王會(huì)會(huì) 趙建輝 孫術(shù)超 劉雨 任風(fēng)芝 趙建強(qiáng)

摘要：目的 選育他克莫司高產(chǎn)菌株，優(yōu)化培養(yǎng)基配方，提高發(fā)酵產(chǎn)量。方法 采用原生質(zhì)體融合技術(shù)對(duì)2株筑波鏈霉菌進(jìn)行基因組重排，并經(jīng)響應(yīng)面設(shè)計(jì)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果 以紫外滅活作為遺傳標(biāo)記經(jīng)過(guò)4輪基因組重排育種后，搖瓶篩選獲得3株高產(chǎn)菌株，其中菌株FK22-71菌絲球松散、橢圓狀，發(fā)酵浸泡液顆粒狀。該菌株穩(wěn)定高產(chǎn)，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化后的配方在50 L罐發(fā)酵產(chǎn)量平均達(dá)1684 mg/L。結(jié)論 基因組重排技術(shù)應(yīng)用于他克莫司高產(chǎn)菌株選育，可大幅提高發(fā)酵產(chǎn)量，為其工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：基因組重排；他克莫司；響應(yīng)面設(shè)計(jì)；培養(yǎng)基優(yōu)化

中圖分類號(hào)：R978文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Breeding of tacrolimus high-yield strain and optimization

of fermentation conditions

Abstract Objective Breeding high-yield strains of tacrolimus and optimizing the culture medium formula to improve the fermentation unit. Methods The protoplast fusion technique was used to rearrange the genome of two Streptomyces tsuknbaenis strains， and the fermentation medium was optimized by response surface design. ResultsAfter four rounds of genome shuffling breeding with UV inactivation as genetic marker， three high-yield strains were obtained by shaking flask screening. Among them， the mycelium ball of strain FK22-71 was loose and oval， and the fermentation soaking liquid was granular. In 50 L fermentor， the average production of tacrolimus reached 1684 mg/L under the response surface optimization by the strain FK22-71，which was steady and high-yielding. Conclusion The application of genome shuffling technology in the breeding of high-yielding tacrolimus producing strains can significantly increase production and lay the foundation for industrial fermentation production.

Key words Genome shuffling; Tacrolimus; Response surface design; Medium optimization

他克莫司（tacrolimus）作為第二代免疫抑制劑的代表之一，可以抑制干擾素IFN-r、白細(xì)胞介素和抗體的產(chǎn)生，有抗器官移植排異作用，其免疫抑制作用機(jī)制與環(huán)孢素相似，但在體外抑制T淋巴細(xì)胞的強(qiáng)度是環(huán)孢素A的10～100倍，臨床使用劑量低，效果良好[1-2]，

據(jù)報(bào)道，2022年他克莫司全球銷售額為26.55億美元，在自身免疫性疾病中發(fā)揮著積極作用。

他克莫司是筑波鏈霉菌（Streptomyces tsukuba-ensis）產(chǎn)生的一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的次級(jí)代謝產(chǎn)物，其工業(yè)化生產(chǎn)受到菌種和發(fā)酵過(guò)程等因素的制約，影響了他克莫司的成本和應(yīng)用規(guī)模[3]。自他克莫司被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于臨床以來(lái)，有關(guān)筑波鏈霉菌和他克莫司生物合成的研究一直在持續(xù)進(jìn)行，研究者們采用不同方法，如：生產(chǎn)菌株選育、發(fā)酵工藝優(yōu)化和代謝工程改造等，來(lái)提高他克莫司產(chǎn)量，取得了顯著進(jìn)步。嚴(yán)凌斌等[4]采用60Coγ輻射和亞硝基胍（NTG）復(fù)合誘變并結(jié)合鏈霉菌和慶大霉素抗性篩選，獲得的高產(chǎn)菌株搖瓶發(fā)酵水平較出發(fā)菌株提高65%，中試發(fā)酵平均水平達(dá)1319 mg/L。Ye等[5]采用（常壓室溫等離子體）ARTP和原生質(zhì)體融合技術(shù)對(duì)出發(fā)菌株S. tsukubaensis No. 9993進(jìn)行多輪篩選，獲得的突變菌株產(chǎn)量是出發(fā)菌株的2.6倍。李蕾[6]對(duì)他克莫司產(chǎn)生菌進(jìn)行多輪紫外（UV）、硫酸二乙酯（DMS）、NTG的誘變選育，發(fā)現(xiàn)經(jīng)同一種方法或同一誘變劑多輪誘變后，產(chǎn)量提升幅度較低。

