)。

2.3 檢測(cè)線包被蛋白濃度確定

由表3可知，陰性樣本和陽(yáng)性樣本之間的差值在包被濃度為1.0 mg·mL-1時(shí)最大，故選擇包被濃度1.0 mg·mL-1為最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件。

2.4 精密度、準(zhǔn)確性

取相同批次生產(chǎn)的免疫試紙條，在同一牛蛙腿肉樣本中添加不同濃度的恩諾沙星（20 ng·mL-1，50 ng·mL-1，100 ng·mL-1）進(jìn)行檢測(cè)。由表4可知，該方法的加標(biāo)回收率為95.73%～115.03%，變異系數(shù)為7.78%～22.17%，說(shuō)明該檢測(cè)方法具有良好的精密度及準(zhǔn)確性。

2.5 檢出限

取20次空白樣本進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行計(jì)算，該方法檢出限為12.01 ng·mL-1。

3 結(jié)論

恩諾沙星作為一種獸藥，因其高效、廣譜和低毒等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用，但由于使用不規(guī)范，在食品、環(huán)境中造成藥物殘留，給消費(fèi)者健康帶來(lái)隱患，引起了各方面的重視。而準(zhǔn)確、可靠的檢測(cè)產(chǎn)品可滿足快速精準(zhǔn)的實(shí)時(shí)大批量現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的實(shí)際需求。本研究將上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料應(yīng)用于免疫層析檢測(cè)技術(shù)中，采用競(jìng)爭(zhēng)法，對(duì)恩諾沙星進(jìn)行定量檢測(cè)分析，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，該方法檢測(cè)限可達(dá)12.01 ng·mL-1，加標(biāo)回收率為95.73%～115.03%，變異系數(shù)為7.78%～22.17%，檢測(cè)時(shí)間僅為10 min，為水產(chǎn)品中恩諾沙星的檢測(cè)提供了參考，為檢驗(yàn)方法的擴(kuò)展提供了依據(jù)。

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