蔣慶佳 徐楊 杜葉 劉日慧 劉濤 徐玉玲

摘要：目的 以黃芩苷和鹽酸小檗堿產(chǎn)生的自沉淀為研究對(duì)象，探究其理化性質(zhì)，對(duì)其抑菌作用及其機(jī)制展開研究，為中藥自沉淀現(xiàn)象產(chǎn)生的物質(zhì)深入研究提供參考。方法 采用差示熱量掃描法、紅外光譜掃描和紫外光譜掃描測(cè)定黃芩苷和鹽酸小檗堿的自沉淀理化性質(zhì)；采用牛津杯法探索黃芩苷、鹽酸小檗堿及自沉淀對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌的抑菌活性；采用二倍稀釋法進(jìn)一步研究黃芩苷、鹽酸小檗堿、自沉淀對(duì)大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC），并通過測(cè)定菌體的生長(zhǎng)曲線、胞外核酸相對(duì)含量、胞外可溶性蛋白質(zhì)含量和電導(dǎo)率研究黃芩苷、鹽酸小檗堿及自沉淀對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌的抗菌機(jī)制，分析對(duì)比黃芩苷、鹽酸小檗堿反應(yīng)前后抑菌作用機(jī)制是否發(fā)生改變。結(jié)果 差示熱量掃描法結(jié)果顯示鹽酸小檗堿與黃芩苷反應(yīng)前后存在熱量變化，該自沉淀是一種不同于鹽酸小檗堿、黃芩苷的新物質(zhì)或復(fù)合物，其官能團(tuán)、紫外吸收均發(fā)生了變化。鹽酸小檗堿對(duì)大腸埃希菌的MIC為0.9375 mg/mL，MBC為7.5 mg/mL；對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為0.9375 mg/mL，MBC為7.5 mg/mL。黃芩苷對(duì)大腸埃希菌的MIC為1.875 mg/mL，MBC為7.5 mg/mL；對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為3.75 mg/mL，MBC為15 mg/mL。自沉淀對(duì)大腸埃希菌的MIC為3.75 mg/mL，MBC為3.75 mg/mL；對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為3.75 mg/mL，MBC為3.75 mg/mL。3種物質(zhì)對(duì)大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌菌體生長(zhǎng)均有顯著的抑制效果，但作用機(jī)制有所差異。結(jié)論 3種物質(zhì)對(duì)大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌顯示出較好的抑菌活性，由強(qiáng)到弱為鹽酸小檗堿、黃芩苷、自沉淀，均通過對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜造成損傷改變其通透性，影響細(xì)菌生長(zhǎng)，從而起到抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的目的。三種物質(zhì)雖能使菌體內(nèi)容物大量滲出，但對(duì)胞內(nèi)物質(zhì)泄出作用存在差異，研究成果為進(jìn)一步探究中藥自沉淀提供參考。

關(guān)鍵詞：自沉淀；黃芩苷；鹽酸小檗堿；抑菌機(jī)制

中圖分類號(hào)：R961文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Study on the physicochemical properties and antibacterial mechanism of precipitation in baicalin and berberine hydrochloride