基因組重排技術(shù)（genome shuffling，GS）以含有不同正突變體的突變菌株為起始，利用原生質(zhì)體融合的方法將不同突變體的基因組重排[7]。GS技術(shù)可以大幅度地縮短菌株選育周期，同時(shí)采用遞推式重組技術(shù)明顯增大菌株的進(jìn)化幾率，擴(kuò)大變異范圍，增加獲得高產(chǎn)突變菌株的機(jī)會(huì)。該技術(shù)可在無(wú)需了解編碼生物酶基因、基因表達(dá)調(diào)控、微生物代謝途徑等知識(shí)的條件下，對(duì)微生物實(shí)現(xiàn)定向育種，獲得目的菌株[8-9]。李婧婧等[10]對(duì)1株普那霉素產(chǎn)生菌Streptomyces pristinaespiralis LS15 進(jìn)行 Genome Shuffling 的育種研究，獲得的融合子普那霉素產(chǎn)量比原始菌株提高了91.5%。Song等[11]對(duì)Streptomyces diastatochromogenes進(jìn)行3輪基因組改組篩選，獲得融合菌株豐加霉素產(chǎn)量比野生型提高了10.8倍，比親本菌株提高了2.64倍。

響應(yīng)面分析法（response surface methodology，RSM）是一種尋找多因素系統(tǒng)中最佳條件的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法，具有試驗(yàn)次數(shù)少、周期短、精度高等特點(diǎn)，收到越來(lái)越多的重視，已被成功用于發(fā)酵優(yōu)化、尋求最佳工藝參數(shù)等多個(gè)領(lǐng)域。張瀚等[12]利用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)刺糖多胞菌的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，獲得了最佳植物油脂的添加量，顯著提高了多殺菌素的產(chǎn)量。

本研究采用的2株筑波鏈霉菌出發(fā)株為ARTP誘變選育獲得，為進(jìn)一步提升發(fā)酵產(chǎn)量，對(duì)2株菌株采用原生質(zhì)體融合進(jìn)行多輪基因組重排，最終獲得了適合工業(yè)化生產(chǎn)的高產(chǎn)菌株，并應(yīng)用響應(yīng)面方法對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化，得到有利于高產(chǎn)菌株的配方，提高了他克莫司發(fā)酵產(chǎn)量，促進(jìn)了其工業(yè)化生產(chǎn)成本的降低。

1 材料與儀器

1.1 出發(fā)菌株

筑波鏈霉菌（Streptomyces tsukubaensis）FK18-1-56和FK18-1-106[13]，搖瓶發(fā)酵單位分別為1147和

1064 mg/L，其中FK18-1-56實(shí)驗(yàn)罐他克莫司發(fā)酵產(chǎn)量997 mg/L，本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基配方同參考文獻(xiàn)[12]。

再生培養(yǎng)基：固體培養(yǎng)基中加10.3%蔗糖。

緩沖液：蔗糖10.3%，葡萄糖0.1%，CaCl2·2H2O 0.37%，MgCl2·6H2O 0.2%，1 mol/LTris-HCl 0.03%，pH 7.6。

1.3 試驗(yàn)試劑和儀器

溶菌酶（上海生工生物技術(shù)有限公司，酶活力≥20000 U/mg）；UV8AC紫外誘變箱（上海捷鈦儀器設(shè)備有限公司）；e2695高效液相色譜儀（Waters有限公司）；恒溫水浴鍋（蘇州國(guó)華儀器有限公司）光學(xué)顯微鏡（奧林巴斯工業(yè)有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 基因組重排方法

