鄭榮春 南志標(biāo) 段廷玉

摘要：‘岷山紅三葉（Trifolium pratense cv.Minshan）是適宜于岷縣地區(qū)生長的優(yōu)良豆科牧草品種。前期的調(diào)研發(fā)現(xiàn)該地區(qū)紅三葉田間病害發(fā)病較重，限制了紅三葉的生產(chǎn)，而目前尚缺少該地區(qū)病害的系統(tǒng)研究。本研究調(diào)查了‘岷山紅三葉在岷縣田間的主要病害及發(fā)生規(guī)律，并研究了匍柄霉葉斑病對紅三葉生長和品質(zhì)的影響。該地區(qū)紅三葉主要田間病害為匍柄霉葉斑?。⊿temphylium sarcniforme）、小光殼葉斑病（Leptosphaerulina trifolii）和長隔孢葉斑?。↙ongiseptatispora meliloti）。其中紅三葉匍柄霉葉斑病最為嚴(yán)重，最高發(fā)病率26.67%，病情指數(shù)8.20。匍柄霉葉斑病顯著影響了紅三葉的產(chǎn)量和品質(zhì)，導(dǎo)致鮮重顯著下降20.14%、葉綠素含量顯著下降20.93%及引起各項(xiàng)營養(yǎng)指標(biāo)的不同變化。本研究明確了岷縣地區(qū)紅三葉主要病害的發(fā)生情況及發(fā)病最為嚴(yán)重的匍柄霉葉斑病對紅三葉生物量和品質(zhì)的影響，為該地區(qū)的紅三葉病害防控提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：‘岷山紅三葉；田間病害；致病性；生長指標(biāo)；牧草品質(zhì)

中圖分類號：S432.4+4??? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A???? 文章編號：1007-0435（2024）05-1303-11

Diseases of Red Clover and Their Effects on the Growth and Quality of

Red Clover in Min County，Gansu Province

ZHENG Rong-chun， NAN Zhi-biao， DUAN Ting-yu*

（State Key Laboratory of Herbage Improvement and Grassland Agro-ecosystems， College of Pastoral Agriculture

Science and Technology， Lanzhou University， Lanzhou， Gansu Province 730020， China）

Abstract：Trifolium pratense cv. Minshan，an excellent legume forage，is suitable for growing in Min County，Gansu Province. Previous investigations have found that red clover suffered serious yield losses due to field diseases. However，systematic studies on the effects of diseases on performance of the plant remained unclear. This study aimed to investigate the major diseases and their occurrence patterns in the fields. Additionally，the study examined the impact of Stemphylium leaf spot disease on the growth and quality of red clover. The main field diseases were Stemphylium leaf spot，Leptosphaerulina leaf spot，and Longiseptatispora leaf spot，caused by Stemphylium sarcniforme，Leptosphaerulina trifolii，and Longiseptatispora meliloti，respectively. Among them，Stemphylium leaf spot had the highest severity，with a peak incidence rate of 26.67% and a disease severity index of 8.20 and caused a 20.14% reduction in fresh weight，a 20.93% decrease in chlorophyll content，and various changes in nutritional indicators. Stemphylium leaf spot had a significant impact on the growth and quality of red clover. This study provided a clear understanding of major diseases occurring in red clover fields in Min County，particularly the impact of Stemphylium leaf spot on the growth and quality. The findings provided valuable insights for disease prevention and control of red clover cultivation in this region.

Key words：Trifolium pratense cv. Minshan;Filed disease;Pathogenicity;Growth indexes;Pasture quality

紅車軸草（T. pratense）又名紅三葉，為豆科（Leguminosae）車軸草屬（Trifolium）多年生草本植物，是世界上栽培最早和最重要的牧草之一［1］。紅三葉莖葉柔軟，蛋白質(zhì)含量高，適口性好，家畜喜食用，用作青刈、曬制干草均可，同時(shí)也是很好的放牧型牧草［2］。紅三葉具有容易建植、生長迅速、固氮及改良土壤等特性，因此也是重要的果園及農(nóng)田綠肥植物［3］。

