于元平 蔣宇佳 孫向一 吳春妍 周敏 劉明稀

摘要：WRKY家族是高等植物特有且最大的一類轉(zhuǎn)錄因子。本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)，在假儉草（Eremochloa ophiuroides（Munro.））全基因組中鑒定92個(gè)WRKY家族基因，命名為EoWRKY1～EoWRKY92，分布在9條染色體上。對(duì)其序列特性、基因結(jié)構(gòu)、順式作用元件等進(jìn)行分析，并基于假儉草相關(guān)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析了EoWRKYs在干旱脅迫下的表達(dá)模式，最后基于qRT-PCR解析其在干旱脅迫下的瞬時(shí)表達(dá)特征。結(jié)果表明：根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育特征可將EoWRKYs分為三組，Group Ⅰ含有完整的WRKY結(jié)構(gòu)域和鋅指基序，Group II～I(xiàn)II存在結(jié)構(gòu)域和鋅指基序丟失和變異現(xiàn)象。EoWRKYs在干旱脅迫下的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明：在假儉草葉片和根干旱脅迫不同時(shí)期，各基因表達(dá)量存在差異。qRT-PCR結(jié)果表明：干旱處理不同時(shí)間后，EoWRKY77，EoWRKY28，EoWRKY30和 EoWRKY2在脅迫下表達(dá)量顯著升高，具有正向調(diào)控作用；EoWRKY33，EoWRKY62，EoWRKY9和EoWRKY60表達(dá)量下降，這8個(gè)基因在干旱脅迫下表達(dá)量顯著變化，與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致。本研究為假儉草WRKY轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)一步功能研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：假儉草；WRKY基因家族；生物信息學(xué)；干旱脅迫

中圖分類號(hào)：Q945.78??? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A???? 文章編號(hào)：1007-0435（2024）05-1378-14

Identification of the WRKY Family Genes and thier Expression Analysis in

Response to Drought Stress in Centipedegrass

YU Yuan-ping1，2， JIANG Yu-jia1，2， SUN Xiang-yi1，2， WU Chun-yan1，2， ZHOU Min1，2， LIU Ming-xi1，2*

（1. Department of Pratacultural Science， College of Agronomy， Hunan Agricultural University， Changsha，

Hunan Province 410128， China; 2. Hunan Grassland Research Center， Changsha， Hunan Province 410128， China）

Abstract：The WRKY family is the unique and the largest class of transcription factors in higher plants. In this study，92 WRKY family genes，named EoWRKY1～EoWRKY92，were identified in the whole genome of centipedegrass by bioinformatics method. The sequence characteristics，gene structure and cis-regulatory element of EoWRKYs were analyzed，and the expression patterns of EoWRKYs under drought stress were analyzed based on their relevant transcriptome data. qRT-PCR was used to analyze their transient expression under drought stress. The results show that EoWRKYs can be divided into three groups according to their phylogenetic characteristics. Group I contains a complete WRKY domain and a zinc finger motif，which were deleted or changed in Group II and Group III. The results of transcriptome analysis of EoWRKYs under drought stress showed that there were differences in gene expression in leaves and roots during different drought stress stages. qRT-PCR results showed that the expression level of EoWRKY77，EoWRKY28，EoWRKY30 and EoWRKY2 was significantly increased under drought stress，while the expression level of EoWRKY33，EoWRKY62，EoWRKY9 and EoWRKY60 was decreased under drought stress. The expression levels of these 8 genes changed significantly under drought stress，which was consistent with the transcriptome data. This study provides a basis for further functional studies of the WRKY transcription factor in centipedegrass.