2.1.1 原生質(zhì)體制備

將固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好的筑波鏈霉菌菌苔挖塊接種于含有1%甘氨酸的種子培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)24 h后取10 mL培養(yǎng)液用離心機(jī)3000 r/min離心10 min去掉上清，沉淀中加入10 mL P-buffer反復(fù)吹吸洗滌菌絲體，重復(fù)洗3次，最后用5 mL P-buffer重懸?；旌弦褐屑尤肴芫富靹?，恒溫水浴鍋中30 ℃水浴酶解，期間輕輕振蕩混勻并間隔一定時(shí)間取樣，顯微鏡鏡檢觀察原生質(zhì)體形成情況，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)記錄原生質(zhì)體形成數(shù)。酶解結(jié)束，用無(wú)菌脫脂棉過(guò)濾除去菌絲體，濾液離心機(jī)1500 r/min離心5 min，去掉上清后用10 mL P-buffer反復(fù)洗滌沉淀除去殘留的酶液，最后用5 mL P-buffer重懸后得到原生質(zhì)體溶液。

2.1.2 原生質(zhì)體UV處理

將原生質(zhì)體溶液置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，于紫外誘變箱（紫外功率36 W）分別照射10、20、30、40、60和80 s，梯度稀釋后涂布于再生培養(yǎng)基中。培養(yǎng)結(jié)束后，統(tǒng)計(jì)長(zhǎng)出的菌落數(shù)，以未經(jīng)處理的菌落數(shù)為對(duì)照，計(jì)算致死率。

致死率=[（未經(jīng)UV處理的單菌落數(shù)-UV照射處理后的菌落數(shù)）/未經(jīng)UV處理的單菌落數(shù)]×100%

2.1.3 原生質(zhì)體再生

制備的原生質(zhì)體溶液用P-buffer梯度稀釋后分別 涂布于再生培養(yǎng)基平板和固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)長(zhǎng)出的菌落數(shù)（分別記為A和B）。直接以未處理的出發(fā)菌液稀釋后培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)長(zhǎng)出的菌落數(shù)（C）。

原生質(zhì)體再生率（%）=（A-B）/（C-B）×100%。

2.1.4 原生質(zhì)體融合

將2株親本筑波鏈霉菌制備的原生質(zhì)體經(jīng)紫外處理后等體積混合，取1 mL混合溶液，低溫離心機(jī)3000 r/min離心10 min，去掉上清，沉淀中加入

1 mL P-buffer用移液器槍頭輕輕吹吸進(jìn)行混勻，再加入3 mL 40% PEG4000融合液，混合均勻后，30 ℃恒溫水浴進(jìn)行原生質(zhì)體融合，融合結(jié)束后立即加入3 mL P-buffer終止反應(yīng)，低溫離心機(jī)3000 r/min離心10 min，去掉上清，沉淀用P-buffer反復(fù)洗滌2次，最后用5 mL P-buffer重懸后稀釋涂布于再生培養(yǎng)基平皿上。

2.2 菌株篩選

參照文獻(xiàn)[12]方法挑取培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的單菌落傳至中管斜面培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)。將生長(zhǎng)好的斜面挖塊1.5 cm2接種于裝有40 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28 ℃，220 r/min震蕩培養(yǎng)24 h，然后以10%的接種量接入40 mL/250 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃，220 r/min震蕩培養(yǎng)7 d，檢測(cè)他克莫司產(chǎn)量。在搖瓶中進(jìn)行初篩和復(fù)試。