病害是限制紅三葉生產(chǎn)的重要因素，截至2022年，世界范圍內(nèi)共報(bào)道紅三葉病害55種，由109種真菌病原引致（基于中國知網(wǎng)、Web of Science和Fungal Databases數(shù)據(jù)庫）。其中危害最為嚴(yán)重的有白粉菌屬（Erysiphe）病原菌引致的白粉病、鐮孢菌屬（Fusarium）病原菌引致的根腐病及核盤菌屬（Sclerotinia）病原菌引致的菌核腐爛病等。白粉病發(fā)生嚴(yán)重時(shí)，紅三葉植株生長遲緩、產(chǎn)量降低、種子產(chǎn)量下降或不實(shí)、粗蛋白含量下降、適口性降低、牲畜避食［3］。1984—1985年，由于根腐病為害，貴州牧草種籽繁殖場約10 ha紅三葉僅收50 kg種籽，損失80%以上［4］。菌核病一旦發(fā)生，氣候適宜的情況下能夠造成田間植物成片死亡，其災(zāi)害是毀滅性的［5］。由三葉草核盤菌引起的冠腐和莖腐病，是美國東部、中北部地區(qū)以及歐洲豆科牧草最具破壞性的病害之一。對三葉草而言，該病原菌主要破壞夏末或初秋建植的幼苗，在合適的條件下，幼苗可以被完全摧毀［6］。報(bào)道的紅三葉病害種類多樣，分布廣泛且危害嚴(yán)重，但缺乏深入研究。

‘岷山紅三葉1943年從美國引進(jìn)，1975—1985年由甘肅省草原隊(duì)（現(xiàn)甘肅省草原技術(shù)推廣總站）在岷山種畜場選育成功。1987年經(jīng)全國飼料牧草品種審定委員會(huì)審定登記注冊為地方優(yōu)良牧草新品種，在當(dāng)?shù)匾延?0多年的栽培歷史，是定西南部高寒陰濕地區(qū)最適宜種植的優(yōu)良牧草品種［7-8］。蘭州大學(xué)草地保護(hù)研究所團(tuán)隊(duì)前期在甘肅岷縣的調(diào)研表明，‘岷山紅三葉病害時(shí)有發(fā)生，在生長后期種子田中植株發(fā)病率目測高達(dá)90%以上，嚴(yán)重影響其生產(chǎn)，而目前尚缺乏該品種病害的研究。了解病害發(fā)生的情況與規(guī)律是防治病害的必要條件，是實(shí)施科學(xué)有效的防控的重要依據(jù)。因此，研究明確該地紅三葉的病害及種帶真菌，厘清主要病害病原及病害發(fā)生規(guī)律和危害，對岷山紅三葉的種植、推廣及畜牧業(yè)生產(chǎn)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 研究材料試驗(yàn)地概況及樣地設(shè)立

岷縣位于甘肅省定西市（北緯34°26′22″，東經(jīng)104°02′13″），海拔2 400 m，氣候?qū)儆跍貛О霛駶櫹蚋吆疂駶櫄夂蜻^渡帶，高寒陰濕，植被覆蓋很好，年平均氣溫為5.5℃，最熱7月份平均氣溫16℃，最冷1月份平均氣溫—6.9℃；年降水量為635 mm，雨水集中在7—9月；平均相對濕度68%。

供試紅三葉種植田共三塊，分別位于岷縣寺溝鎮(zhèn)立珠村、立林村和奔直寺岷山種畜場等三個(gè)獨(dú)立區(qū)域，具體情況如表1。

1.2 研究方法

1.2.1 病害調(diào)查 2021—2022年于定西市岷縣連續(xù)兩年實(shí)地調(diào)查紅三葉生長季的病害發(fā)病情況并采集樣本，方法參考任繼周主編的《草業(yè)科學(xué)研究方法》第十一章［9］。

每個(gè)地點(diǎn)分別調(diào)查數(shù)個(gè)區(qū)域。采用5點(diǎn)取樣法，選取5個(gè)小區(qū)（1 m×1 m），調(diào)查病害發(fā)生情況。調(diào)查時(shí)，每小區(qū)紅三葉隨機(jī)取50個(gè)葉片調(diào)查發(fā)病率，記錄嚴(yán)重度，每個(gè)區(qū)域每次調(diào)查250張葉片。調(diào)查過程中，拍照記錄患病植株的發(fā)病部位與病癥，并將采集到的植株標(biāo)本放入標(biāo)本夾或紙袋中保存待用，同時(shí)仔細(xì)記錄該植株的采集時(shí)間、地點(diǎn)等信息。