Key words：Centipedegrass；WRKY gene family；Bioinformatics；Drought stress

WRKY家族是高等植物特有且最大的一類轉(zhuǎn)錄因子，由其N端具有高度保守的WRKYGQK的核心基序而命名，該基序中氨基酸W，R和K是高度保守的，其中存在氨基酸殘基替換突變體［1］。在WRKY結(jié)構(gòu)域的C端有兩種類型的鋅指結(jié)構(gòu)［2］，分別是C2HC （C-X7-C-X23-HX-C），C2H2（C-X4-5-C-X22-23H-X-H），根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)目和鋅指結(jié)構(gòu)特征，將WRKY家族分為三個(gè)亞家族，即Group I～I(xiàn)II。首個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子在甘薯（Dioscorea esculenta）中鑒定［3］，越來越多的WRKY轉(zhuǎn)錄因子在不同的植物中挖掘，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）［4］、水稻（Oryza sativa）［5］、香樟（Cinnamomum camphora）［6］、紅麻（Hibiscus Cannabinus）［7］、綠豆（Vigna radiata）［8］等。有許多研究表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子在響應(yīng)植物非生物脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。李紅等［9］在紫花苜蓿（Medicago sativa）中鑒定出一個(gè)WRKY基因能夠響應(yīng)蘇打鹽堿脅迫。MsWRKY33轉(zhuǎn)錄因子通過正向調(diào)控MsACS2表達(dá)來影響乙烯合成，從而影響紫花苜蓿的鹽脅迫響應(yīng)［10］。OsWRKY11的異位表達(dá)提高了其對(duì)熱脅迫和干旱脅迫的響應(yīng)［11］。在煙草（Nicotiana benthamiana）中過表達(dá)LcWRKY40可以通過響應(yīng)干旱脅迫反應(yīng)來增強(qiáng)植物的耐旱性［12］。GhWRKY68通過調(diào)節(jié)ABA信號(hào)傳導(dǎo)以及細(xì)胞活性氧來響應(yīng)干旱脅迫和鹽脅迫［13］。過表達(dá)AtWRKY30增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因小麥（Triticum aestivum）對(duì)熱和干旱脅迫的耐受性［14］。在Sun等［15］的研究中發(fā)現(xiàn)AtWRKY53通過介導(dǎo)氣孔運(yùn)動(dòng)負(fù)調(diào)節(jié)擬南芥的抗旱性。TaWRKY2和TaWRKY19的過表達(dá)使轉(zhuǎn)基因擬南芥具有更強(qiáng)的耐鹽和耐旱性［16］。

假儉草是一種多年生C4草本植物，是禾本科蜈蚣草屬中唯一可作用于草坪草的草種，原產(chǎn)于我國(guó)四川、云南、福建、江蘇、浙江、湖北、湖南、廣西等長(zhǎng)江流域以南亞熱帶地區(qū)，是我國(guó)最重要的本土暖季型草種，被稱為“中國(guó)草坪草”［17-18］。假儉草植株低矮、抗逆性強(qiáng)且耐粗放管理，是建植綠地草坪、固土護(hù)坡、綠化建設(shè)及治理水土流失的理想材料［19-20］。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)干旱脅迫中發(fā)揮重要作用，但目前關(guān)于假儉草WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因響應(yīng)干旱脅迫的研究未見報(bào)道。本研究利用假儉草全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選鑒定了EoWRKYs家族成員，分析其蛋白理化性質(zhì)、系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹、保守基序、順式作用元件等，并基于干旱脅迫下轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行表達(dá)譜分析，同時(shí)通過qRT-PCR驗(yàn)證EoWRKYs在干旱脅迫下的表達(dá)水平，為進(jìn)一步研究該轉(zhuǎn)錄因子家族成員在假儉草干旱脅迫應(yīng)答等過程中的作用提供理論基礎(chǔ)，為假儉草和其他草種抗旱品種培育提供基因素材。

1 材料與方法

1.1 EoWRKY基因家族成員鑒定與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域驗(yàn)證

參考假儉草全基因組數(shù)據(jù)［21］，通過本地BLAST比對(duì)，獲取假儉草WRKY候選蛋白，同時(shí)在Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//pfam.xfam.org/）中下載WRKY基因家族保守結(jié)構(gòu)域的隱馬爾可夫模型文件（PF03106），利用HMMER3.1軟件在假儉草本地蛋白數(shù)據(jù)中進(jìn)行BlastP搜索，獲取假儉草WRKY候選蛋白，E-value值為10-10，合并序列后將二者獲得序列全部作為WRKY基因家族的候選序列。利用NCBI-CDD，Pfam等在線網(wǎng)站對(duì)獲取的候選WRKY基因家族蛋白序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域驗(yàn)證，保留含有WRKY結(jié)構(gòu)域的基因，最終從假儉草全基因組蛋白文件中篩選出92個(gè)EoWRKY基因家族成員。

