徐本錦 侯竹如 劉玲 嚴(yán)榮榮 張金晶 杜淼 宣焱 李卓禧 范蕾

摘要：目的 基于蛋白質(zhì)組學(xué)，深入揭示1株引起食物中毒事件的腸炎沙門菌21A的分子特征，從而更好地防控食源性疾病的發(fā)生。方法 利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)腸炎沙門菌株21A進(jìn)行分析，使用TimsTOF Pro儀器在數(shù)據(jù)非依賴采集模式下采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，利用MSstats軟件完成肽段與蛋白的定量以及差異蛋白統(tǒng)計(jì)，并對(duì)差異表達(dá)蛋白的生物學(xué)功能進(jìn)行GO、KOG功能富集、KEGG通路富集分析與CAZY注釋、互作分析。結(jié)果 菌株21A中共鑒定出3183種蛋白質(zhì)，其中差異蛋白300種。GO分析表明，差異蛋白主要與催化、結(jié)合、細(xì)胞內(nèi)過程和代謝有關(guān)；KOG和KEGG分析顯示，差異蛋白主要富集在6種代謝通路中；CAZY分析發(fā)現(xiàn)，37.96%的蛋白質(zhì)為糖苷水解酶。結(jié)論 本研究揭示了腸炎沙門菌株21A的蛋白質(zhì)組學(xué)特征，該菌株在入侵和感染過程中采用多種生存策略，包括增強(qiáng)毒力因子表達(dá)，增加脂質(zhì)降解和誘導(dǎo)鐵獲取等。對(duì)代謝相關(guān)蛋白質(zhì)的深入分析，有助于深入了解該菌的傳播與感染機(jī)制，更好地防控食源性疾病的發(fā)生。

關(guān)鍵詞：腸炎沙門菌；蛋白質(zhì)組學(xué)；食物中毒；感染；代謝

中圖分類號(hào)：R378 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Quantitative proteomics analysis of a Salmonella enteritidis strain

causing food poisoning incident

Abstract Objective Based on proteomics， the study was used to reveal the molecular genetic characteristics of a Salmonella enteritidis 21A that caused a food poisoning event， so as to better prevent and control the occurrence of foodborne diseases and ensure human life. Methods The quantitative proteomics technology was used to analyze Salmonella enteritidis 21A， and the TimsTOF Pro instrument was used to collect mass spectrometry data in the data independent collection mode. The MSstats software was used to complete the quantitative analysis of peptides and proteins as well as the statistics of differential proteins， and the biological functions of the differentially expressed proteins were examined using the GO， KOG function enrichment， KEGG pathway enrichment analysis， CAZY annotation， and interaction analysis. Results The quantitative study of 21A revealed 3183 proteins， including 300 differential proteins. The GO database functional annotation indicated that differential proteins were primarily associated with catalytic processes， binding， intracellular processes， and metabolism， whereas the KOG and KEGG databases functional annotation demonstrated that difference proteins were mainly associated with six metabolic pathways. The CAZY database analyzed the carbohydrate-active enzymes in 21A， 37.96% of which were glycoside hydrolases. Conclusion This work characterized the proteins of S. enteritidis 21A， which used a number of survival tactics during the invasion and infection processes， including raising the production of virulence factors， promoting lipid breakdown， and driving iron acquisition. This in-depth examination of metabolism-related proteins may aid in the understanding of S. enteritidis invasion and infection mechanisms and better prevent and control the occurrence of foodborne illness.

Key words Salmonella enteritidis; Proteomics; Food poisoning; Infection; Metabolism

近年來，隨著物流行業(yè)的快速發(fā)展、食品生產(chǎn)工藝的更新?lián)Q代以及人們飲食習(xí)慣的改變，食源性疾病的發(fā)生呈上升趨勢(shì)，食源性病原微生物已成為影響食品安全的主要因素[1]。沙門菌作為全球最主要的食源性病原菌之一，嚴(yán)重危害人類生命健康和食品安全[2]。