根據(jù)紅三葉病斑所占葉片面積的百分比進(jìn)行嚴(yán)重度分級，分別記錄各級別下的葉片數(shù)，分級標(biāo)準(zhǔn)如下：

0級：無?。?/p>

1級：病斑面積占葉面積的0.1%～20%；

2級：病斑面積占葉面積的20.1%～40%；

3級：病斑面積占葉面積的40.1%～60%；

4級：病斑面積占葉面積的60.1%～80%；

5級：病斑面積占葉面積的80.1%～100%。

計(jì)算發(fā)病率（I）、病情指數(shù)（DI）：

發(fā)病率I（%）＝病葉數(shù)/調(diào)查總?cè)~片數(shù)×100

病情指數(shù)DI=100×∑（各級病葉數(shù)×各級代表值）/調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級代表值

1.2.2 病原菌的分離鑒定 按照常規(guī)組織分離法分離病原菌［10］。取病健交界處切成小塊，置于75%酒精中30 s，然后置于1%NaClO中2 min，再用無菌水沖洗3～5次。將植物組織置于馬鈴薯瓊脂（PDA）培養(yǎng)基平板上，放在25℃恒溫培養(yǎng)箱（SANYO MIR-254）中黑暗培養(yǎng)3～4 d，再從菌落邊緣挑取菌絲進(jìn)行純化獲得純培養(yǎng)，于4℃冰箱中保存。將病原菌接種于PDA培養(yǎng)基25℃黑暗培養(yǎng)14～28 d后，記錄菌落的形態(tài)特征，包括菌落的正、反面顏色和邊緣形態(tài)。用光學(xué)顯微鏡（Carl Zeiss）觀察分生孢子、分生孢子梗特征，使用熒光生物-體視顯微鏡（奧林巴斯BX51 SZX12）拍照并測定分生孢子的大?。?0個(gè)）。

刮取PDA平板上的菌絲置于研缽中，加入液氮迅速研磨，再利用真菌基因組DNA提取試劑盒（上海生工生物工程公司）提取病原菌DNA，經(jīng)凝膠電泳檢測后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用ITS1/ITS4［11］和GDP1/GDP2［12］等引物對相應(yīng)的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物送往上海生工生物工程技術(shù)有服務(wù)限公司測序。將測得的序列在NCBI進(jìn)行BLAST比對，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，確定病原菌的屬種。

根據(jù)真菌形態(tài)學(xué)特征與分子生物學(xué)鑒定結(jié)果進(jìn)行綜合鑒定。

1.2.3 溫室致病性測定 試驗(yàn)于蘭州大學(xué)榆中校區(qū)智能溫室進(jìn)行。供試品種為‘岷山紅三葉，2020年秋季收獲于岷縣田間。選取健壯完整的種子，經(jīng)75%酒精浸泡30 s、1% NaClO消毒10 min后，用無菌蒸餾水洗滌5次，放置于鋪有兩層滅菌濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，濾紙用無菌水潤濕，置于溫度25℃、濕度65%的植物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d，每日加水保濕。盆栽沙土比2∶1，混合過篩剔除雜物后平鋪于瓷盤上，將瓷盤置于烘箱中169℃滅菌2 h，待降溫后裝盆（直徑15 cm）播種，每盆10粒種子，出苗后定植3株。

病原菌接種采用噴霧接種法。向培養(yǎng)皿中添加10 mL無菌水，充分?jǐn)嚢柽^濾以收集分生孢子。利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將孢子懸浮液濃度調(diào)整至1×106個(gè)·mL-1，重復(fù)計(jì)數(shù)3次。收集20 mL孢子懸浮液并添加0.02% Tween 80溶液以提高粘附能力，將孢子懸浮液均勻噴灑在紅三葉葉片上。不產(chǎn)孢的病原菌則接種菌絲懸浮液，同樣采用噴霧接種［14］。每種病原菌處理5個(gè)重復(fù)，將接種20 mL無菌水的植株作為對照。發(fā)病后每3 d調(diào)查統(tǒng)計(jì)發(fā)病率、嚴(yán)重度。對發(fā)病的部位進(jìn)行病原菌的再分離純化。

