錢葉飛 魯輝 許奇 吳楊 黃逸文

摘要：目的 對新型抗結核分枝桿菌藥普托馬尼各合成路線涉及的3個共性工藝雜質：（S）-叔丁基二甲基硅烷縮水甘油醚（雜質I）、（S）-丁酸縮水甘油酯（雜質II）、4-三氟甲氧基溴芐（雜質III）進行遺傳毒性評價并建立相應的質量控制方法。方法 分別采用基于專家規(guī)則和統(tǒng)計學原理的2種互補的（定量）構效關系[（Q）SAR]模型（Derek和Sarah）對普托馬尼中3個工藝雜質的遺傳毒性進行評價和分類；根據(jù)評價結果建立氣相色譜-串聯(lián)質譜（GC-MS/MS）法，采用分時段多反應監(jiān)測（MRM）模式同時對這3個工藝雜質進行測定，并闡述這3個工藝雜質在EI源下的質譜裂解規(guī)律。結果 雜質I和雜質III Derek評估結果均為陽性，Sarah評估結果分別為模棱兩可和陰性，依據(jù)ICH M7指南分類為3類致突變雜質；雜質II Derek評估結果為陽性，Sarah結果顯示有明確的Ames陽性實驗結果，為2類已知致突變雜質。3個工藝雜質均需按照毒理學關注閾值（TTC）進行控制，建立的GC-MS/MS法經驗證3個雜質可有效分離，線性關系良好，方法定量限均低于擬定限度的15%，平均回收率（n=9）分別為105.5%、104.4%和108.5%，重復性RSD（n=6）分別為2.2%、5.8%和2.2%。3批樣品均檢出雜質III。結論 建立的GC-MS/MS法操作簡單，專屬性強，靈敏度高，可用于普托馬尼中3個潛在致突變雜質的測定。由于雜質II也是惡唑烷類抗菌藥如利奈唑胺、咔噠唑胺、泰地唑胺等的共性工藝雜質，因此本研究也為其他惡唑烷類抗菌藥中雜質II的質量控制提供了參考。

關鍵詞：普托馬尼；遺傳毒性雜質；（定量）構效關系；氣相色譜-串聯(lián)質譜法

中圖分類號：R978文獻標志碼：A

（Q）SAR genotoxicity evaluation and GC-MS/MS determination of three process impurities in pretomanid， an antibacterial agent

Abstract Objective To evaluate the genotoxicity of three process impurities involved in various synthetic routes of pretomanid， a new antimycobacterial drug， and to establish the quantitative method of these three impurities， namely （S）-tert-butyldimethyl（oxiran-2-ylmethoxy） silane （impurity I）， （S）-oxiran-2-ylmethyl butyrate （impurity II）， and 1-（bromomethyl）-4-（trifluoro methoxy）benzene （impurity III）. Methods Two complementary （quantitative） structure-activity relationship [（Q）SAR] evaluation models （Derek and Sarah） based on expert rules and statistics， respectively， were employed to assess and classify the genotoxicity of the three process impurities in pretomanid， and a GC-MS/MS method with the time-segmented multiple reaction monitoring （MRM） mode was subsequently developed for the simultaneous determination of the three impurities. The fragmentation patterns of the three impurities in EI source were also discussed in this study. Results The Derek evaluation results were all positive for impurities I and III， while the Sarah results were equivocal and negative， respectively， indicating impurities I and III were categorized as class 3 as per ICH M7 guideline. Impurity II was regarded as a confirmed mutagenic impurity of class 2 since Sarah showed specific positive results in Ames test. The threshold of toxicological concern （TTC） was applied to control these three impurities. The developed GC-MS/MS method was validated and showed effective resolutions between the impurities with good linearity. The LOQ values of the three impurities were all as low as 15% of the acceptable limit. The average recoveries （n=9） were 105.5%， 104.4%， and 108.5%， while the repeatabilities RSD （n=6） were 2.2%， 5.8%， and 2.2%， respectively. Impurity III was detected in all batches. Conclusion? ? The established method is easy to operate and proved selective and sensitive， which is applicable for quality control of the three potential genotoxic impurities in pretomanid. This study can also be referenced for the quality control of impurity II in other oxazolidinone antibacterial drugs like linezolid， cadazolid， and tedizolid， as impurity II was the common impurity.