腸炎沙門菌是一種宿主廣泛的人畜共患病病原體，在人類、動(dòng)物、植物，甚至環(huán)境中都可以定植和傳播[3]。腸炎沙門菌的感染始于腸腔，主要依賴于III型分泌系統(tǒng)（type Ⅲ secretion system， TTSS）實(shí)施對(duì)腸上皮細(xì)胞的侵襲。TTSS主要由沙門菌致病性島1（SPI-1）和致病性島2（SPI-2）編碼，SPI-1參與沙門菌入侵，進(jìn)入腸上皮細(xì)胞后利用SPI-2編碼的毒力因子在沙門菌液泡（Salmonella containing vacuole，SCV）中存活[4]。此外，細(xì)菌分泌的效應(yīng)蛋白可以攔截和修飾腸上皮細(xì)胞，從而逃避宿主先天免疫受體的監(jiān)測(cè)并建立起一個(gè)適宜生存的細(xì)胞內(nèi)生態(tài)位[5]。沙門菌的入侵和感染是一個(gè)復(fù)雜的過程，宿主細(xì)胞為沙門菌提供營(yíng)養(yǎng)，沙門菌消耗某些代謝物來維持自身生存，同時(shí)釋放廢物，產(chǎn)生脂多糖等刺激成分，并將許多毒力因子直接分泌到宿主細(xì)胞，從而擾亂宿主代謝網(wǎng)絡(luò)[6]。

蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的功能執(zhí)行者，蛋白質(zhì)組成、結(jié)構(gòu)、表達(dá)水平以及翻譯后修飾等信息不能簡(jiǎn)單地從基因組或轉(zhuǎn)錄本中讀取。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)是對(duì)基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的有力補(bǔ)充，對(duì)于了解生命活動(dòng)規(guī)律意義重大。基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為定量復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物提供了一種高通量方法，其定量蛋白質(zhì)的能力比傳統(tǒng)的基于免疫親和力的定量方法高出幾個(gè)數(shù)量級(jí)[7]。這些技術(shù)已被廣泛用于繪制細(xì)菌蛋白質(zhì)組和蛋白質(zhì)翻譯后修飾，有助于揭示細(xì)菌-宿主相互作用的分子機(jī)制，從而發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物[8]。同時(shí)，蛋白質(zhì)組學(xué)方法為檢測(cè)細(xì)菌細(xì)胞對(duì)抗生素?fù)p傷等攻擊性刺激的分子反應(yīng)的快速變化提供了機(jī)會(huì)，捕捉引起抗生素耐藥性發(fā)展的代謝途徑的變化。這些方法將提供更多關(guān)于細(xì)菌耐藥性機(jī)制和菌株在食品生產(chǎn)中的生命周期的信息[9]。蛋白組學(xué)在闡明細(xì)菌生活方式、開發(fā)食品安全生物標(biāo)志物和創(chuàng)新食品保護(hù)策略方面具有重要相關(guān)性。

本研究在蛋白質(zhì)組學(xué)水平揭示了臨床食物中毒患者來源的腸炎沙門菌的分子特征，分析沙門菌在宿主體內(nèi)存活和適應(yīng)的分子機(jī)制，研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明腸炎沙門菌的傳播途徑、感染和毒力機(jī)制奠定基礎(chǔ)，有助于更好地防控食源性和院內(nèi)感染性疾病的發(fā)生，助力我國(guó)醫(yī)藥衛(wèi)生和食品安全建設(shè)。

1 材料與方法

1.1 樣本選擇

從臨床食物中毒患者的糞便中分離到腸炎沙門菌株，編號(hào)21A，下文簡(jiǎn)稱21A，以沙門菌ATCC14028為對(duì)照菌株。將菌株21A以2%的比例接種至10 mL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、220 r/min活化培養(yǎng)12 h；再取2 mL活化的菌液轉(zhuǎn)接至100 mL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、220 r/min繼續(xù)培養(yǎng)12 h；6500 r/min離心5 min收集菌體后用滅菌去離子水清洗1次；加入5倍體積的甲醇，4 ℃靜置1 h滅活菌體；離心收集菌體，液氮速凍30 min后置-80 ℃保存，每個(gè)樣品平行收集3份。