1.2.4 病害損失評定 接種21 d后收獲，測量三葉草植株的株高、分枝數(shù)、干鮮重及粗蛋白、粗脂肪、粗灰分、氨基酸含量等營養(yǎng)指標(biāo)。

株高：使用卷尺測量植株株高。

分枝數(shù)：計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)植株分枝數(shù)。

干鮮重：將盆栽內(nèi)的紅三葉植株齊地面剪下，測其鮮重后在103℃干燥箱內(nèi)殺青30 min，后在70℃干燥箱烘7～8 h，稱量干重。

牧草品質(zhì)：將烘干后的紅三葉地上部粉碎，自封袋分裝。樣品處理好后送往武漢多米諾生物科技有限公司測定。具體指標(biāo)及測定方法如下：

葉綠素、綠原酸：使用比色法測量葉綠素和綠原酸含量［15］。

粗蛋白：使用凱式定氮法測定樣本含氮量并計(jì)算粗蛋白含量［16］。

粗纖維：采用范式洗滌法測定粗纖維含量［17］。

粗脂肪：采用索氏抽提法測定脂肪含量［18］。

粗灰分：用干灰化法測量粗灰分含量［19］。

可溶性蛋白：采用考馬斯亮藍(lán)比色法測定可溶性蛋白含量［15］。

可溶性糖：采用硫酸蒽酮法測定可溶性總糖含量［15］。

氨基酸：采用高效液相色譜儀串聯(lián)質(zhì)譜儀測定氨基酸含量［20］。

礦質(zhì)元素：采用ICP-AES/OES/MS測定多元素含量［21］。

1.3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

使用MEGA 11.0軟件進(jìn)行序列分析，采用鄰近-連接法（the Neighbor-Joining method）構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹獲得，檢驗(yàn)系統(tǒng)樹的可靠性用Bootstrap法，經(jīng)1 000次循環(huán)。數(shù)據(jù)使用Excel專業(yè)增強(qiáng)版2016進(jìn)行錄入處理，利用IBM SPSS Statistics 25軟件對所測得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Duncan法進(jìn)行事后比較，使用GraphPad Prism 9.0進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離及鑒定

2.1.1 匍柄霉葉斑病 該病主要為害葉片，初為小褐點(diǎn)，后逐漸擴(kuò)大為近圓形或不規(guī)則形褐斑，稍凹陷，中部色較淡，有時(shí)呈現(xiàn)輪紋狀。受害嚴(yán)重時(shí)葉片干枯（圖1A-C）。在PDA平板上，病原菌的菌落直徑大于60 mm，展開呈絨毛狀，菌落下層與背面呈灰黑色，表層覆蓋有一層棕灰色霉層（圖1D-E）。分生孢子梗常簇生，長達(dá)80～82 μm，粗4～8 μm，具隔，圍繞各環(huán)痕膨大部分各有一條暗色帶（圖1F）。分生孢子近圓形，褐色具縱橫隔膜，（18～28） μm×（19～32） μm，與他人對束狀匍柄霉的形態(tài)特征描述相同［22-23］。使用引物擴(kuò)增內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）和甘油-3-磷酸脫氫酶基因（GAPDH）。將基因序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫，ITS序列登錄號為PP212851，GAPDH序列登錄號為PP236998。BLAST比對結(jié)果顯示，該ITS序列與登錄號為KU850621.1的束狀匍柄霉有99.81%相似性，GAPDH序列與登錄號為AB979949.1的束狀匍柄霉有100%相似性。多基因聯(lián)合建樹結(jié)果表明，該菌與S. sarcniforme聚為一枝，自展值為100（圖1G）。通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，病原菌被鑒定為束狀匍柄霉，田間病害為紅三葉匍柄霉葉斑病，亦稱輪紋病或污斑病。

