王圓超 趙輝 王月 谷巖翡 高月麒 李曉露

摘要：目的 開發(fā)一種他克莫司的分離提純工藝。方法 采用離子交換樹脂脫色除雜、納濾、結(jié)晶等手段得到高質(zhì)量的他克莫司粗粉，再經(jīng)反相色譜硅膠層析、復(fù)合溶液結(jié)晶，得到符合USP標準的他克莫司精粉。結(jié)果 優(yōu)選的脫色樹脂為D002，所得他克莫司粗粉效價大于800 μg/mg，二氫他克莫司含量小于4%；該粗粉經(jīng)UniSil C8 Ultra Plus層析純化，精粉含量大于99.5%，最大單雜小于0.1%。結(jié)論 該工藝操作簡單、能耗低、收率高，適于他克莫司的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：他克莫司；分離提純；離子交換樹脂；層析；結(jié)晶

中圖分類號：R978.1文獻標志碼：A

Studies on the separation and purification of tacrolimus

Abstract Objective ? The purpose of this study is to develop a separation and purification process for tacrolimus. Methods? ? Tacrolimus coarse powder with high purity was obtained by ion exchange resin decolorization， nanofiltration and crystallization， which was further refined by reverse phase chromatography silica gel chromatography and composite solution crystallization to obtain the tacrolimus product that can meet USP standards. Results? ? The optimized decolorizing resin was D002. The titer of the tacrolimus coarse powder was more than 800 μg/mg and the purity of the dihydro-tacrolimus was less than 4%. Then we continued to purify the coarse powder using UniSil C8 Ultra Plus chromatography to obtain the fine powder. And the purity of the tacrolimus fine powder was more than 99.5%; the maximum single impurity substance was less than 0.1%. Conclusion? ? This method had the characteristics of simple operation， low energy consumption and high yield， which were of great significance to the industrial production of tacrolimus.

Key words Tacrolimus; Separation and purification; Ion exchange resin; Chromatography; Crystallization

他克莫司（tacrolimus，又名FK506），是由筑波鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，1993年獲批上市，分子式為C44H69NO12，分子量：804.03，結(jié)構(gòu)式如圖1所示，為白色或類白色結(jié)晶性粉末[1]。他克莫司是一種強效的新型免疫抑制劑，可用于肝移植、腎移植和骨髓移植等手術(shù)術(shù)后的排斥反應(yīng)治療[2]。其免疫抑制作用較環(huán)孢素（CsA）強100倍，因此在降低臨床使用劑量的同時，可大大減少不良反應(yīng)。此外，他克莫司也可用于治療特應(yīng)性皮炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和自身免疫性等疾病[3]。

他克莫司可通過微生物發(fā)酵進行規(guī)?；a(chǎn)，其發(fā)酵液中除目標產(chǎn)物外，還含有油脂、有機色素及他克莫司類似物，包括二氫他克莫司（FK+2）和子囊霉素（FK520）等雜質(zhì)[4]。工業(yè)上高純度的他克莫司主要通過預(yù)處理后的粗粉經(jīng)過柱層析的方法獲得[5-6]，因此粗粉的純度直接影響著他克莫司產(chǎn)品的質(zhì)量。目前，關(guān)于大孔吸附樹脂或改性硅膠吸附分離他克莫司的研究較多[7]，但大多工藝繁瑣，能耗高，粗粉質(zhì)量低。溫耀明等[8]使用中型高速逆流色譜法，提高了他克莫司粗粉質(zhì)量，但需要特殊設(shè)備，存在著純化收率低和工業(yè)化成本高的問題。吳振強等[9]將溶劑萃取和超臨界流體萃取相結(jié)合，從發(fā)酵菌絲體中提取他克莫司，此法提高了產(chǎn)品收率，但消耗大量溶劑，能耗高，環(huán)境污染嚴重。高慶峰等[10]采用復(fù)合型活性炭脫色除雜的方法純化他克莫司，避免了吸附解析步驟，減少了溶劑的使用，但未能得到高純度的他克莫司樣品，無法滿足高純度他克莫司產(chǎn)品的需求。因此，本領(lǐng)域亟需一種工藝簡潔、生產(chǎn)周期短、純度及收率高、綠色環(huán)保的他克莫司生產(chǎn)工藝。