2.3 培養(yǎng)基優(yōu)化

2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

采用篩選出的高產(chǎn)菌株對(duì)發(fā)酵配方中的主要碳源和氮源進(jìn)行單因素分析，考察培養(yǎng)基中各因素糊精（6.0%、8.0%、10.0%）、葡萄糖（1.5%、2.0%、2.5%）、固體玉米漿（0.1%、0.2%、0.3%）、酵母粉（2.0%、2.5%、3.0%）不同含量對(duì)他克莫司發(fā)酵產(chǎn)量的影響。

2.3.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

對(duì)有顯著影響的3個(gè)單因素（糊精、酵母粉、葡萄糖）按照Design-Expert 12 Perfect軟件中的 Box-Behnken Design生成的試驗(yàn)設(shè)計(jì)表進(jìn)行試驗(yàn)。

3 結(jié)果與分析

3.1 基因組重排選育他克莫司高產(chǎn)菌株

3.1.1 原生質(zhì)體制備

放線菌的原生質(zhì)體制備一般選用溶菌酶，其通過(guò)破壞細(xì)胞壁使菌體溶解，不同種屬的放線菌所需的最適酶解濃度和反應(yīng)時(shí)間也不同。本實(shí)驗(yàn)分別選用1.5、2、2.5、3.5和5 g/L的濃度對(duì)筑波鏈霉菌進(jìn)行酶解30 min。由圖1可見(jiàn)，隨著酶解濃度的增加，原生質(zhì)體形成數(shù)也逐漸增加，而過(guò)高的酶濃度會(huì)影響原生質(zhì)體的再生，當(dāng)酶解濃度為3.5 g/L時(shí)，再生率達(dá)30.11%，再生菌落最多。當(dāng)酶濃度為3.5 g/L時(shí)，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞壁被破壞程度增加，釋放的原生質(zhì)體也不斷增多，但酶解達(dá)到一定時(shí)間后，殘存的溶菌酶又會(huì)影響原生質(zhì)體的再生率，如圖2。當(dāng)酶解40 min時(shí)，原生質(zhì)體再生數(shù)量最高。

3.1.2 原生質(zhì)體UV處理

原生質(zhì)體由于缺少細(xì)胞壁，對(duì)紫外照射的敏感度增加，更容易產(chǎn)生突變，因此選用紫外對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行誘變及親本的滅活處理。以未經(jīng)照射的再生菌落數(shù)為對(duì)照，計(jì)算原生質(zhì)體的死亡率。由圖2可見(jiàn)，隨著紫外處理時(shí)間的延長(zhǎng)，筑波鏈霉菌原生質(zhì)體死亡率逐漸增加，當(dāng)紫外照射時(shí)間超過(guò)40 s后死亡率接近100%。因此，筑波鏈霉菌原生質(zhì)體紫外處理最佳時(shí)間為40 s。

3.1.3 基因組重排篩選融合子

將2株筑波鏈霉菌FK18-1-56和FK18-1-106按照“2.1”方法進(jìn)行原生質(zhì)體的制備、滅活，獲得的原生質(zhì)體溶液等體積混合后進(jìn)行融合和再生，此過(guò)程作為第一輪基因組重排。對(duì)再生培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落，按照“2.2”方法進(jìn)行初篩和復(fù)試，第一輪篩選出他克莫司產(chǎn)量顯著提高的3株菌株，搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量分別達(dá)到1254、1286和1267 mg/L。以第一輪篩選出的3株菌為出發(fā)菌株，分別制備原生質(zhì)體經(jīng)紫外處理后等體積混合，再次進(jìn)行原生質(zhì)體融合和再生，進(jìn)行第二輪基因組重排。此過(guò)程重復(fù)進(jìn)行4次，最終獲得3株高產(chǎn)菌株FK22-35、FK22-71、FK22-89，由圖3可見(jiàn)，他克莫司搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量分別達(dá)到1543、1578、1589 mg/L，較出發(fā)菌株提高34.5%、37.6%和38.5%。