2.1.2 小光殼葉斑病 該病主要為害幼嫩的葉片，葉片遍布小黑點(diǎn)，發(fā)病初期為黑色小斑點(diǎn)（圖2A和2B），一些病斑中部可見灰白色凹陷（圖2C）。未見其后期發(fā)展形態(tài)。菌絲體在PDA平板上多生長于培養(yǎng)基中，呈放射狀，邊緣不規(guī)則（圖2D和2E）。菌落黑色，表面覆蓋有灰黑色硬殼。產(chǎn)生顆粒狀物（子囊殼），大小約為25 μm×60 μm，未見到子囊孢子的產(chǎn)生（圖2F），形態(tài)學(xué)特征與他人描述的三葉草小光殼相同［24-25］。將基因序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫，ITS序列登錄號為PP212852。BLAST比對結(jié)果顯示，該ITS序列與登錄號為MK379997.1的三葉草小光殼有98.4%相似性。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，該菌與三葉草小光殼聚為一枝，自展值為83（圖2G）。通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，將該病原菌被鑒定為三葉草小光殼，田間病害為紅三葉小光殼葉斑病。

2.1.3 長隔孢葉斑病 該病在田間主要為害葉片，初為白色小斑點(diǎn)，后逐漸擴(kuò)大為近橢圓形或不規(guī)則形灰白色斑（圖3A和3B），病斑周圍呈淺黑色，中部色較淡，或可見數(shù)個(gè)小突起（圖3C）。病原菌在PDA平板上菌絲體呈氈狀，生長緩慢，菌落面積較小，為粉色至白粉色，表面有褶皺，稍厚（圖3D-E）。分生孢子器厚壁，孔口乳頭狀，分生孢子梗缺如，全壁芽生式產(chǎn)孢，孢子大小約為（6～15） μm×（4～8） μm，無色，長橢圓形至卵圓形，有隔（圖3F）。該菌的形態(tài)學(xué)特征與田間癥狀與他人研究中的草木樨長隔孢一致［26-27］。將基因序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫，ITS序列登錄號為ON259933。BLAST比對結(jié)果顯示，該ITS序列與登錄號為MT520594.1的Leptosphaeria weimeri有97.40%的相似性。經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育樹分析，該菌與草木樨長隔孢聚為一枝，自展值為99（圖3G）。通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，將該病原菌鑒定為草木樨長隔孢（Longiseptatispora meliloti＝S. meliloti＝L. weimeri），田間病害為紅三葉長隔孢葉斑病。

2.2 田間發(fā)病動(dòng)態(tài)

岷縣紅三葉的生長季節(jié)為每年4月至9月，4月播種或返青，此時(shí)未觀察到明顯的病害發(fā)生。2021年5月在田間觀察到紅三葉發(fā)病，此時(shí)匍柄霉葉斑病的發(fā)病率為0.93%，小光殼葉斑病的發(fā)病率為2.90%，長隔孢葉斑病的發(fā)病率為0.80%。匍柄霉葉斑病的發(fā)病率9月達(dá)到最高，為23.60%，病情指數(shù)為7.90；小光殼葉斑病及長隔孢葉斑病8月發(fā)病率最高，發(fā)病率分別為4.60%和3.20%，病情指數(shù)為1.27和1.23；在生長中后期，匍柄霉葉斑病的發(fā)病率和病情指數(shù)顯著高于其他兩種葉斑?。≒<0.05）（圖4A和4B）。

2022年，匍柄霉葉斑病發(fā)病率由5月最低的2.00%不斷增長，至8月最高，為26.67%，病情指數(shù)由0.77增加至8.20。長隔孢葉斑病發(fā)病率由5月最低的1.30%不斷增長，至8月最高，為4.80%，病情指數(shù)由0.50增加至1.53。長隔孢葉斑病病情發(fā)展總體呈現(xiàn)增長趨勢，但總體發(fā)病率與病情指數(shù)較低。在2022年的多次田間調(diào)查中，小光殼葉斑病僅6月與7月在立林村田間偶見發(fā)生，發(fā)病率極低，僅為0.20%和0.24%。在生長中后期，匍柄霉葉斑病的發(fā)病率和病情指數(shù)顯著高于長隔孢葉斑?。≒<0.05）（圖4C和4D）。