1.2 蛋白樣品的提取和質(zhì)控

取適量樣品到1.5 mL離心管中；加入一顆5 mm磁珠和適量Lysis Buffer 3（8 mol/L Urea， 4% CHAPS， 50 mmol/L DTT， 0.5% pharmalyte），分別添加終濃度為1 mmol/L的PMSF，2 mmol/L的EDTA，渦旋振蕩后靜置5 min，然后添加終濃度為10 mmol/L的DTT溶液；用組織研磨儀震蕩2 min（50 Hz，120 s）；4 ℃、25，000 g離心20 min，取上清；加入終濃度為10 mmol/L的DTT，56 ℃水浴1 h；恢復(fù)至室溫后加入終濃度為55 mmol/L的IAM（碘代乙酰胺）暗室靜置45 min；加入4倍體積冷丙酮，-20 ℃靜置2 h；重復(fù)上一步2～3次，直至上清無色；4 ℃、25，000 g離心

20 min，棄上清液；往沉淀中加入適量Lysis Buffer 3，然后超聲處理使沉淀溶解；4 ℃、25，000 g離心

20 min，取上清，做蛋白濃度定量。使用Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒，將具有不同濃度的BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液和具有不同稀釋比例的測(cè)試樣品溶液添加到96孔板中。每個(gè)梯度重復(fù)3次。各孔加入180 μLG250染色溶液，在595 nm處測(cè)量吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的吸光度計(jì)算21A樣品的蛋白質(zhì)濃度。

每個(gè)樣取10 μg蛋白溶液加入適量loading buffer，混勻后95 ℃加熱5 min，25，000 g離心5 min，取上清點(diǎn)入12% SDS聚丙烯酰胺凝膠的點(diǎn)樣孔中，80 V恒壓電泳30 min后再120 V恒壓電泳120 min；電泳結(jié)束后，將膠放入快速染脫儀器中10 min后，取出膠圖掃描。

1.3 蛋白酶解及High pH RP（reversed-phase）分離

每個(gè)樣品取100 μg蛋白溶液；按蛋白：酶=40：1的比例加入Trypsin酶2.5 μg，37 ℃酶解4 h；酶解的肽段利用Strata X柱進(jìn)行除鹽，真空抽干。將所有樣本各取等量肽段進(jìn)行混合后，用流動(dòng)相A（5% ACN，pH9.8）稀釋并進(jìn)樣，采用島津LC-20AD液相系統(tǒng)，分離柱為Gemini C18柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）對(duì)樣品進(jìn)行液相分離。以1 mL/min的流速梯度洗脫：5%流動(dòng)相B（95% ACN，pH9.8）10 min，5%至35%流動(dòng)相B 40 min，35%至95%流動(dòng)相B 1 min，流動(dòng)相B持續(xù)

3 min，5%流動(dòng)相B平衡10 min。在214 nm波長(zhǎng)下監(jiān)測(cè)洗脫峰并每分鐘收集1個(gè)組分，結(jié)合色譜洗脫峰圖合并樣品得到10個(gè)組分，然后冷凍抽干。

1.4 DDA建庫(kù)和DIA定量檢測(cè)（Nano-LC-MS/MS）

將抽干的肽段樣品用流動(dòng)相A（100% H2O，0.1% FA）復(fù)溶，20，000 g離心10 min，然后取上清進(jìn)樣。通過Bruker公司的nanoElute進(jìn)行分離。樣品首先進(jìn)入trap柱富集并除鹽，隨后與自裝C18柱（75 μm內(nèi)徑，1.8 μm柱料粒徑，約25 cm柱長(zhǎng)）串聯(lián)，以300 nL/min流速通過如下有效梯度進(jìn)行分離：0 min，2%流動(dòng)相B（100% ACN，0.1% FA）；0～45 min，流動(dòng)相B從2%線性升至22%；45～50 min，流動(dòng)相B從25%升至35%；50～55 min，流動(dòng)相B從35%升至80%；55～60 min，80%流動(dòng)相B。納升液相分離末端直接連接質(zhì)譜儀并進(jìn)行DDA（Data Dependent Acquisition）建庫(kù)檢測(cè)和DIA（Data Independent Acquisition）質(zhì)譜檢測(cè)。