1.2 假儉草WRKY家族成員系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

利用MEGA7軟件，采用臨近法構(gòu)建假儉草WRKY基因家族系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.3 假儉草WRKY家族基因保守基序、染色體位置信息和蛋白理化性質(zhì)分析

利用在線網(wǎng)站MEME（https：//meme-suite.org/）對(duì)假儉草WRKY家族基因進(jìn)行保守基序分析，根據(jù)假儉草基因組GFF3注釋文件，提取EoWRKYs基因內(nèi)含子及外顯子的位置信息和WRKY基因染色體的位置信息，繪制基因結(jié)構(gòu)圖及染色體定位圖。同時(shí)利用在線網(wǎng)站ExPASy（https：//www.expasy.org/）對(duì)WRKY家族成員氨基酸序列的等電點(diǎn)（PI）、蛋白質(zhì)分子量（MW）和氨基酸數(shù)目（AA）進(jìn)行分析。

1.4 假儉草WRKY基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析

提取EoWRKYs基因上游2 000 bp的序列，利用在線工具PlantCARE（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預(yù)測(cè)順式作用元件。

1.5 共線性分析

利用假儉草全基因組及GFF3注釋信息獲取EoWRKYs染色體位置信息及共線性分析，利用MCScan X分析EoWRKY基因的共線性，并使用circos軟件繪制結(jié)果。

1.6 假儉草WRKY基因家族表達(dá)譜分析

利用課題組前期干旱脅迫下假儉草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)［22］，使用TBtools繪制熱圖。

1.7 植物材料與處理方法

假儉草“22-1”作為試驗(yàn)材料，材料種植于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)西田徑場(chǎng)資源圃中。采用干砂脫水法對(duì)假儉草進(jìn)行模擬干旱，將假儉草從資源圃中拔出，用流水沖洗根部，用吸水紙吸干水分后放入培養(yǎng)瓶中并裝滿干燥石英砂，分別進(jìn)行0 h，3 h，6 h及12 h干旱脅迫處理，0 h作為對(duì)照。

1.8 干旱脅迫下EoWRKY基因的qRT-PCR分析

利用轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜數(shù)據(jù)篩選出的候選EoWRKY基因的CDS序列，使用Primer3plus網(wǎng)站設(shè)計(jì)PCR引物（表1），內(nèi)參為假儉草中actin1［22］。使用Trizol法提取假儉草葉片RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（全式金，AT311）進(jìn)行假儉草葉片cDNA合成，使用熒光定量試劑盒（諾唯贊，Q711）于ABI（Applied Biosystems）公司ABI7500 PCR系統(tǒng)進(jìn)行熒光定量反應(yīng)。試驗(yàn)技術(shù)重復(fù)3次，相對(duì)表達(dá)量使用2-ΔΔCT計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 假儉草EoWRKY家族基因成員鑒定及其理化性質(zhì)分析

通過Blast和HMMER序列比對(duì)，結(jié)合WRKY保守結(jié)構(gòu)域分析，最終獲得了92個(gè)假儉草WRKY家族成員，根據(jù)在染色體上的位置將其編號(hào)EoWRKY1～EoWRKY92。EoWRKY家族成員理化性質(zhì)鑒定分析結(jié)果如表2所示，該基因家族多肽鏈氨基酸數(shù)目為154～1 219個(gè)；等電點(diǎn)為4.84～10.11。親水性分析結(jié)果顯示，所有EoWRKY蛋白的親水性均為負(fù)值，屬親水蛋白，其中親水性最強(qiáng)的是EoWRKY38，其平均親水性為-1.05。不穩(wěn)定指數(shù)的鑒定結(jié)果表明，所有成員不穩(wěn)定指數(shù)均高于40，均為壽命較短的不穩(wěn)定蛋白。蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析表明EoWRKY蛋白均定位于細(xì)胞核。