2.3 致病性

2.3.1 匍柄霉葉斑病 采用噴霧法接種5 d后觀察到植株發(fā)病，葉片上出現(xiàn)小黑點(diǎn)，發(fā)病率為33.0%，病情指數(shù)12.63。接種17 d后，發(fā)病率達(dá)到最高，為45.0%，病情指數(shù)為19.00，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)黑斑遍布整個(gè)葉片，黑點(diǎn)發(fā)展為圓形或橢圓形病斑，呈現(xiàn)輪紋狀（圖5A）。溫室發(fā)病癥狀與田間癥狀一致，并且能夠從病葉上重新分離獲得束狀匍柄霉（圖5B）。

2.3.2 小光殼葉斑病和長隔孢 接種三葉草小光殼和草木樨長隔孢后，僅有數(shù)片葉片發(fā)現(xiàn)發(fā)病且癥狀不明顯，發(fā)病率分別為0.5%和1.5%。三葉草小光殼的發(fā)病癥狀與田間癥狀相似（圖6A），但草木樨長隔孢的發(fā)病癥狀與田間略有不同（圖6B），二者均能從病葉上重新分離獲得一致的病原菌。

2.4 匍柄霉葉斑病對紅三葉生長和品質(zhì)的影響

溫室接種匍柄霉葉斑病以評定其對于紅三葉產(chǎn)量和品質(zhì)的損失。接病植株的鮮重相比對照植株顯著降低了20.14%（P<0.05），接病植株的干重相比對照植株沒有顯著差異；接病植株與不接病植株的分枝數(shù)之間沒有顯著差異；接病植株的株高相比對照植株顯著降低了13.96%（P<0.05）（圖7）。

同對照相比，接病植株的粗蛋白、粗纖維、粗脂肪、粗灰分含量較對照降低了1.53%～6.67%，可溶性蛋白及可溶性糖含量較對照提高了4.50%～4.68%，但沒有顯著差異；葉綠素含量相比對照顯著降低了20.97%（P<0.05）。在檢測的20種氨基酸中，異亮氨酸相比對照顯著降低了64.98%，甲硫氨酸、酪氨酸含量顯著提高了273.68%和61.35%（P<0.05）。在接病和不接病處理下的植株7種礦質(zhì)元素含量均沒有顯著差異（表2）。

3 討論

本研究通過形態(tài)學(xué)對比、分子生物學(xué)鑒定及致病性測定，明確了在岷縣紅三葉田中主要病害為3種葉斑病，病原菌分別為束狀匍柄霉、三葉草小光殼及草木樨長隔孢。其中，由草木樨長隔孢引致的紅三葉葉斑病為在中國的首次報(bào)道記錄。

商鴻生曾報(bào)道過由草木樨殼多孢（S. meliloti）引致的白三葉新病害，定名三葉草殼多孢葉斑病，其有性態(tài)為草地小球腔菌（L. weimeri），田間未見［27］。2020年，Hou等通過形態(tài)學(xué)對比及分子生物學(xué)鑒定研究將其重新分類，為草木樨長隔孢（L. meliloti）（暫譯）［28］。草木樨長隔孢目前僅在豆科苜蓿屬（Medicago）、車軸草屬、羽扇豆屬（Lupinus）及草木樨屬（Melilotus）的植物上報(bào)道有病害的發(fā)生（表3）。該病原菌曾導(dǎo)致澳大利亞和法國苜蓿發(fā)病減產(chǎn)［26-29］，在美國阿拉巴馬州引發(fā)白三葉的破壞性危害［30］。在紅三葉上，草木樨長隔孢的研究僅局限于病害的記錄，未能有更深入的探索，且少有報(bào)道。在岷縣紅三葉種植田中，草木樨長隔孢的整體發(fā)病率與病害嚴(yán)重度低，但在整個(gè)生長季均能發(fā)現(xiàn)有明顯的發(fā)病，對紅三葉的生產(chǎn)有一定的影響。在溫室致病性試驗(yàn)中，紅三葉接種草木樨長隔孢7 d后出現(xiàn)癥狀，而后隨著植株的生長，病害癥狀未加重，說明該病原菌的致病能力不強(qiáng)。