1.5 蛋白質(zhì)組學(xué)生物信息分析

DDA數(shù)據(jù)使用MaxQuant整合的Andromeda引擎完成鑒定，利用該結(jié)果建立譜圖庫(kù)。通過對(duì)DIA數(shù)據(jù)去卷積，結(jié)合DDA譜圖庫(kù)，得到肽段和蛋白的定性定量信息。使用MSstats包[10]對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)估，以Fold change>2和Pvalue<0.05兩個(gè)條件作為顯著性差異蛋白的篩選標(biāo)準(zhǔn)，并對(duì)差異蛋白的生物學(xué)功能進(jìn)行分析。使用GO[11]、KOG和KEGG[12]數(shù)據(jù)庫(kù)完成功能注釋。根據(jù)對(duì)差異蛋白的功能注釋，篩選與代謝有關(guān)的差異蛋白，使用STRING軟件用于預(yù)測(cè)潛在的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用[13]，使用cytoscape軟件繪制網(wǎng)絡(luò)互作圖。使用chiplot網(wǎng)站（https：//www.chiplot.online/）分析、繪制差異表達(dá)蛋白熱圖。最后，基于以上的蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果，構(gòu)建了一個(gè)腸炎沙門菌的入侵和感染模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品質(zhì)量控制與技術(shù)路線

收集菌體21A并提取總蛋白，SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示，膠圖完整，蛋白質(zhì)條帶豐富，樣品重復(fù)性好（圖1）。質(zhì)檢合格的蛋白質(zhì)樣品經(jīng)酶解得到肽段，并進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)和建庫(kù)檢測(cè)。基于高分辨率質(zhì)譜儀產(chǎn)生樣本數(shù)據(jù)，建立譜圖庫(kù)，使用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定蛋白，得到蛋白列表。最后，對(duì)這些鑒定到的蛋白進(jìn)行GO、COG和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的功能注釋，并基于定量結(jié)果，完成不同比較組間差異蛋白的查找，進(jìn)行差異富集蛋白的功能分析和差異蛋白的相互作用分析（圖2）。

2.2 蛋白質(zhì)鑒定及功能注釋

在該實(shí)驗(yàn)中共定量到37221個(gè)肽段和3604個(gè)蛋白，參考菌株平均鑒定出3214種蛋白質(zhì)，菌株21A平均鑒定出3183種蛋白質(zhì)。69.6%的蛋白質(zhì)覆蓋率不到30%，表明蛋白質(zhì)鑒定的可信度仍有待提高（圖3A）。在所鑒定到的蛋白質(zhì)中，含有獨(dú)特肽段的數(shù)目大多為1個(gè)（17.22%）或是大于11個(gè)（18.19%）（圖3B）。所鑒定蛋白質(zhì)的分子量大多在10～50 kDa的范圍內(nèi)（圖3C）。主成分分析表明，菌株21A和參考菌株的表達(dá)水平存在顯著差異（圖3D）。

將鑒定到的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行GO、KOG和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)功能注釋，共注釋到2879種蛋白質(zhì)（圖4A）。KOG注釋表明，蛋白質(zhì)參與運(yùn)輸代謝、翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生、能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換、翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA加工和修飾等，11.90%的蛋白質(zhì)參與氨基酸運(yùn)輸與代謝，8.64%參與翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生，8.58%參與能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換（圖4B）?；贕O功能注釋，生物過程分析表明，蛋白質(zhì)主要參與細(xì)胞內(nèi)過程（11.80%）和代謝過程（11.32%）；分子功能分析表明，蛋白質(zhì)主要參與催化（13.67%）和結(jié)合（10.81%）；細(xì)胞成分分析表明，這些蛋白主要定位于細(xì)胞內(nèi)（10.35%）和細(xì)胞膜（10.24%）上（圖4C）。KEGG通路注釋表明，蛋白質(zhì)共參與到細(xì)胞過程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、人類疾病、新陳代謝，以及生物體系統(tǒng)等6大類通路，其中代謝占據(jù)71.9%，主要的代謝途徑是碳水化合物代謝、氨基酸代謝、輔因子與維生素的代謝和能量代謝（圖4D）。