2.2 假儉草EoWRKY基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

本研究利用MEGA7對(duì)92個(gè)EoWRKY家族成員的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果如圖1。假儉草WKRY家族成員分為三個(gè)組，分別為Group Ⅰ～Ⅲ，其中GroupⅡ分為Ⅱa和Ⅱb兩個(gè)亞類。Group Ⅰ包含11個(gè)成員；Group Ⅱ成員數(shù)最多，有52個(gè)；剩下的29個(gè)成員位于Group Ⅲ。

2.3 假儉草WRKY基因染色體定位及物種間共線性分析

染色體定位結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖2），分布于chr5的數(shù)量最多，為21；分布數(shù)量最少的是chr8，數(shù)量為4。且92個(gè)EoWRKY基因不均勻的分布在9條染色體上，這說明EoWRKY基因的染色體分布不具有偏好性。

對(duì)假儉草EoWRKY基因的旁系同源關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè)，并對(duì)EoWRKY基因復(fù)制事件分析，92個(gè)EoWRKY中含有16對(duì)同源基因（圖3），其中位于1號(hào)染色體的EoWRKY8和EoWRKY9為1對(duì)串聯(lián)基因，同樣位于7號(hào)染色體的EoWRKY69與EoWRKY70，EoWRKY79與EoWRKY82為2對(duì)串聯(lián)基因，其余13對(duì)同源基因均為片段復(fù)制。除4號(hào)染色體外，其他8條染色體均有片段復(fù)制基因。推測(cè)片段復(fù)制事件是假儉草EoWRKY基因進(jìn)化的主要途徑。

2.4 假儉草EoWRKY基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

基因結(jié)構(gòu)表明（圖4），假儉草EoWRKY基因家族成員含有1～11個(gè)內(nèi)含子，2～12個(gè)外顯子。EoWRKY41僅含有2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子；EoWRKY88基因結(jié)構(gòu)最復(fù)雜，含有11個(gè)內(nèi)含子和12個(gè)外顯子。

對(duì)假儉草EoWRKY蛋白進(jìn)行motif預(yù)測(cè)，分析得到10個(gè)保守基序，命名為motif1～motif10，如圖5所示。其中最短基序序列長(zhǎng)度為6個(gè)氨基酸（motif6），最長(zhǎng)基序序列長(zhǎng)度為50個(gè)氨基酸（motif4）。在不同的EoWRKY蛋白中含有motif數(shù)量2～9個(gè)不等，其中motif1為WRKY家族七肽保守基序WRKYGQK，motif3為鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域。I組成員基本全包含motif5，motif1，motif2和motif3，motif4主要存在I組中。II組成員中motif種類多，全包含motif1，motif2和motif3，IIa組中成員包含motif9，但I(xiàn)Ib中不存在。motif7主要III組成員中，包含的motif種類基本一致。GroupI～I(xiàn)II中基本都含有motif1，motif2和motif3，推測(cè)這3個(gè)基序是EoWRKY蛋白的核心保守基序，但EoWRKY87不含有motif1和motif2，可能是遺傳進(jìn)化中發(fā)生丟失所導(dǎo)致。

2.5 假儉草EoWRKY家族成員啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件預(yù)測(cè)

獲取假儉草EoWRKY基因上游2 000 bp的啟動(dòng)子區(qū)域序列，利用Plantcare軟件進(jìn)行順式作用元件分析，篩選出14個(gè)順式作用元件，如赤霉素響應(yīng)元件、光反應(yīng)元件、水楊酸響應(yīng)元件、低溫反應(yīng)元件、脫落酸響應(yīng)元件和生長(zhǎng)素響應(yīng)元件等（圖6）。可為進(jìn)一步研究WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與植物抗逆脅迫的分子機(jī)理及選育高抗假儉草品種提供參考。