Key words Pretomanid; Genotoxic impurity; （Q） SAR; GC-MS/MS

普托馬尼（pretomanid， PA-824），化學名為（S）-2-硝基-6-[4-（三氟甲氧基）芐氧基]-6，7-二氫-5H-咪唑并[2，1-b] [1，3]惡嗪，是一種硝基咪唑并惡嗪類的新型抗結核分枝桿菌藥物，由全球結核病藥物開發(fā)聯(lián)盟開發(fā)，于2019年8月獲FDA批準上市，與貝達喹啉（bedaquiline）和利奈唑胺（linezolid）聯(lián)用，用于治療特定類型的高度耐藥肺結核患者[1-2]。普托馬尼是近40年來FDA批準的第3個抗肺結核新藥，也是第1個由非營利組織開發(fā)上市的抗肺結核新藥[3-4]。

普托馬尼的生產工藝涉及多種合成路線[5-7]，但其核心均為構建硝基咪唑并惡嗪環(huán)的手性中心以及引入4-三氟甲氧基芐基側鏈。其中手性中心的構建多是通過帶有保護基的（S）-縮水甘油醇作為手性源直接引入，主要為（S）-叔丁基二甲基硅烷縮水甘油醚和（S）-丁酸縮水甘油酯；而側鏈均通過4-三氟甲氧基芐溴引入。因此，（S）-叔丁基二甲基硅烷縮水甘油醚、（S）-丁酸縮水甘油酯和4-三氟甲氧基芐溴可作為普托馬尼各合成路線的共性工藝雜質殘留在終產品中，且分別含有典型的遺傳毒性警示結構—環(huán)氧結構和鹵代烷烴結構[8-9]。普托馬尼和3個工藝雜質的化學結構見圖1。

作為已獲批上市的藥物，普托馬尼本身的毒性包括遺傳毒性相關信息是已知和公開的，其已通過體外細菌回復突變試驗（Ames）證明無致突變性[10]。然而，藥物雜質的毒性相關信息通常是不公開或未知的。此外，人用藥品技術要求國際協(xié)調理事會（ICH） M7（R1）指南（《評估和控制藥物中DNA反應性（致突變）雜質以限制潛在致癌風險》）提出，對于藥物雜質應關注其遺傳毒性，尤其是致突變性，對于非致突變性雜質可按普通雜質進行控制，并明確提出不應僅依據(jù)目視法有無警示結構而判定是否為遺傳毒性（致突變性）雜質[11-12]。

由于對所有藥物雜質進行體內外相關毒理實驗是不現(xiàn)實的，（定量）構效關系[（Quantitative） Structure-Activity Relationships， （Q）SAR]技術作為一種通過化合物現(xiàn)有資料、化學結構和對Ames試驗結果的預測而評估其致突變性的計算機毒理學模型[13-15]，被各監(jiān)管機構和指南廣泛推薦用于藥物雜質的遺傳毒性（致突變性）的評估和分類[11-12]。ICH M7指南要求采用2種互補的（Q）SAR評估模型，一種基于專家規(guī)則，一種基于統(tǒng)計學原理，且對于分類為2類或3類的致突變雜質，應采用毒理學關注閾值（TTC，1.5 μg/d）作為每日可接受攝入量并嚴格控制[11]。普托馬尼每日最高服用劑量為0.2 g，因此其中的致突變雜質限度為7.5 μg/g，對分析方法的靈敏度提出了較高的要求。

目前尚無普托馬尼相關雜質毒性評價及這3個工藝雜質測定的研究報道[16-17]，本研究分別采用基于專家規(guī)則的Derek模型和統(tǒng)計學原理的Sarah模型這2種（Q）SAR工具對普托馬尼中的這3個共性工藝雜質進行遺傳毒性評估與分類，并根據(jù)評估結果建立了專屬靈敏的氣相色譜-串聯(lián)質譜（GC-MS/MS）法，采用分時段多反應監(jiān)測（MRM）模式同時對這3個工藝雜質進行測定。此外，本研究對這3個工藝雜質在EI源下的質譜裂解規(guī)律也進行了闡述。