本研究選用離子交換脫色樹脂，對他克莫司浸提液進行了凈化處理，在去除有機色素的同時，有效降低了發(fā)酵副產(chǎn)物雜質(zhì)的比例，繼而通過納濾、萃取、結(jié)晶的方式，制備得到了高質(zhì)量的他克莫司粗粉；再經(jīng)反相硅膠色譜層析、結(jié)晶等方式，得到顆粒均勻、質(zhì)量穩(wěn)定的他克莫司原料，為該產(chǎn)品通過國際高端認證、拓展高端市場奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

他克莫司發(fā)酵液（單位1617 μg/mL）由華北制藥華勝有限公司提供；分析純乙醇、乙腈、正庚烷購自天津市永大化學(xué)試劑有限公司；分析純乙酸乙酯、異丙醚購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；分析純甲醇購自成都市科隆化學(xué)品有限公司；90-772型藥用活性炭購自浙江杭木活性炭有限公司；超純水由Rephile純水儀制備。

D002、D290樹脂購自上海遜爾化工科技有限公司；氧化鋁購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；UniSil C18、UniSil C8 Ultra Plus、UniSil C8型反相色譜硅膠購自蘇州納微科技股份有限公司。

1.2 儀器

Loborata 4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（Heidolph公司）；JM1812-1卷式膜小型實驗機（大連屹東膜工程設(shè)備有限公司）；LC-2030C 3D型高效液相色譜儀（日本島津公司）；有機膜（天津膜天膜科技股份有限公司）。

2 實驗方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A：B=49：51，流動相A為水：四氫呋喃：磷酸=3000：600：0.8，流動相B為乙腈：四氫呋喃：磷酸=3000：600：0.8；流速1.0 mL/min；檢測波長210 nm；進樣量20 μL。

2.2 他克莫司粗粉制備

發(fā)酵液減壓抽濾，得到菌絲。菌絲中加入1倍發(fā)酵液體積的乙醇溶液攪拌浸泡2 h，抽濾得到浸提液。將浸提液調(diào)酒精度至45%～50%，上樣于脫色介質(zhì)除雜，透過液納濾濃縮得到濃縮液。乙酸乙酯萃取濃縮液1次，堿洗乙酸乙酯相2次后，萃取液濃縮至油膏狀，加入異丙醚結(jié)晶，結(jié)晶液過濾干燥后得到他克莫司粗粉。

2.3 他克莫司精粉制備

他克莫司粗粉用乙醇溶解，上樣于反相色譜硅膠中，使用有機溶液解析，分段收集解析液，合并含二氫他克莫司＜0.1%、子囊霉素＜0.1%的解析液。解析液減壓濃縮后加入乙酸乙酯萃取，萃取液濃縮干燥后，加入極性溶劑，攪拌結(jié)晶，然后過濾、干燥，得到他克莫司精粉。

3 結(jié)果與討論

3.1 浸提溶劑的選擇

由于他克莫司為胞內(nèi)產(chǎn)物，所以要選擇合適的浸提溶劑將他克莫司從胞內(nèi)提取出來。他克莫司易溶于甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯，微溶于己烷和石油醚，難溶于水[11]。乙醇毒性小，易于放大生產(chǎn)，因此選擇乙醇作為浸提溶劑，考察了乙醇濃度對浸提效果的影響。如圖2所示，當乙醇濃度為90%時，浸提效果最好。

3.2 脫色除雜參數(shù)的選擇

3.2.1 脫色介質(zhì)的優(yōu)選

他克莫司浸提液為棕褐色，顏色較深，且其中雜質(zhì)含量（FK+2和FK520，下同）較高。如能在粗粉制備階段除去大部分雜質(zhì)，則可提高粗粉質(zhì)量，也可為制備高純度精粉奠定基礎(chǔ)。如表1所示，浸提液通過Al2O3與D290樹脂后，他克莫司濃度降低幅度雖較小，但樹脂對色素、雜質(zhì)等吸附能力較弱，脫色效果差?；钚蕴繉λ四镜奈侥芰軓?，造成了極大損失。而經(jīng)過D002離子交換樹脂的浸提液中雜質(zhì)含量明顯降低，且D002離子交換樹脂對他克莫司的吸附性小，脫色液的顏色也較淺，故選擇D002樹脂作為他克莫司浸提液的脫色介質(zhì)。