Abstract Objective The substances produced by traditional Chinese medicine through the self-precipitation phenomenon have special properties and development potential. This paper takes the precipitation produced by baicalin and berberine hydrochloride as the research object， explores its physical and chemical properties， and studies its antibacterial effect and mechanism. Methods The physical and chemical properties of the preipitation were determined by differential scanning calorimetry， infrared spectroscopy scanning， and ultraviolet spectroscopy scanning. The antibacterial activity of baicalin， berberine hydrochloride and precipitation against Escherichia coli and Staphylococcus aureus was studied by Oxford cup method. The minimum inhibitory concentration （MIC） and minimum bactericidal concentration （MBC） of baicalin， berberine hydrochloride and precipitation against Escherichia coli and Staphylococcus aureus were further studied by double dilution method， and the antibacterial mechanisms of baicalin， berberine hydrochloride and precipitation against Escherichia coli and Staphylococcus aureus were studied by measuring the growth curve of the bacterial body， the relative content of extracellular nucleic acid， the content of extracellular soluble protein and electrical conductivity. Then， the changes in antibacterial mechanisms of baicalin and berberine hydrochloride were analyzed and compared before and after the reaction. Results The results of differential scanning calorimetry showed that there was a heat change before and after the reaction of berberine hydrochloride with baicalin. The precipitation was a new substance different from berberine hydrochloride and baicalin， and its functional groups and UV absorption changed. Berberine hydrochloride， baicalin， and precipitation have different antibacterial activities and mechanisms. In general， berberine hydrochloride has the best antibacterial activity， followed by self precipitation， and baicalin is relatively weak. The MIC of berberine hydrochloride against Escherichia coli was 0.9375 mg/mL， and the MBC was 7.5 mg/mL; The MIC against Staphylococcus aureus was 0.9375 mg/mL， and the MBC was 7.5 mg/mL. The MIC of baicalin against Escherichia coli was 1.875 mg/mL， and the MBC was 7.5 mg/mL; The MIC against Staphylococcus aureus was 3.75 mg/mL， and the MBC was 15 mg/mL. The MIC and MBC of precipitation against Escherichia coli were 3.75 mg/mL and 3.75 mg/mL， respectively; The MIC against Staphylococcus aureus was 3.75 mg/mL， and the MBC was 3.75 mg/mL. The three substances had significant inhibitory effects on the growth of Escherichia coli and Staphylococcus aureus， but their mechanisms of action varied. Conclusion The three substances that showed good antibacterial activity against Escherichia coli and Staphylococcus aureus， from strong to weak， were berberine hydrochloride， baicalin， and precipitation. All of them changed their permeability by damaging the bacterial cell membrane， affecting bacterial growth， and thereby inhibiting bacterial growth. Although the three substances could cause a large amount of exudation from the bacterial body， there were differences in the release of intracellular substances. The research results provided a reference for further understanding the precipitation of traditional Chinese medicine.

Keywords Self precipitation; Baicalin; Berberine hydrochloride; Antibacterial mechanism

中藥自沉淀是指中藥飲片在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下（包括中醫(yī)治療原則、方劑的組成結(jié)構(gòu)、藥物的配伍規(guī)律以及服藥宜忌等）進(jìn)行配伍組方后，復(fù)方藥物經(jīng)水煎煮或其他溶媒提取之后，藥液中化學(xué)成分之間相互作用產(chǎn)生沉淀，被稱為“自沉淀”[1]。黃連解毒湯在水煮過程中常出現(xiàn)較明顯的中藥自沉淀現(xiàn)象，研究發(fā)現(xiàn)為黃連解毒湯中苷類成分黃芩苷（baicalin，BA）與生物堿類鹽酸小檗堿（berberine hydrochloride，BH）發(fā)生酸堿絡(luò)合生成水不溶性物質(zhì)沉出[2]。研究認(rèn)為鹽酸小檗堿與黃芩苷配伍產(chǎn)生的是一類自沉淀（BBP），且其采用一種相對(duì)較弱的結(jié)合，如氫鍵、分子間作用力等[3]。田學(xué)浩等[4]對(duì)黃連解毒湯采用等溫滴定量熱法了解析自沉淀形成過程中內(nèi)在的各種分子熱力學(xué)參數(shù)，確定了沉淀產(chǎn)生主要來源于BA與BH相作用的結(jié)果，并從化學(xué)層面更深層次地揭示中藥間相互作用的機(jī)制。目前已利用BA與BH成功模擬出黃芩-黃連合煎過程中出現(xiàn)的自沉淀。并且發(fā)現(xiàn)黃芩苷與鹽酸小檗堿自沉淀的產(chǎn)生受到了比例、加熱方法、pH、離子強(qiáng)度等多因素的影響。