2.6 EoWRKY家族成員在假儉草不同干旱脅迫時(shí)期表達(dá)情況

基于課題組已有假儉草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)［22］對(duì)EoWRKY基因家族成員在不同干旱時(shí)期的表達(dá)情況進(jìn)行分析，不同EoWRKY基因在假儉草葉片和根系的干旱前期（0 d）、中期（7 d）、后期（15 d）中表達(dá)模式存在較大差異（圖7和圖8）。干旱脅迫下葉片中，EoWRKY66，EoWRKY54，EoWRKY14等在干旱脅迫后期高表達(dá)，EoWRKY65，EoWRKY45，EoWRKY88等在干旱脅迫中期表達(dá)量較高；EoWRKY11，EoWRKY5，EoWRKY13等成員在干旱脅迫下表達(dá)量下降，EoWRKY76和EoWRKY29缺少表達(dá)信息。干旱脅迫下根系轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明，60個(gè)EoWRKY基因按照其對(duì)干旱脅迫的應(yīng)答模式分為4組，第1組為EoWRKY69等26個(gè)基因，表現(xiàn)為隨著干旱脅迫程度的加深，表達(dá)量逐漸下降；第2組為EoWRKY90等14個(gè)基因，在干旱前中期有較高表達(dá)，后期表達(dá)量下降；第3組包含EoWRKY77等5個(gè)基因，表現(xiàn)為隨著干旱脅迫進(jìn)行表達(dá)量逐漸升高；第4組包含EoWRKY8等15個(gè)基因，其表達(dá)量表現(xiàn)隨干旱進(jìn)行出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，表明這些EoWRKY基因可能在干旱脅迫中起重要作用。

2.7 干旱脅迫下假儉草EoWRKY基因的qRT-PCR分析

為保證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，隨機(jī)篩選出8個(gè)EoWRKYs，即EoWRKY77，EoWRKY28，EoWRK-Y30，EoWRKY2，EoWRKY33，EoWRKY62，EoWR-KY9和EoWRKY60，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中前4個(gè)基因隨著葉片干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量提高；而后4個(gè)基因則剛好相反。通過qRT-PCR驗(yàn)證其響應(yīng)干旱脅迫的瞬時(shí)表達(dá)量差異，結(jié)果如圖9，EoWRKY77，EoWRKY28，EoWRKY30和EoWRKY2在干旱脅迫下表達(dá)量升高，正向響應(yīng)了干旱脅迫，EoWRKY33，EoWRKY62，EoWRKY9和EoWRKY60在干旱脅迫下表達(dá)量逐漸下降，說明干旱脅迫短期內(nèi)可能抑制了這些基因的表達(dá)。qRT-PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果一致，表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)有較高的可靠性。

3 討論

WRKY作為一類存在于高等植物中的重要調(diào)控因子，廣泛參與著植物生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程與植物逆境脅迫的響應(yīng)［23］。目前已經(jīng)在多個(gè)物種完成WRKY基因家族的鑒定，例如二穗短柄草（Brachypodium distachyon）［24］、鹽生草（Halogeton glomeratus）［25］、大苞萱草（Hemerocallis middendorffii）［26］等，然而在假儉草中WRKY基因家族的研究未見報(bào)道。本研究基于假儉草全基因組測(cè)序結(jié)果［21］，通過生物信息學(xué)手段，在假儉草中鑒定出92個(gè)EoWRKY基因。通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域與鋅指結(jié)構(gòu)將EoWRKY基因家族分為Group Ⅰ～Ⅲ三大組，Group Ⅱ成員數(shù)最多，占比最大（56.5%），在其他植物WRKY家族中Group Ⅱ比例也較高，如在木薯（Manihot esculenta）中占比66%［27］。

基因復(fù)制是基因家族擴(kuò)增的主要驅(qū)動(dòng)力之一，片段復(fù)制和串聯(lián)重復(fù)是基因復(fù)制的主要兩種方式［28］。以往研究表明，片段復(fù)制在WRKY基因家族中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)在白三葉（Trifolium repens）WRKY轉(zhuǎn)錄因子中，存在118個(gè)片段復(fù)制和6個(gè)串聯(lián)復(fù)制［29］。在百脈根（Lotus corniculatus）WRKY基因家族的研究中，發(fā)現(xiàn)有37個(gè)基因復(fù)制事件，其中包括36個(gè)片段復(fù)制［30］。在玉米（Zea mays）的WRKY基因研究中，有52個(gè)基因復(fù)制事件，且全為片段復(fù)制，沒有涉及到串聯(lián)復(fù)制［31］。在本研究中，假儉草EoWRKY基因中含有13對(duì)片段重復(fù)基因和3對(duì)串聯(lián)重復(fù)基因，該進(jìn)化模式與玉米［31］、亞麻薺（Camelina sativa）［32］等相同，這表明片段復(fù)制事件可能是假儉草EoWRKY基因家族形成和擴(kuò)增的主要?jiǎng)恿Α?/p>