1 儀器與試藥

1.1 （Q）SAR模型

Derek版本：Derek Nexus 6.1.1；數(shù)據(jù)庫：Derek KB 2020 1.0；數(shù)據(jù)庫版本：1.0；數(shù)據(jù)庫日期：2020年3月26日。Sarah版本：Sarah Nexus 3.1.1；模型：Sarah Model 2020.1；模型版本：1.8。Nexus版本（Derek和Sarah的整合平臺）：Nexus 2.4.0。以上系統(tǒng)均由英國Lhasa公司（http：//www.lhasalimited.org/）開發(fā)。

1.2 儀器

8890-7010B型氣相色譜質譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司）；XSE205DU型十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler公司）。

1.3 試劑與試藥

（S）-叔丁基二甲基硅烷縮水甘油醚對照品（批號：7M4BH，純度：99.7%）、（S）-丁酸縮水甘油酯對照品（批號：UXB5A，純度：98.2%）和4-三氟甲氧基芐溴對照品（批號：S7JUE，純度：99.1%）均購自東京化成工業(yè)株式會社（TCI）；3批普托馬尼樣品（批號：PA20201001、PA20210321、PA20210506）由煙臺藥物研究所提供；色譜級四氫呋喃購自美國Sigma公司。

2 方法

2.1 （Q）SAR遺傳毒性評價

采用Chemdraw繪制普托馬尼和3個雜質的化學結構后導入Nexus 2.4.0系統(tǒng)，物種設為細菌（bacterium），預測終點設置為遺傳毒性（genotoxicity）項下的致突變性（mutagenicity）。采用ICH M7分類模式（ICH M7 classification）對遺傳毒性進行評價和自動分類。

2.2 色譜條件

采用Agilent HP-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm， 0.25 μm）；載氣為氦氣，流速1.0 mL/min；進樣口溫度200 ℃；分流進樣，分流比5∶1；進樣體積1 μL；柱溫為程序升溫（起始溫度60 ℃，保持1 min，以8 ℃/min升溫至130 ℃，保持1 min，再以60 ℃/min升溫至250 ℃，保持5 min）。

2.3 質譜條件

采用EI源，電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；質譜傳輸線溫度250 ℃；掃描模式為分時段MRM；各化合物監(jiān)測時間段、定性與定量離子對及對應的碰撞能詳見表1；駐留時間（dwell time）均為80 ms；溶劑延遲時間5 min；運行時間12 min；增益因子為10。

2.4 溶液制備

空白溶劑：四氫呋喃

對照品貯備液：分別精密稱取雜質I、雜質II、雜質III對照品適量，置同一量瓶中，加溶劑溶解并稀釋制成濃度均為100 ng/mL的混合溶液。

線性考察溶液：精密量取對照品貯備液適量，加溶劑逐級稀釋制成濃度分別為5、10、20、40、80和100 ng/mL的系列溶液。

對照品溶液：精密量取對照品貯備液適量，加溶劑稀釋制成濃度為40 ng/mL的溶液。

供試品溶液：精密稱取普托馬尼樣品適量，加溶劑溶解制成5 mg/mL的溶液。

加樣回收率溶液：分別精密稱取普托馬尼樣品（批號：PA20210321）適量，置9個量瓶中，分別加入5、40和80 ng/mL的系列對照品溶液，溶解制成低、中、高3個濃度水平的加樣回收率溶液，每個濃度水平平行制備3份。

重復性考察溶液：精密稱取普托馬尼樣品（批號：PA20210321）適量，加對照品溶液溶解制成100%濃度水平的加標供試品溶液，平行制備6份。

3 結果

3.1 （Q）SAR遺傳毒性評價

Derek是通過將用戶輸入結構與專家知識庫中的警示結構規(guī)則比對，然后突出顯示所有和毒性相關的警示結構，給出毒性評估結果；而Sarah是基于機器學習算法，從Ames實驗數(shù)據(jù)出發(fā)，構建統(tǒng)計模型。依據(jù)ICH M7指南，如果這2種互補的計算機評價模型均給出致突變性為陰性的預測結果，可以認為該雜質無致突變性，歸類為5類普通雜質；相反，若2種軟件中至少有1種給出陽性預測結果，則認為該雜質致突變性為陽性，歸類為3類；若有明確的致癌性或致突變性數(shù)據(jù)（非預測），則進一步歸類為1類或2類。此外，若藥物本身即存在相同的警示結構，則雜質分類為4類，也按照非致突變雜質即普通雜質控制。