BBP是由于BA與BH官能團(tuán)的結(jié)合，導(dǎo)致生成沉淀后的物質(zhì)油水分布系數(shù)發(fā)生了顯著的變化，對(duì)其口服后胃腸道吸收及藥物體內(nèi)的行為具有一定的影響，提示該物質(zhì)存在藥理價(jià)值[5]?，F(xiàn)有研究表示，該類由BH與BA作用生成的BBP具有抗炎、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞等廣泛的藥理活性[6-8]。而BH與BA都具有較好的抑菌活性，推測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物BBP可能具有較好的抑菌活性。目前研究?jī)H對(duì)BBP的抑菌活性進(jìn)行研究，其抑菌作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。本文對(duì)BBP的理化性質(zhì)進(jìn)行研究，并探究其對(duì)大腸埃希菌（Escherichia coli，EC）與金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）的抑菌活性，同時(shí)通過測(cè)定BBP對(duì)細(xì)菌核酸、胞外蛋白、電導(dǎo)率的影響，對(duì)其抑菌作用機(jī)制進(jìn)行闡述，為進(jìn)一步理解中藥自沉淀性質(zhì)及其藥理作用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

差示熱量掃描儀（梅特勒托利多科技中國(guó)有限公司），TU-1810型紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），Specterum Tow傅里葉變換紅外光譜儀（美國(guó)Perkin Elmer公司），DH3006A型電熱恒溫培養(yǎng)箱（西安禾普生物科技有限公司），ZQTY-70E振蕩培養(yǎng)箱（上海知楚儀器有限公司），TG20G型離心機(jī)（天津廣豐科技公司），XFS-280型手提式壓力蒸汽滅菌器（浙江新豐醫(yī)療器械有限公司），JJ-CJ-2FD型潔凈工作臺(tái)（蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司）其他儀器包括96孔一次性細(xì)胞培養(yǎng)板、移液槍、比濁管等。

1.2 材料

黃芩苷提取物（純度≥90%南京本草益康生物科技有限公司）；鹽酸小檗堿提取物（純度≥98%南京本草益康生物科技有限公司）；SA、EC菌株由成都大學(xué)附屬醫(yī)院提供；考馬斯亮藍(lán)G-250購(gòu)自成都市科隆化學(xué)品有限公司等。其他實(shí)驗(yàn)材料包括蛋白胨、瓊脂粉、氯化鈉、酵母浸出粉等。

2 方法與結(jié)果

2.1 BBP的制備

根據(jù)課題組前期研究結(jié)果，分別稱取BA和BH提取物，按一定比例投入沸水中，加熱攪拌使其充分反應(yīng)，至溫度冷卻至室溫后，濾過，分離出自沉淀后，加入過量甲醇充分洗滌，濾過，于60 ℃鼓風(fēng)干燥，研末，備用。

2.2 差示熱量掃描

稱取等量的BA與BH，混合均勻后做混合對(duì)照物。精密稱取BA、BH、BBP及混合對(duì)照物各20 mg，進(jìn)行掃描，條件為：10 ℃/min升溫速率從25 ℃升到100 ℃，結(jié)果如圖1。

BH在95 ℃附近出現(xiàn)較大的吸收峰，焓值約為-2.28 J/g，BA在100 ℃升溫過程中未出現(xiàn)熱吸收過程。混合物在89 ℃出現(xiàn)較大的吸收峰，焓值約為-8.027×10-2 J/g。而BBP在100 ℃升溫過程中未出現(xiàn)熱量變化，說明BBP不僅僅是BH與BA的簡(jiǎn)單物理混合，存在化學(xué)鍵的斷裂與生成，確定該BBP是一種不同于BH、BA的新物質(zhì)，且其在100 ℃內(nèi)無熱量變化，見圖1。

2.3 BBP紅外光譜特征

以烘干的KBr為空白，分別制備BH、BA、BBP及加熱煮沸冷卻后BH、BA的紅外測(cè)試樣品。取供試品粉末約1.0 mg，加干燥的溴化鉀粉末約100 mg置于瑪瑙乳缽中，研細(xì)，混合均勻，置壓片模具中，組合模具并于粉末壓片機(jī)上壓片1.5 min[7]，采用傅里葉變換紅外光譜儀測(cè)定，結(jié)果如圖2。