將鑒定到的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行碳水化合物活性酶（carbohydrate-active enzymes database，CAZY）數(shù)據(jù)庫(kù)功能注釋，共注釋到137個(gè)蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)共分為6個(gè)大類，即糖苷水解酶（glycoside hydrolases， GHs）、糖基轉(zhuǎn)移酶（glycosyl transferases， GTs）、多糖裂解酶（polysaccharide lyases， PLs）、糖類酯解酶（carbohydrate esterases， CEs）、輔助功能（auxiliary activities， AAs）以及與碳水化合物相關(guān)的modules（carbohydrate-binding modules， CBMs）（圖4E）。其中，37.96%的蛋白質(zhì)注釋為糖苷水解酶，是碳水化合物酶中最多的酶類；GTs次之，占33.58%。此外，共有5個(gè)蛋白質(zhì)有兩種功能，蛋白A4R40_06970、CysK、LFZ55_19225、MltD、PluTT01m_09850，既注釋到CBMs，也注釋到GHs。蛋白A4R40_06970、CysK、LFZ55_19225、PluTT01m_09850均被注釋為幾丁質(zhì)酶和溶菌酶，A4R40_06970和CysK屬于纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域家族V（cellulose-binding domain family V， CBD V），PluTT01m_09850屬于CBDⅡ。蛋白MltD，也稱為L(zhǎng)ysM結(jié)構(gòu)域，注釋為G型溶菌酶、肽聚糖裂解酶和幾丁質(zhì)酶。

2.3? ?差異蛋白的定量和功能注釋

以鼠傷寒沙門菌ATCC14028為對(duì)照，以Fold change>2和P<0.05兩個(gè)條件作為顯著性差異蛋白的篩選標(biāo)準(zhǔn)。在菌株21A的所有蛋白中鑒定出300個(gè)差異蛋白，其中119個(gè)顯著上調(diào)，181個(gè)顯著下調(diào)（圖5A）。將差異蛋白進(jìn)行GO數(shù)據(jù)庫(kù)功能注釋，共富集到3大類34小類，在結(jié)合（11.53%）、催化過程（13.32%）、細(xì)胞內(nèi)過程（13.52%）和代謝（14.51%）中富集的差異蛋白數(shù)量最多（圖5B）。KEGG富集顯示，菌株21A主要改變代謝活動(dòng)來參與入侵和感染機(jī)體，參與代謝活動(dòng)的共鑒定出44種蛋白質(zhì)，其中6種蛋白質(zhì)顯著上調(diào)，包括硫代酯酶YigI、亞硝酸鹽還原酶NirD、四亞硫酸還原酶TtrB、半胱氨酸脫硫酶SufS、胞苷酸激酶Cmk、脂多糖核心生物合成蛋白R(shí)faZ；38種蛋白質(zhì)顯著下調(diào)，主要參與氨基酸代謝、能量代謝、碳水化合物代謝、脂類代謝和核苷酸代謝（圖5C）。此外，還注釋到27種蛋白質(zhì)參與細(xì)胞過程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、人類疾病和生物體系統(tǒng)（表1）?；贙OG數(shù)據(jù)庫(kù)的功能注釋，每種蛋白質(zhì)參與不同的生物過程，差異蛋白主要參與氨基酸的代謝（圖5D）。從所有蛋白質(zhì)中篩選出90種差異蛋白，以構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖5E），表明不同通路的協(xié)調(diào)調(diào)控參與了腸炎沙門菌對(duì)機(jī)體的入侵和感染。這些蛋白質(zhì)主要聚類為代謝過程和氨基酸代謝、有機(jī)物質(zhì)代謝、硫代謝、乙醇胺代謝，其中氨基酸代謝和乙醇胺代謝的相關(guān)蛋白質(zhì)均為顯著下調(diào)蛋白。

2.4 代謝相關(guān)的差異表達(dá)蛋白

相當(dāng)數(shù)量的蛋白質(zhì)與代謝過程相關(guān)，包括碳水化合物代謝、氨基酸代謝、輔因子和維生素代謝、能量代謝、脂類代謝和核苷酸代謝（圖6）。多個(gè)蛋白質(zhì)可以參與不同的代謝過程，其中有一個(gè)蛋白質(zhì)A0A0D6H408參加4項(xiàng)代謝過程，碳水化合物代謝、氨基酸代謝、能量代謝和脂質(zhì)代謝；有4個(gè)蛋白參加3項(xiàng)代謝過程，蛋白A0A718PRP1（碳水化合物代謝、氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝），A0A0D6HNW0（氨基酸代謝、核苷酸代謝、能量代謝），A0A0F6B8V6（碳水化合物代謝、氨基酸代謝、輔助因子和維生素代謝），A0A4U8K550（氨基酸代謝、核苷酸代謝、輔助因子和維生素代謝）。這表明細(xì)菌代謝過程中不同蛋白質(zhì)之間相互協(xié)調(diào)，調(diào)節(jié)細(xì)菌的入侵和感染過程。并且在130個(gè)蛋白質(zhì)中，有85.38%的蛋白的log2Foldchange的值位于-2～2之間，表明在沙門菌感染人體的過程中，與代謝有關(guān)的蛋白表達(dá)差異較小。