結果如表2所示，雜質I和雜質III Derek評估結果均為陽性，顯示的警示結構分別為環(huán)氧化物和烷化劑，且這2類警示結構未存在于普托馬尼結構中；Sarah評估結果分別為模棱兩可和陰性（置信度47%），雜質I和雜質III最終分類為3類致突變雜質。雜質II Derek評估結果為陽性，顯示的警示結構為環(huán)氧丙基酯，且該警示結構未存在于普托馬尼結構中；Sarah結果顯示為100%陽性，即雜質II有明確的體外Ames陽性實驗結果，為2類已知致突變雜質。3個工藝雜質均需按照TTC進行控制。

3.2 質譜裂解規(guī)律與離子對的選擇

取混合對照品貯備液在m/z 40～400范圍內進行全掃描（full scan），由圖2各雜質一級質譜數(shù)據(jù)可知，在EI源標準70 eV電離能下，除雜質III可見很弱的分子離子峰m/z 254，雜質I和雜質II均未見分子離子峰。其中雜質I的一級質譜圖中最高質量數(shù)為m/z 131，為基于醚類化合物α斷裂的產物；雜質II一級質譜圖中最高質量數(shù)為m/z 116，為γ-H發(fā)生McLafferty重排（麥氏重排）后脫去一分子乙烯的產物；雜質III雖可見分子離子峰m/z 254，但豐度太低，影響定量靈敏度，第二大質量數(shù)為m/z 175，為i斷裂脫溴自由基的產物，且豐度最高。由于較高的質量數(shù)結構特異性和抗干擾能力強，同時兼顧豐度，最終選擇m/z 131、116、175作為3個雜質的定量母離子。

進一步對各化合物母離子設置不同碰撞能（CE）進行子離子掃描（圖3）。結果顯示，作為有機硅化物的特有裂解規(guī)律[18-19]，雜質I的母離子m/z 131可分別經烷基重排脫甲醛裂解以及經H重排脫醛裂解生成碎片離子m/z 101和59；同時作為醚類化合物母離子m/z 131亦可發(fā)生四元環(huán)過渡態(tài)重排生成碎片離子m/z 75（圖4A）。其中m/z 101豐度最高且在10 eV碰撞能下達到峰值，因此最終以m/z 131→m/z 101作為定量離子對，CE設為10 eV。將豐度第二高的m/z 59作為定性子離子，CE經篩選為25 eV。

雜質II的母離子m/z 116通過α斷裂生成碎片離子m/z 43；或通過i斷裂生成碎片離子m/z 42和57（圖4B）。其中m/z 57豐度最高且在10 eV碰撞能下達到峰值，因此以m/z 57作為定量離子對，CE設為10 eV。定性子離子設為m/z 42，CE為18 eV。

雜質III的母離子m/z 175經中性丟失生成三氟碳正離子m/z 69；或經苯環(huán)擴環(huán)形成穩(wěn)定的?鎓離子，失去一分子環(huán)戊二烯后生成碎片離子m/z 109（圖4C）。其中m/z 109豐度最高，因此最終以m/z 175→m/z 109作為定量離子對，以m/z 175→m/z 69為定性離子對。

3.3 方法學驗證

3.3.1 專屬性

分別取“2.4”項下空白溶液、對照品溶液、供試品溶液（批號：PA20210321），按“2.2”和“2.3”項下色譜與質譜條件進樣分析，記錄色譜圖（圖5），結果表明空白溶液和樣品基質不干擾3個目標化合物的測定。