紅外光譜結(jié)果表明，BH vN-H 3500～3100 cm-1的特征吸收峰與BA vO-H3300～2500 cm-1特征吸收峰發(fā)生酸堿絡(luò)合反應(yīng)，而產(chǎn)生共軛效應(yīng)導(dǎo)致BBP在該波長(zhǎng)特征吸收峰產(chǎn)生變化。單獨(dú)加熱煮沸冷卻后的BH、BA紅外光譜掃描圖，并發(fā)現(xiàn)與未加熱煮沸的圖譜相比官能圖并未發(fā)生變化，因此可以說明BBP紅外光譜變化并不由于加熱等導(dǎo)致的降解。由紅外光譜結(jié)果可知，BBP是BA中的羥基與BH中的季胺鹽離子發(fā)生酸堿絡(luò)合反應(yīng)生成的。

2.4 BBP紫外-可見光譜

稱取BH、BA及BBP約0.0100 g溶于10 mL甲醇中，超聲溶解。加入適量甲醇稀釋樣液200倍后，以甲醇為參比液為基線，使用UVWin紫外軟件V6.0.0掃描光譜，波長(zhǎng)200～800，光譜帶寬2 nm，采樣間隔1 nm，快速掃描[9]，結(jié)果如圖3。

BBP紫外吸收最大波長(zhǎng)（λ=420 nm），相比于BA（λ=315 nm）與BH（λ=430 nm）的最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生偏移，BBP在200～800 nm間紫外吸收與BA、BH有顯著性差異（P<0.01）。

3 抑菌作用研究

3.1 樣品制備

精密稱取BH、BA及BBP適量，加入溶于二甲亞砜，超聲使溶解，配置成60 mg/mL的溶液。

3.2 菌株活化

將細(xì)菌分別接種在LB液體培養(yǎng)基中，以37 ℃、

120 r/min的條件下活化培養(yǎng)細(xì)菌12～24 h，制得菌懸液，用無菌水將菌懸液濃度稀釋至1×106～

1×107 CFU/mL，備用[10]。

3.3 牛津杯法

將配制好的固體培養(yǎng)基、純水、試管、培養(yǎng)皿等放入高壓滅菌鍋中滅菌1 h左右取出，將固體培養(yǎng)基分別倒入培養(yǎng)皿中冷卻待凝固后使用，用移液管分別移取菌懸液（EC、SA）1 mL，放置牛津杯，并向牛津杯中分別加入150 ?L BH、BA和BBP，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。

3.4 最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定

采用二倍稀釋法，設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、空白對(duì)照。進(jìn)行接種實(shí)驗(yàn)，置于37 ℃搖床培養(yǎng)24 h后取出觀察結(jié)果[10]。若小孔內(nèi)澄清即視為細(xì)菌生長(zhǎng)受到了抑制，澄清小孔中所對(duì)應(yīng)的最低藥物濃度為對(duì)該菌的最低抑菌濃度。每組設(shè)2個(gè)重復(fù)。目前中藥抗菌作用尚未有明確的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，參考劉忠義等[12]的研究：當(dāng)MIC>250 mg/mL為不敏感，MIC介于7.81～250 mg/mL為中敏，MIC≤7.81 mg/mL為高敏。

3.5 最小殺菌濃度（MBC）測(cè)定

上述96孔板中透明澄清液體接種于固體培養(yǎng)基中，經(jīng)37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。瓊脂平板上無菌落生長(zhǎng)則視為細(xì)菌100%被殺滅，對(duì)應(yīng)孔的藥物濃度值為其MBC值[10]。

3.6 抑菌機(jī)制研究

3.6.1 抑菌曲線的繪制

調(diào)整LB液體培養(yǎng)基中樣品質(zhì)量濃度為MIC和1/2MIC，然后分別接入含有1×106～107? CFU/mL菌懸液，在37 ℃、120 r/min條件下連續(xù)培養(yǎng)15 h，每隔1 h取樣測(cè)定A600，以不含樣品的空白培養(yǎng)基為對(duì)照，繪制細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線，每組設(shè)2個(gè)重復(fù)[10]。