3.2.2 洗脫流速的優(yōu)選

考察不同流速下D002離子交換樹脂對他克莫司浸提液的脫色效果，如表2所示。結(jié)果表明，不同流速下透過液中他克莫司濃度變化不大。當流速較低時，雜質(zhì)含量低，但脫色效率低；而過高的流速會使雜質(zhì)含量升高。當流速從0.5 BV/h升至1 BV/h時，透過液中雜質(zhì)含量變化不大；當流速繼續(xù)升至1.5 BV/h時，透過液中雜質(zhì)含量明顯升高，脫色液顏色變深。因此，選擇1 BV/h為最佳上樣速度。

3.3 納濾膜型號的選擇

納濾膜可截留大量亞微粒及大分子物質(zhì)，改善料液的透光度，降低相對密度，從而提高結(jié)晶收率，加快結(jié)晶過濾速度[12]。而且采用納濾濃縮取代傳統(tǒng)減壓濃縮，可有效降低能耗，提高濃縮效率。因此對不同截留分子量納濾膜的截留效果及濃縮時間進行了考察，結(jié)果如圖3所示。截留分子量為200～300 Da時，截留率高，但濃縮時間較長；截留分子量為700 Da時，濃縮時間短，但截留率低。綜合考慮，選擇截留分子量為500 Da的膜對脫色液進行納濾濃縮。

3.4 層析參數(shù)的選擇

他克莫司發(fā)酵液經(jīng)離子交換樹脂脫色除雜、納濾、結(jié)晶等方法分離純化后，可以得到效價大于800 μg/mg，最大單雜小于4%的他克莫司粗粉。為獲得高質(zhì)量的他克莫司精粉，本文采用反相色譜硅膠層析、結(jié)晶技術(shù)對粗粉進一步提純。

3.4.1 層析介質(zhì)的優(yōu)選

考察UniSil C18、UniSil C8 Ultra Plus和UniSil C8? ?3種反相色譜硅膠的分離效果，結(jié)果如圖4所示，其中UniSil C8 Ultra Plus型色譜硅膠FK506含量、收率最高，故選擇UniSil C8 Ultra Plus型反相色譜硅膠為層析介質(zhì)。

3.4.2 洗脫溶劑的優(yōu)選

乙醇、甲醇、乙腈均可將他克莫司從反相色譜硅膠中洗脫下來，如圖5所示，乙腈洗脫時溶劑用量少，但FK506含量及收率低；而甲醇、乙醇洗脫時，F(xiàn)K506含量、收率、洗脫液體積均相差不大，但考慮到溶劑毒性，工藝放大生產(chǎn)的安全性等因素，綜合評估后選擇乙醇作為洗脫溶劑。

3.4.3 上樣量的優(yōu)選

考察不同上樣量對于層析效果的影響，結(jié)果如圖6所示，其中上樣量為8 mg/mL時FK506含量、收率最高。因此上樣量選擇為8 mg/mL。

3.5結(jié)晶溶劑的選擇

藥物的固體形式（結(jié)晶形或無定形）對藥物的性質(zhì)和后續(xù)產(chǎn)品的性能有較大影響[13]。在藥物結(jié)晶時，溶劑的種類和濃度會影響結(jié)晶過程，進而影響其固體形式[14]。因此，本研究選擇不同溶劑進行了結(jié)晶實驗。如圖7所示，當單獨使用異丙醚、正庚烷作為結(jié)晶溶劑時，結(jié)晶粉中FK506含量較低。若使用復(fù)合溶劑，結(jié)晶粉中FK506含量得到較大提升。其中異丙醚-水、異丙醚-乙酯-水作為結(jié)晶溶劑時，F(xiàn)K506含量較高。但異丙醚-乙酯-水作為結(jié)晶溶劑時，F(xiàn)K506結(jié)晶收率較低。而異丙醚-水作為結(jié)晶溶劑時，F(xiàn)K506含量、結(jié)晶收率均較高，且結(jié)晶粉為片狀結(jié)晶，顆粒均勻，如圖8所示。因此，選擇異丙醚-水作為他克莫司的結(jié)晶溶劑。