3.3.2 線性與范圍

取“2.4”項下系列線性考察溶液分別進樣，記錄色譜圖，以濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標按最小二乘法進行回歸分析（n=6），結果見表3。3個目標化合物在5～100 ng/mL范圍內質量濃度與響應值線性關系顯著（P<0.001）。且截距95%置信區(qū)間均包含0，說明截距與0無顯著性差異（P>0.05），可采用外標一點法計算各目標化合物含量。

3.3.3 檢測限與定量限

用溶劑將對照品溶液逐級稀釋，按“2.2”和“2.3”項下色譜與質譜條件進樣分析，記錄色譜圖。以信噪比>10時相應的濃度作為定量限（LOQ）濃度，以信噪比>3時相應的濃度作為檢測限（LOD）濃度。結果詳見表3，3個雜質LOQ濃度低于限度濃度的15%，表明方法靈敏度滿足限度要求。LOQ連續(xù)進樣6次，RSD（n=6）分別為2.7%、8.3%和1.7%，表明LOQ精密度良好。

3.3.4 回收率

取“2.4”項下加樣回收率溶液，按“2.2”和“2.3”項下色譜與質譜條件進樣測定，計算各目標化合物在LOQ、100%、200% 3個濃度水平的平均回收率，結果見表4。

3.3.5 重復性

取“2.4”項下6份重復性考察溶液，按“2.2”和“2.3”項下色譜與質譜條件進樣測定，結果各目標化合物峰面積RSD（n=6）分別為2.2%、5.8%和2.2%，表明方法重復性良好。

3.3.6 溶液穩(wěn)定性

取“2.4”項下對照品溶液在室溫下分別于0、4、8、12和16 h進樣測定，結果各目標化合物峰面積RSD（n=5）分別為2.5%、7.7%和1.7%，表明溶液在室溫下16 h內穩(wěn)定性良好。

3.4 樣品測定

取3批普托馬尼樣品制備供試品溶液后進樣測定，按外標法計算3個遺傳毒性雜質的含量，結果顯示3批樣品均檢出雜質III，含量分別為1.3 μg/g、

4 討論

經溶劑篩選發(fā)現(xiàn)普托馬尼在甲醇和四氫呋喃中溶解度較好，適合制備較高濃度的供試品溶液來提高方法靈敏度，其中以四氫呋喃為溶劑時目標峰信號響應更強，因此作為樣品溶劑。由于3個雜質極性較小，因此選擇了弱極性柱HP-5MS作為色譜柱，3個化合物均有較好的保留，在full scan模式下經程序升溫的優(yōu)化，各化合物之間以及與空白峰互不干擾。雜質I和雜質II均為環(huán)氧化物，在高溫下穩(wěn)定性較差，易開環(huán)降解，但較低的進樣口溫度不利于目標化合物的揮發(fā)和檢測，篩選了180、200、220和250 ℃等不同進樣口溫度，通過在full scan模式下觀察目標峰響應和其他干擾峰的大小，最終選擇進樣口溫度為200 ℃。根據(jù)3個目標化合物出峰時間，選擇了分時間段的MRM監(jiān)測模式，使得在一定的總掃描時間內，各化合物的離子對通道被分配更長的駐留時間，從而提高方法靈敏度。各化合物母離子、子離子以及碰撞能等質譜參數(shù)的選擇詳見“3.2”項下。

作為新型抗結核分枝桿菌藥，普托馬尼的合成工藝有較多文獻報道，本研究基于不同合成策略涉及到的3個共性工藝雜質，采用Derek和Sarah 2個原理互補的商業(yè)化（Q）SAR模型對其進行了遺傳毒性（致突變性）評價；并根據(jù)陽性評估結果建立了專屬、靈敏的GC-MS/MS測定法，依據(jù)3個雜質的裂解規(guī)律選擇合適的定量離子對和CE提高方法選擇性和靈敏度，并采用分時段的MRM監(jiān)測模式進一步提高檢測靈敏度。結果3批樣品均檢出雜質III。此外，由于雜質II也是利奈唑胺、咔噠唑胺、泰地唑胺等惡唑烷類抗菌藥的常用手性合成砌塊，因此本研究也為其他惡唑烷類抗菌藥中雜質II的質量控制提供了參考。

參 考 文 獻

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