3.6.2 胞外核酸相對(duì)量的測(cè)定

配制樣品溶液，使藥物質(zhì)量濃度為MIC和2 MIC，分別加入菌懸液，在37 ℃、120 r/min培養(yǎng)8 h，以空白培養(yǎng)基作對(duì)照，每隔1 h定時(shí)分別取樣，加入無菌水稀釋后4000 r/min離心10 min，取其上清液于260 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以 A260值表示核酸相對(duì)量，每組設(shè)2個(gè)重復(fù)[10]。

3.6.3 胞外可溶性蛋白的測(cè)定

配制樣品溶液，使藥物質(zhì)量濃度為MIC和2 MIC，分別加入菌懸液，在37 ℃、120 r/min培養(yǎng)8 h，以空白培養(yǎng)基作對(duì)照，每隔1 h定時(shí)取樣，用無菌水稀釋后4000 r/min離心10 min，取其上清液1 mL加入考馬斯亮藍(lán)試劑2 mL，靜置10 min，于595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以A595值表示胞外蛋白相對(duì)量，每組設(shè)2個(gè)重復(fù)[10]。

3.6.4 電導(dǎo)率測(cè)定

配制樣品溶液，使藥物質(zhì)量濃度為MIC，分別加入菌懸液，在37 ℃、120 r/min培養(yǎng)8 h，以空白培養(yǎng)基作對(duì)照，每隔1 h定時(shí)分別取樣，加入無菌水稀釋后4000 r/min離心2 min，取其上清液測(cè)定電導(dǎo)率，以電導(dǎo)率儀顯示值表示電導(dǎo)率，每組設(shè)2個(gè)重復(fù)[11]。

4 抑菌抑菌結(jié)果

4.1 牛津杯法

將已滅菌的牛津杯置于試驗(yàn)平板中，往杯中注入一定量的待測(cè)樣品，培養(yǎng)一段時(shí)間后觀察抑菌圈大小。由圖4結(jié)果顯示，BH、BA、BBP均具有一定的抑菌活性，且溶劑不存在抑菌活性。

4.2 MIC、MBC測(cè)定

采用二倍稀釋法測(cè)定了BH、BA、BBP對(duì)大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的抗菌活性，結(jié)果見圖5～6。所測(cè)各組中，陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照均顯示細(xì)菌長(zhǎng)勢(shì)良好，排除菌液和二甲基亞砜對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾，空白對(duì)照顯示無細(xì)菌生長(zhǎng)。圖5可見BH濃度≥0.9375 mg/mL，

BA濃度≥1.8375 mg/mL，BBP濃度≥3.75 mg/mL時(shí)的大腸埃希菌溶液澄清；圖6可見BH濃度≥0.9375 mg/mL，

BA濃度≥3.75 mg/mL，BBP濃度≥3.75 mg時(shí)的金黃色葡萄球菌溶液澄清。

BH、BA、BBP對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌的MIC、MBC結(jié)果如表1所示，均具有抑菌活性。結(jié)果顯示BH、BA、BBP對(duì)大腸埃希菌、金黃葡萄球菌均為高敏性，但活性存在一定的差異。相較于BH、BA，反應(yīng)后產(chǎn)生的BBP對(duì)大腸埃希菌的作用活性略微下降，但對(duì)菌的殺滅作用強(qiáng)于BA與BH。對(duì)于金黃色葡萄球菌，BBP的抑菌活性與BA作用強(qiáng)弱相同，且其最小殺菌作用增強(qiáng)。

4.3 BH、BA、BBP對(duì)大腸埃希菌的抑菌作用機(jī)制

4.3.1 對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的影響

BH、BA、BBP對(duì)大腸埃希菌生長(zhǎng)均有一定的抑制效果。當(dāng)溶液中藥液濃度為MIC時(shí)，培養(yǎng)液中細(xì)菌的生長(zhǎng)受到了明顯的減慢。并且隨著藥液濃度增加其抑制效果更加明顯，結(jié)果見圖7。