3.2 高產(chǎn)菌株性狀考察

3.2.1 高產(chǎn)菌株特征

對(duì)基因組重排最終獲得的高產(chǎn)菌株進(jìn)行菌落形態(tài)和顯微形態(tài)觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各菌株在固體培養(yǎng)基上菌落均為白色，產(chǎn)生灰白色的孢子，培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)基呈暗紅色，相差不大。由圖4可見(jiàn)，菌株FK22-71發(fā)酵培養(yǎng)基中顯微形態(tài)觀察菌絲基本都呈菌絲球狀，且菌絲球松散、橢圓狀，染色劑著色淺。筑波鏈霉菌經(jīng)遞推式基因組重排技術(shù)育種后，形狀發(fā)生了變化。

他克莫司是胞內(nèi)產(chǎn)物，發(fā)酵結(jié)束后需要有機(jī)溶劑對(duì)菌絲進(jìn)行浸泡處理。本研究采用無(wú)水乙醇對(duì)高產(chǎn)菌株FK22-71進(jìn)行浸泡處理，由圖5可見(jiàn)，菌株FK22-71在浸泡液中呈顆粒狀，沉降較好，在實(shí)際生產(chǎn)中有利于后續(xù)過(guò)濾操作。因此，選取高產(chǎn)菌株FK22-71進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.2.2 高產(chǎn)菌株穩(wěn)定性考察

菌株FK22-71進(jìn)行斜面?zhèn)鞔鷮?shí)驗(yàn)，連續(xù)傳代5次通過(guò)搖瓶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)他克莫司產(chǎn)量。由表1結(jié)果可見(jiàn)，以第一代斜面搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量為100%，第二代至第五代斜面發(fā)酵產(chǎn)量波動(dòng)范圍不超過(guò)5%，說(shuō)明菌株FK22-71傳代穩(wěn)定性良好，具備工業(yè)化生產(chǎn)穩(wěn)定傳代的能力，可以用于發(fā)酵生產(chǎn)。

3.3 發(fā)酵配方優(yōu)化

3.3.1 單因素分析

從現(xiàn)有配方中挑選主要碳源和氮源四個(gè)因素進(jìn)行單因素分析，分別設(shè)置低、中、高3個(gè)濃度，考察對(duì)他克莫司發(fā)酵的影響。由圖6結(jié)果可見(jiàn)，在不同濃度的固體玉米漿時(shí)，他克莫司搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量波動(dòng)范圍不超過(guò)10%，說(shuō)明固體玉米漿影響較小。而不同濃度的糊精、酵母粉、葡萄糖時(shí)，他克莫司發(fā)酵產(chǎn)量波動(dòng)范圍分別為33.4%、20.9%和18.9%。

3.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)菌株FK22-71發(fā)酵產(chǎn)量影響較大的糊精、酵母粉、葡萄糖進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察各因素之間的交互作用，按照軟件Design-Expert 12 Perfect 中的 Box-Behnken Design生成的試驗(yàn)設(shè)計(jì)表進(jìn)行試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)編碼水平和設(shè)計(jì)見(jiàn)表2～3。

經(jīng)軟件擬合，糊精、酵母粉和葡萄糖3個(gè)因素對(duì)他克莫司產(chǎn)量影響的方差分析方程如下：

他克莫司搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量=1145.4+21.25A-346.125B+126.125C+ 8.5A×B+292A×C-13.75B×C-275.075A?-386.825B?- 164.325C?。

如表4方差分析表中模型的F值為14.628，P＜0.05，說(shuō)明模型顯著，失擬項(xiàng)P=0.0672＞0.05，不顯著，說(shuō)明模型可靠。模型的決定系數(shù)R2=0.9493，校正決定系數(shù)R2Adj=0.8842，這表明模型可以解釋 94.93%響應(yīng)值的變化；模型測(cè)量信噪比Adeq Precision=9.6192＞4，表示信號(hào)充足，比較可信。