2.5 差異蛋白的時(shí)間序列分析

根據(jù)蛋白的表達(dá)量信息，鑒定到的3604個(gè)蛋白可以聚類成與時(shí)間相關(guān)聯(lián)的蛋白簇，表達(dá)模式一致的蛋白會(huì)被聚到同一個(gè)簇，這些蛋白共分為9個(gè)聚類，隨著時(shí)間的變化，蛋白的表達(dá)量發(fā)生顯著變化（圖7）。在聚類1、5中，隨著時(shí)間的推移，蛋白表達(dá)量逐漸增加；聚類3、4、8中，蛋白表達(dá)量呈下降趨勢(shì)。

2.6 基于蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果的感染模型

為了更好地理解腸炎沙門菌在宿主機(jī)體內(nèi)的存活機(jī)制，本課題進(jìn)一步建立了基于蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果的生存策略（圖8）。沙門菌入侵機(jī)體后，通過SPI-1編碼的TTSS-1和侵襲因子Rck、PagN進(jìn)入宿主細(xì)胞。沙門菌還含有多種毒力因子，如SPI-2，鞭毛蛋白等，并且SPI-1的蛋白顯著上調(diào)伴隨著SPI-2的蛋白顯著下調(diào)。當(dāng)沙門菌進(jìn)入宿主細(xì)胞后，代謝過程的調(diào)節(jié)發(fā)生顯著變化，如氨基酸代謝，輔助因子和維生素的代謝，脂質(zhì)代謝等。此外，細(xì)胞內(nèi)沙門菌的其他蛋白質(zhì)組學(xué)特征包括Fe-S簇蛋白顯著上調(diào)，DNA復(fù)制和修復(fù)蛋白顯著下調(diào)。

3 討論

本研究前期從山西某三甲醫(yī)院的食物中毒患者中分離到1株腸炎沙門菌21A，為了解腸炎沙門菌如何入侵并感染機(jī)體，對(duì)其進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析。

人類感染腸炎沙門菌主要是通過糞口傳播，當(dāng)攝入被該菌污染的食物后，沙門菌通過人體消化系統(tǒng)發(fā)生了一系列復(fù)雜的耐酸反應(yīng)，在胃酸的強(qiáng)酸環(huán)境下定植下來[14]。進(jìn)入機(jī)體的沙門菌具有侵襲性，通過侵襲因子TTSS-1、Rck和PagN入侵宿主細(xì)胞[15]，

這3種侵襲機(jī)制在21A菌株中均存在。SPI-1編碼TTSS-1，其效應(yīng)子主要包括SptP、SipABCD、SopABDD2EE2和AvrA。21A注釋到了除AvrA以外的其他效應(yīng)子，這些效應(yīng)子通過參與宿主細(xì)胞骨架的重排、免疫細(xì)胞募集和宿主炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)來改變宿主細(xì)胞的環(huán)境，從而使沙門菌在宿主細(xì)胞內(nèi)存活[16]。其中，Sops蛋白有助于沙門菌入侵并導(dǎo)致炎癥和腹瀉[17]，這與先前21A患者的臨床表現(xiàn)一致，分離出21A菌株的患者因感染性腹瀉入院，并且經(jīng)檢查，C-反應(yīng)蛋白增加。在本研究中，與TTSS-1相關(guān)的蛋白無顯著變化，而Rck和PagN均顯著上調(diào)。不同于TTSS-1的入侵機(jī)制，Rck和PagN是兩種外膜蛋白，通過拉鏈機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)菌入侵，即Rck與宿主細(xì)胞膜上的表皮生長(zhǎng)因子受體相互作用，PagN與硫酸肝素蛋白聚糖相互作用，激活磷脂酰肌醇3-激酶和磷酸化酪氨酸蛋白，導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白聚合和胞膜重排，從而導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)化[18]。此外，Rck還可干擾主要的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)器，增加細(xì)胞周期S期的時(shí)間，從而阻礙宿主細(xì)胞的周期進(jìn)展，創(chuàng)造一個(gè)適宜的生態(tài)位，促進(jìn)細(xì)菌的入侵[19]。21A菌株中，顯著上調(diào)的Rck、PagN蛋白和TTSS-1效應(yīng)子相互作用，一起促進(jìn)沙門菌對(duì)人體宿主細(xì)胞的入侵。