三葉草小光殼是一種地理分布范圍廣泛的寄生性真菌，寄主植物的類型多樣，主要寄生在以下科的經(jīng)濟(jì)作物上：十字花科（Brassicaceae）、大戟科（Euphorbiaceae）、禾本科（Poaceae）、豆科和茄科（Solanaceae）（表3），在環(huán)境條件適宜的情況下會(huì)導(dǎo)致寄主植物發(fā)?。?1］。發(fā)病時(shí)植物的葉子和葉柄上出現(xiàn)許多棕黑色凹陷的小病斑，豆科植物癥狀尤其明顯，有時(shí)也會(huì)產(chǎn)生葉焦［25］。三葉草小光殼一般由寄主葉片上萌發(fā)的子囊孢子直接穿透角質(zhì)層和外表皮細(xì)胞壁進(jìn)行傳播，傳播與侵染也可能通過種子發(fā)生［24］。2004年5月至2007年，韓國江原道高爾夫球場的肯塔基早熟禾（Poa pratensis）發(fā)生了由三葉草小光殼引起的小光殼葉枯病，患病嚴(yán)重的植株從葉尖向下到冠部全部枯萎死亡［32］；三葉草小光殼引致的小光殼葉斑病也曾導(dǎo)致澳大利亞、北美等地的苜蓿減產(chǎn)［33-34］，導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)損失。在紅三葉上，該病害的研究僅停留在報(bào)道記錄上。在田間，小光殼葉斑病的發(fā)病率與病害嚴(yán)重度低，僅在幼嫩葉片上發(fā)現(xiàn)，癥狀為零星小黑點(diǎn)。在溫室致病性試驗(yàn)中，三葉草小光殼的致病性較差，接種5 d后僅僅數(shù)片葉子出現(xiàn)癥狀，而后隨著植株的生長，癥狀消失。田間調(diào)查與溫室致病實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明紅三葉小光殼并不是常見性病害，且致病能力弱，對紅三葉生長的影響很小。

匍柄霉葉斑病是三葉草生產(chǎn)中的重要病害，世界性分布，在我國見于云南、貴州、湖北、甘肅等種植區(qū)。最常見的病原菌為束狀匍柄霉，主要為害葉片，受害嚴(yán)重時(shí)葉片干枯，提早脫落。束狀匍柄霉的宿主除豆科常見的苜蓿、三葉草、豌豆等，還有菊科和禾本科的一些作物（表3）?？汕秩救~草的匍柄霉屬真菌還有簇孢匍柄霉（S. botryosum）和囊狀匍柄霉（S.vesicarium）［34-35］。匍柄霉以休眠菌絲體或分生孢子在病株或病殘?bào)w上越冬，次年生長季節(jié)，分生孢子借助風(fēng)雨重復(fù)侵染，擴(kuò)展蔓延至流行。紅三葉匍柄霉葉斑病在美國東北部、加拿大及歐洲大部分地區(qū)都有發(fā)生，病害嚴(yán)重度高，產(chǎn)量損失高達(dá)10%［36］；該病影響了我國貴州、云南等地的紅三葉生產(chǎn)，造成紅三葉產(chǎn)量和品質(zhì)下降、種子減產(chǎn)［37-38］。在岷縣田間，匍柄霉葉斑病自五月開始發(fā)生，伴隨紅三葉的整個(gè)生長季，為當(dāng)?shù)丶t三葉最為嚴(yán)重的病害，受害植株葉片出現(xiàn)大量黑斑，病葉枯死，植株矮小，嚴(yán)重影響紅三葉的生產(chǎn)。溫室致病性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在接種病原菌后匍柄霉葉斑病迅速發(fā)展，導(dǎo)致葉片蜷縮枯萎，顯著降低了葉片葉綠素含量、植株的鮮重和干重，這說明匍柄霉葉斑病顯著影響了紅三葉的光合作用和產(chǎn)量。對其品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行測定，接病植株的粗蛋白、粗纖維、粗脂肪和粗灰分含量雖沒有顯著性的差異，但整體呈現(xiàn)降低趨勢，這可能是由于發(fā)病周期較短，采集樣品時(shí)病害的影響未能繼續(xù)擴(kuò)大。