模型中一次項(xiàng)糊精P值不顯著，但二次項(xiàng)顯著，且糊精和葡萄糖的互作項(xiàng)P值顯著，說(shuō)明糊精和其他因素存在交互作用。由圖7可見(jiàn)，響應(yīng)曲面圖均是開(kāi)口向下的凸面，說(shuō)明響應(yīng)值發(fā)酵產(chǎn)量在各因素下存在最優(yōu)解；交叉項(xiàng)AC等高線圖呈橢圓形，說(shuō)明糊精和葡萄糖之間交互作用顯著，交叉項(xiàng)AB和BC等高線圖接近圓形，說(shuō)明糊精和葡萄糖、酵母粉和葡萄糖之間交互作用不明顯，等高線圖的趨勢(shì)與方差分析表中的P值結(jié)果一致。根據(jù)軟件預(yù)測(cè)優(yōu)化所得結(jié)果為：糊精89.2 g/L，酵母粉22.8 g/L，葡萄糖24.0 g/L，

最優(yōu)解的產(chǎn)量預(yù)測(cè)值為1281 mg/L。

3.4 優(yōu)化配方驗(yàn)證

高產(chǎn)菌株FK22-71采用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基配方，在50 L發(fā)酵罐進(jìn)行驗(yàn)證。將培養(yǎng)24 h后的種子液以5%的接種量接種至10 L種子培養(yǎng)基中，28 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速375 r/min，通氣比1：1 vvm，培養(yǎng)24 h后以10%的接種量接種至35 L發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵過(guò)程中開(kāi)攪拌、通氣比1：1.5 vvm通入無(wú)菌空氣，控制溶解氧≥25%，48 h開(kāi)始按照發(fā)酵液總體積0.3%的量流加前體異亮氨酸，7 d后檢測(cè)他克莫司產(chǎn)量，連續(xù)進(jìn)罐3批，平均放罐產(chǎn)量為1684 mg/L，較出發(fā)菌株提高68.9%，結(jié)果見(jiàn)表5。

4 結(jié)論

僅通過(guò)誘變育種的方法得到的突變菌株提高量有限，而基因組重排技術(shù)（genome shuffling，GS）可將誘變育種技術(shù)同細(xì)胞融合技術(shù)相互結(jié)合，以多個(gè)不同突變體為對(duì)象，對(duì)微生物細(xì)胞的基因組隨機(jī)重排，從而使微生物細(xì)胞正突變頻率及正突變速度均可以大幅提高，快速高效地選育出目的性狀正突變的菌株[8]。篩選融合子需要親本具有標(biāo)記或者進(jìn)行原生質(zhì)體滅活。本研究的出發(fā)菌株是經(jīng)ARTP誘變產(chǎn)生，ARTP等離子體束含有豐富的活性粒子，非常低的UV強(qiáng)度，因此采用紫外處理對(duì)親本進(jìn)行滅活。

本研究獲得的高產(chǎn)菌株FK22-71菌落形態(tài)較出發(fā)菌株變化不大，但液體培養(yǎng)形態(tài)和發(fā)酵液狀態(tài)均發(fā)生了變化。他克莫司是胞內(nèi)產(chǎn)物，發(fā)酵結(jié)束后菌絲經(jīng)浸泡，呈顆粒狀，易沉淀，使過(guò)濾工序更順暢，也可以減少雜蛋白的影響。菌株液體培養(yǎng)顯微形態(tài)發(fā)生變化，對(duì)培養(yǎng)基微環(huán)境的代謝利用也會(huì)隨之發(fā)生變化，因此，本研究對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，獲得了適合高產(chǎn)菌株的配方。該高產(chǎn)菌株采用優(yōu)化后的發(fā)酵配方在50 L實(shí)驗(yàn)罐進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)酵產(chǎn)量平均達(dá)

1684 mg/L，較出發(fā)菌株提高68.9%。這表明通過(guò)選育高產(chǎn)菌株、優(yōu)化發(fā)酵配方可以提高他克莫司產(chǎn)量，對(duì)工業(yè)化過(guò)程降低生產(chǎn)成本具有重要意義。

參 考 文 獻(xiàn)

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