除TTSS-1、Rck和PagN以外，沙門菌還含有多種毒力因子，參與沙門菌的傳播和感染。在本研究中，腸炎沙門菌的毒力蛋白發(fā)生顯著變化，與SPI有關(guān)的蛋白SpvABCR和SsaQ、菌毛蛋白FlgE、與脂多糖有關(guān)的蛋白MsbB和RfaZ顯著上調(diào)，菌毛蛋白FliZ、FliA、FliC、FlgN顯著下調(diào)。Spv是位于質(zhì)粒上的一段高度保守的序列，SpvB可干擾巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞中的自噬和鐵穩(wěn)態(tài)，也可以破壞腸道上皮細(xì)胞的完整性，增加腸道的通透性，實(shí)現(xiàn)沙門菌的易位[20-21]。SpvC是磷酸蘇氨酸裂解酶，可以通過β消除使雙磷酸化的絲裂原活化蛋白激酶失活而抑制腸道炎癥，也可以抑制NLRP3和NLRC4而抑制宿主細(xì)胞的焦亡，促進(jìn)機(jī)體內(nèi)的細(xì)菌傳播。SPI-2是沙門菌在上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)感染和復(fù)制的重要蛋白，21A中注釋到其6個(gè)效應(yīng)蛋白SifA，SopD2，PipB2，SteA，SseJ和SseF，它們操縱宿主細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸并建立細(xì)菌的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制生態(tài)位[22]。效應(yīng)蛋白SopD2，SteA，SseJ和SseF無明顯變化，SifA和PipB2顯著下調(diào)，這些蛋白質(zhì)的表達(dá)水平?jīng)Q定了沙門菌感染的后果，可能在致病的組織特異性方面至關(guān)重要。菌毛蛋白除FlgE以外均顯著下調(diào)，這與之前的研究菌毛過表達(dá)會(huì)減弱沙門菌的發(fā)病機(jī)制相一致[23]。

在人體的腸道內(nèi)，分布著多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如氨基酸、脂類、碳水化合物等，入侵的沙門菌在機(jī)體內(nèi)增殖需利用這些營(yíng)養(yǎng)素以獲取能量和合成新的生物成分，沙門菌與宿主細(xì)胞相互作用，從而形成了復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)[24]。21A中差異激活的途徑主要包括氨基酸代謝、碳水化合物代謝、輔因子和維生素代謝和脂類代謝等。本研究與色氨酸（TrpC）、精氨酸（ArcA、ArcB、ArcC）、鳥氨酸（ArgI）、天冬酰胺（AsnA）、谷氨酰胺（GlmS）、脯氨酸（PutA）和天冬氨酸（PyrB、PyrI）等氨基酸合成與代謝有關(guān)的蛋白均顯著下調(diào)。據(jù)之前的研究報(bào)道，對(duì)腹瀉感染患者的腸道微生物進(jìn)行代謝組分析，L-組氨酸生物合成和降解途徑以及L-鳥氨酸生物合成途徑的水平降低，從而調(diào)節(jié)細(xì)菌的致病性，但是具體的機(jī)制仍待進(jìn)一步研究[25]。經(jīng)碳水化合物酶分析，21A中主要含有糖苷水解酶，其中幾丁質(zhì)酶占據(jù)重要作用，它們屬于GH18和GH19，促進(jìn)沙門菌的體內(nèi)入侵、存活和發(fā)病[26]。這些蛋白在差異分析中無顯著變化。本研究中與脂質(zhì)β氧化途徑有關(guān)的蛋白FadAB、YdiR顯著上調(diào)。β氧化途徑是脂質(zhì)的主要降解途徑，在葡萄糖受限和氨基酸豐富的情況下，脂類代謝是沙門菌在促炎巨噬細(xì)胞中的重要代謝途徑，并且脂質(zhì)降解基因是沙門菌定植組織所必須的[27]。為更全面地探究細(xì)菌脂膜的適應(yīng)機(jī)制，需聯(lián)合運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)以及脂質(zhì)組學(xué)，以鑒定、表征和量化脂質(zhì)和蛋白，從而闡明特定應(yīng)激與單個(gè)脂質(zhì)和特定脂代謝酶改變之間的關(guān)系[28]。