氨基酸是生物大分子的組成部分［39］，一些氨基酸是合成各種次級防御代謝產(chǎn)物的前體成分。例如，脂肪族氨基酸（如丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸和纈氨酸）和芳香族氨基酸（如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸）參與脂肪族、芳香族和吲哚型硫代葡萄糖苷的形成，硫代葡萄糖苷的水解產(chǎn)物可作為防御化合物對抗食草動(dòng)物和病原體［40］；谷氨酸激活水楊酸（SA）途徑以觸發(fā)水稻的稻瘟病抗性［41］；異亮氨酸（Ile）是植物激素茉莉酸（JA）活性成分JA-Ile的前體，外源Ile的加入可增強(qiáng)生菜（Lactuca sativa）、玫瑰（Rosa rugosa）和草莓（Fragaria×ananassa）等作物對灰霉?。˙. cinerea）的抗性［42］。綜上研究說明氨基酸代謝與抗病性之間存在明顯的相關(guān)性。本研究中，匍柄霉葉斑病降低了異亮氨酸含量，但增加了甲硫氨酸（Met）、酪氨酸（Tyr）含量，這種變化不僅代表其牧草品質(zhì)發(fā)生了改變，也意味著病害的發(fā)生激活了其體內(nèi)相關(guān)的防御機(jī)制，具體情況仍需進(jìn)一步探索。

牧草中的鉀（K）、鈣（Ca）、磷（P）等大量元素不僅是促進(jìn)自身生長發(fā)育的重要營養(yǎng)元素，也是牧草礦質(zhì)營養(yǎng)的重要組成部分，對草食動(dòng)物的營養(yǎng)調(diào)節(jié)代謝有著重要的作用［43］。K參與植物滲透壓、細(xì)胞膜點(diǎn)位及pH的調(diào)節(jié)過程，同時(shí)參與蛋白質(zhì)合成、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)及光合作用過程中酶的活化等重要生理生化過程。Ca是生物體內(nèi)普遍存在的第二信使，參與各種細(xì)胞過程，調(diào)控植物的發(fā)育，響應(yīng)生物和非生物脅迫。P與植物產(chǎn)量調(diào)控密切相關(guān)，有研究報(bào)道當(dāng)植物對P的攝入不足時(shí)會(huì)使植株產(chǎn)量降低10%～15%，適宜施P肥可有效提高苜蓿種子莢果數(shù)、結(jié)莢率和種子產(chǎn)量［44］。Zn，F(xiàn)e，Cu，Se等微量元素也是植物生長和動(dòng)物生長發(fā)育必不可少的元素，直接影響牧草品質(zhì)的優(yōu)劣［45］。本實(shí)驗(yàn)中，接病處理下各類礦質(zhì)元素的含量相比對照并有顯著差異，除鈣元素外，其他礦質(zhì)元素含量均有不同程度的提高，推測其與植株體內(nèi)的脅迫相應(yīng)機(jī)制有關(guān)。

4 結(jié)論

于岷縣田間發(fā)現(xiàn)的3種葉部病害，病原菌分別為束狀匍柄霉（S. sarcniiforme）、三葉草小光殼（L. trifolii）及草木樨長隔孢（L. meliloti）。由草木樨長隔孢引致的紅三葉葉斑病為在中國的首次報(bào)道記錄。其中紅三葉匍柄霉葉斑病最為嚴(yán)重。匍柄霉葉斑病顯著影響了紅三葉的產(chǎn)量和品質(zhì)，導(dǎo)致鮮重下降20.14%，葉綠素含量下降20.93%。接病紅三葉植株的粗纖維、粗蛋白、粗脂肪及灰分含量下降1.53%～6.67%。在測定的20種氨基酸指標(biāo)中，異亮氨酸相比對照顯著降低了64.98%，甲硫氨酸和酪氨酸含量顯著提高了273.68%和61.35%。測定的礦質(zhì)元素含量沒有顯著性變化。

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（責(zé)任編輯 閔芝智）

收稿日期：2023-10-20；修回日期：2024-01-15

基金項(xiàng)目：國家綠肥技術(shù)產(chǎn)業(yè)體系（CARS-22）資助

作者簡介：

鄭榮春（1997-），男，漢族，福建福州人，博士研究生，主要從事牧草病理學(xué)研究，E-mail：zhengrch2023@ lzu. edu. cn；*通信作者Author for correspondence，E-mail：duanty@ lzu. edu. cn