4.3.2 對(duì)細(xì)菌胞外核酸相對(duì)含量的影響

由圖8可知，當(dāng)BH、BA、BBP作用后，大腸埃希菌胞外核酸相對(duì)量增加，表明BA、BH、BBP能夠損傷細(xì)胞膜，影響細(xì)菌的正常生理活動(dòng)，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。作為細(xì)菌的保護(hù)屏障的細(xì)胞膜在藥液的作用下破裂，胞內(nèi)大分子物質(zhì)DNA、RNA等穿過細(xì)胞膜泄漏到培養(yǎng)液中，導(dǎo)致培養(yǎng)液在260 nm處的吸光度值增大。

4.3.3對(duì)細(xì)菌胞外蛋白相對(duì)含量的影響

由圖9可見，當(dāng)BBP作用于大腸埃希菌后，菌液中的蛋白質(zhì)含量顯著增加，且EC-MIC、EC-2MIC試驗(yàn)組培養(yǎng)液的蛋白濃度均顯著高于空白對(duì)照組。說明BBP可以改變細(xì)胞膜的通透性，可使胞內(nèi)的蛋白質(zhì)通過細(xì)胞膜泄漏到細(xì)胞外。但研究中發(fā)現(xiàn)BH、BA對(duì)大腸埃希菌胞外蛋白的滲出量并無明顯的量效關(guān)系，而BBP能夠使蛋白質(zhì)大量泄出，存在一定的量效關(guān)系。BBP對(duì)胞外蛋白的溶出是不同于BH、BA的作用機(jī)制。

4.3.4 對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液電導(dǎo)率的影響

當(dāng)細(xì)胞膜沒有受到損傷時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的帶電離子不能自由通過細(xì)胞膜[13]。當(dāng)細(xì)胞膜受到損傷，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的離子大量外流，從而菌液的電導(dǎo)率會(huì)升高。由圖10可知，BH、BBP藥液作用于細(xì)菌時(shí)，會(huì)損傷細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外流。而研究發(fā)現(xiàn)BA作用于細(xì)菌時(shí)，電解質(zhì)的變化并不明顯，說明BA通過損傷細(xì)胞膜抑制大腸埃希菌的生長(zhǎng)作用較微弱，主要通過其他的機(jī)制抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。

4.4 BH、BA、BBP對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用機(jī)制

4.4.1 對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的影響

當(dāng)溶液中BH、BA和BBP藥液濃度為MIC時(shí)，金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)具有明顯的抑制效果，并且隨著藥液濃度增加其抑制效果更加明顯，結(jié)果見圖11。

4.4.2 對(duì)細(xì)菌胞外核酸相對(duì)含量的影響

BH和BBP作用后，金黃色葡萄球菌胞外核酸相對(duì)量明顯高于對(duì)照組。任何對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性和穩(wěn)定性的輕微干擾都可能損害細(xì)菌細(xì)胞的正常代謝功能。結(jié)果表明，BA和BBP能夠作用于金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜，引起膜裂解，使胞內(nèi)核酸大量泄出，影響細(xì)菌活力。但其中BA對(duì)金黃色葡萄球菌胞外核酸相對(duì)含量的影響未隨著藥物質(zhì)量濃度的增大而增大，無明顯量效關(guān)系，見圖12。

4.4.3 對(duì)細(xì)菌胞外蛋白相對(duì)含量的影響

由圖13可見，當(dāng)BBP作用于金黃色葡萄球菌后，菌液中的蛋白質(zhì)含量顯著增加，說明BBP可以改變細(xì)胞膜的通透性，可使胞內(nèi)的蛋白質(zhì)通過細(xì)胞膜泄漏到細(xì)胞外。研究中發(fā)現(xiàn)BH、BA對(duì)金黃色葡萄球菌胞外蛋白的滲出量并無明顯的量效關(guān)系，BBP對(duì)胞外蛋白的溶出是不同于BH、BA的作用機(jī)制。