沙門菌中有一種蛋白質(zhì)細(xì)胞器為細(xì)菌微腔（bacterial microcompartments，MCPs），它由包裹在選擇性滲透蛋白質(zhì)外殼上的代謝酶組成。MCP代謝與腸道系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，沙門菌中主要有2種分解代謝的MCPs，即Pdu和Eut MCP[29]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)了Pdu和Eut MCP，它們均顯著下調(diào)，功能注釋顯示分別參與1，2-丙二醇和乙醇胺的代謝。據(jù)之前的報(bào)道，腸炎沙門菌中一般同時(shí)存在Pdu和Eut MCP，在本研究中也證明了一點(diǎn)。這兩種MCP具有高度相似的外殼，Pdu MCP通過控制1，2-丙二醇的代謝，增加沙門菌在哺乳動(dòng)物胃腸道的定植，這是沙門菌感染發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵階段[30]。Eut MCP蛋白聯(lián)合作用分解代謝乙醇胺，在有氧條件下，乙醇胺是提供沙門菌生存所需碳、能量和氮的唯一來源[31]。根據(jù)對(duì)腸道內(nèi)的沙門菌的研究，1，2-丙二醇可以誘導(dǎo)pdu操縱子，阻遏eut操縱子，從而防止了兩種系統(tǒng)的有害混合[32]。MCPs對(duì)特定碳底物的代謝使致病菌在宿主環(huán)境中具有選擇優(yōu)勢(shì)，并以影響人類健康的方式影響人體腸道生態(tài)。此外，由于腸炎沙門菌感染引起的炎癥，腸道中發(fā)生一系列化學(xué)反應(yīng)支持乙醇胺和丙二醇的厭氧呼吸，從而為沙門菌的生長(zhǎng)提供了便利，促進(jìn)沙門菌的傳播[29]。

此外，21A中SUF蛋白SufABCDES的表達(dá)全部顯著上調(diào)，SUF蛋白是Fe-S簇組裝系統(tǒng)的一種。沙門菌侵染宿主細(xì)胞后，細(xì)胞鐵流出增加，細(xì)胞質(zhì)中不穩(wěn)定鐵和巨噬細(xì)胞內(nèi)鐵蛋白的儲(chǔ)存大大減少，造成鐵限制的宿主環(huán)境，SUF蛋白可以幫助沙門菌來獲取鐵去維持沙門菌的生產(chǎn)[33]。過表達(dá)的SUF蛋白幫助沙門菌應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激，并幫助沙門菌在巨噬細(xì)胞中存活[34]。

4 結(jié)論

本研究從食物中毒患者的糞便中篩選分離出腸炎沙門菌，對(duì)其中的21A菌株進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，了解其蛋白質(zhì)功能特征。經(jīng)GO、KOG、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)蛋白質(zhì)組進(jìn)行功能注釋，顯示與代謝有關(guān)的蛋白發(fā)生顯著變化。腸炎沙門菌通過TTSS-1、Rck和PagN等3種入侵機(jī)制侵襲宿主細(xì)胞，在感染機(jī)體過程中采用了多種生存策略，包括增強(qiáng)毒力因子表達(dá)，增加脂質(zhì)降解，誘導(dǎo)鐵獲取等。新陳代謝對(duì)于病原微生物的毒力至關(guān)重要，本研究在蛋白質(zhì)組學(xué)水平上為腸炎沙門菌的入侵和感染機(jī)制提供了新的見解，有助于快速檢測(cè)試劑、疫苗和新型抗感染藥物的研發(fā)。

參 考 文 獻(xiàn)

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