3.6 工藝驗證

按照確定的工藝條件，進行連續(xù)3批的重復(fù)實驗，如表3～4所示。在本實驗優(yōu)選工藝參數(shù)下可得到效價大于800 μg/mg的他克莫司粗粉，二氫他克莫司小于4%；所得他克莫司精粉含量大于99.5%，最大單雜小于0.1%。本工藝穩(wěn)定性高、重現(xiàn)性好，可實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

4 結(jié)論

他克莫司是繼環(huán)孢素后開發(fā)的一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，是目前臨床上最為看好的強效免疫抑制劑之一。本文以他克莫司發(fā)酵液為原料，利用離子交換樹脂脫色除雜、納濾濃縮與層析純化技術(shù)等，得到了含量大于99.5%，最大單雜小于0.1%的他克莫司精粉。該工藝從源頭上降低了有機色素等雜質(zhì)的干擾，提升了粗粉質(zhì)量，進而穩(wěn)定提高了精制效率，更好保證了產(chǎn)品質(zhì)量。與現(xiàn)有提取技術(shù)相比具有純度及收率高、溶媒用量少、環(huán)境污染小等特點，實現(xiàn)了他克莫司的技術(shù)指標提高和生產(chǎn)環(huán)境優(yōu)化，對其工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。

參 考 文 獻

傅立峰， 金美英， 單昱東， 等. 他克莫司的發(fā)酵生產(chǎn)研究[J]. 發(fā)酵科技通訊， 2018， 47（1）： 38-47.

黃金沐， 池惠瓊， 張忠陽. 他克莫司的研究概況[J]. 海峽藥學(xué)， 2010， 22（11）： 148-150.

付曉婷， 陳民輝， 嚴菲， 等. 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用鑒定他克莫司的有關(guān)物質(zhì)[J]. 中國藥科大學(xué)學(xué)報， 2022， 53（5）： 563-576.

王傳喜， 樂占線， 連云陽， 等. 他克莫司互變異構(gòu)體的制備及其結(jié)構(gòu)鑒定[J]. 中國抗生素雜志， 2014， 39（10）： 734-737.

樂占線， 秦建萍， 王祥開， 等. 一種用于純化他克莫司的層析柱及他克莫司的純化方法： CN， 111450574A[P]. 2020-07-28.

左成， 曾琳洪， 許日泉， 等. 一種制備高純度他克莫司的工藝： CN， 103554133B[P]. 2015-06-24.

諸敏. 大孔吸附樹脂吸附分離FK506的工藝研究[J]. 藥物研發(fā)， 2014， 35（21）： 71-74.

溫耀明， 肖麗華， 鄭衛(wèi)， 等. 高速逆流色譜純化他克莫司工藝放大研究[J]. 中國抗生素雜志， 2014， 39（4）： 267-271.

吳振強， 田霄飛， 胡夢花， 等. 從發(fā)酵菌絲體中提取高純度他克莫司的裝置： CN， 207512110U[P]. 2018-06-19.

高慶峰， 吳萍， 諸敏， 等. 復(fù)合型活性炭及其在純化他克莫司中的應(yīng)用： CN，105819444A[P]. 2016-08-03.

霍濤濤. 他克莫司增溶體系的構(gòu)建與評價[D]. 福建醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文， 2018.

王崔巖， 郭月玲， 仲偉潭. 兩性霉素B分離純化工藝研究[J]. 中國抗生素雜志， 2020， 12（45）： 1238-1241.

吳萍， 黃國傳， 劉文鵬， 等. 不同晶習(xí)他克莫司-水合物晶型的表征研究及穩(wěn)定性考察[J]. 中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)， 2022， 39（14）： 1856-1862.

師軍鳳， 王丹， 田陽， 等. 藥物晶型的影響因素及其篩選控制策略[J]. 中國藥學(xué)雜志， 2022， 57（22）： 1873-1880.