4.4.4 對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液電導(dǎo)率的影響

當(dāng)細(xì)胞膜受到損傷，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的離子大量外流，從而菌液的電導(dǎo)率會(huì)升高[13]。由圖14可知，BH、BBP藥液作用于細(xì)菌時(shí)，會(huì)損傷細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外流。而研究發(fā)現(xiàn)BA作用于細(xì)菌時(shí)，電解質(zhì)的變化同樣并不明顯，提示BA可能通過其他途徑抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。

5 討論

傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為，湯劑與沉淀物同服可以有效提高療效，提示自沉淀同樣具有藥理活性。目前就含黃芩苷與鹽酸小檗堿的中成藥研究發(fā)現(xiàn)，該類中成藥在制備過程中大部分都將自沉淀與藥渣一同過濾棄去，造成了一定的藥用成分的浪費(fèi)，而由于配伍反應(yīng)發(fā)生自沉淀，黃芩苷與鹽酸小檗堿的含量下降，甚至可能會(huì)導(dǎo)致中成藥療效的不穩(wěn)定，加大該類中成藥的質(zhì)量控制難度[14-15]。本研究通過紅外與紫外光譜分析了BA與BH絡(luò)合形成BBP的化學(xué)鍵合變化，提示其不飽和基團(tuán)的共軛關(guān)系發(fā)生變化。紅外結(jié)果也證實(shí)了黃芩苷與鹽酸小檗堿在煎煮過程中會(huì)發(fā)生新的鍵合，該種鍵合可能是季胺離子與羧酸離子之間的酸堿絡(luò)合作用，該反應(yīng)會(huì)使BA和BH的疏水部分面向水相，使得BBP水溶性大大降低，從而產(chǎn)生自沉淀。并以DSC探究BBP反應(yīng)前后的熱量吸收變化，表明該物質(zhì)部分理化性質(zhì)有異于兩者的物理混合物。BA與BH都是臨床常用的抗菌活性物質(zhì)，現(xiàn)有研究證明BBP同樣具有一定的抑菌活性，本研究通過對(duì)BA、BH和BBP的抑菌機(jī)制進(jìn)行研究，探究BBP的具體作用機(jī)制，同時(shí)發(fā)現(xiàn)BA、BH和BBP都能使菌體內(nèi)容物大量滲出，但胞內(nèi)物質(zhì)泄出存在差異，BBP能夠使胞外核酸滲出的同時(shí)細(xì)菌的胞外蛋白滲出量相比于BA、BH增加，其作用機(jī)制存在變化。

由于抗生素耐藥性的問題越來越嚴(yán)重，需要細(xì)菌能夠通過形成外排泵、耐藥質(zhì)粒、生物被膜等途徑抵抗外來藥物的干擾，并且該類外排泵、耐藥質(zhì)粒、生物膜還會(huì)在抗生素的刺激下不斷誘導(dǎo)進(jìn)化，增強(qiáng)其耐藥性[16-17]。中藥及其活性成分對(duì)耐藥菌具有抗菌活性，可增強(qiáng)耐藥菌的敏感性[18]。與抗生素聯(lián)用具有良好的抑菌活性，同時(shí)能夠減少所需的抗菌劑劑量和耐藥率[19-20]。但一些中藥的長(zhǎng)期使用，也可引起細(xì)菌耐藥性增加[21]。因此，在中藥中尋找新的抑菌活性物質(zhì)具有重要意義。通過對(duì)BBP的抑菌活性及其作用機(jī)制研究，為進(jìn)一步理解中藥自沉淀性質(zhì)及其藥理作用提供參考。中藥活性物質(zhì)能夠通過破壞細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的完整性；抑制蛋白質(zhì)核酸的合成及酶的活性等多種途徑抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)[22]。本文研究?jī)H對(duì)BBP對(duì)細(xì)胞膜的作用機(jī)制進(jìn)行研究闡述，其對(duì)細(xì)菌酶活性、蛋白質(zhì)核酸的合成是否存在影響還需要進(jìn)一步的研究。

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