啟動(dòng)子區(qū)域存在大量順式作用元件，調(diào)控著基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。本研究中，在假儉草EoWRKY基因的啟動(dòng)子區(qū)域中鑒定了各種順式作用元件，如光響應(yīng)、激素應(yīng)答、逆境脅迫和生長(zhǎng)發(fā)育等順式作用元件，如與生長(zhǎng)素、赤霉素、水楊酸、脫落酸響應(yīng)相關(guān)的元件，這對(duì)于研究EoWRKY基因的潛在功能是重要的。以往研究表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過與脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件參與干旱脅迫應(yīng)答，MaWRKY80通過調(diào)節(jié)脫落酸和氧化還原代謝正向調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱性［33］；干旱、鹽堿、高溫和低溫脅迫等環(huán)境因素，以及與防御相關(guān)的植物激素ABA和SA影響著ZmWRKY65的轉(zhuǎn)錄，從而增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)非生物脅迫的耐受性［34］。擬南芥中過表達(dá)EjWRKY17可促進(jìn)ABA處理下轉(zhuǎn)基因株系的根伸長(zhǎng)和子葉綠化［35］。綜上所述，本研究中啟動(dòng)子區(qū)域研究結(jié)果為假儉草在干旱脅迫下揭示信號(hào)通路提供了思路。

許多研究表明，植物在受到干旱脅迫時(shí)WRKY基因能被快速誘導(dǎo)表達(dá)，從而響應(yīng)干旱脅迫。對(duì)不同干旱脅迫時(shí)期下轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)存在顯著差異表達(dá)的EoWRKY基因，推測(cè)這些差異基因可能參與了干旱脅迫過程。如葉片中EoWRKY66，EoWRKY54和EoWRKY14等在干旱脅迫后期高表達(dá)，而根系中EoWRKY54與之相反，EoWRKY14沒有表達(dá)；葉片中EoWRKY16，EoWRKY17和EoWRKY59等在干旱脅迫前期高表達(dá)，EoWRKY42，EoWRKY63和EoWRKY71等在干旱脅迫后期高表達(dá)，而這些基因在根系干旱脅迫中期出現(xiàn)高表達(dá)，表明這些基因可能在特定的組織和干旱脅迫中起重要作用。例如，ZmWRKY79通過觸發(fā)ABA生物合成基因（包括AAO3基因），正向調(diào)控ABA水平的增加，從而提高擬南芥的抗旱性［36］。AtWRKY57通過直接結(jié)合W-box元件刺激RD29A和NCED3的表達(dá)，從而提高擬南芥的耐旱性［37］。在本研究中，在受到不同時(shí)期的干旱脅迫后，假儉草葉片和根系的表達(dá)模式與其分類并不存在相關(guān)性，這與Yang等［38］的研究結(jié)果不同。這些發(fā)現(xiàn)表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子在不同組織中表達(dá)譜不同，進(jìn)而調(diào)節(jié)一系列生理生化代謝過程，推測(cè)在假儉草根系和葉片中相關(guān)EoWRKY基因共同發(fā)揮作用以抵御干旱脅迫。

在本研究中qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果EoWRKY33，EoWRKY62，EoWRKY9和EoWRKY60在脅迫后表達(dá)量顯著降低；EoWRKY77，EoWRKY28，EoWRKY30和EoWRKY2均在干旱脅迫12 h相對(duì)表達(dá)量上升，且表現(xiàn)出較強(qiáng)的應(yīng)激反應(yīng)，這驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，同時(shí)也推測(cè)這些基因可能通過激活相關(guān)基因的表達(dá)來響應(yīng)干旱脅迫。據(jù)報(bào)道，過表達(dá)ZmWRKY40通過調(diào)控逆境相關(guān)基因STZ，DREB2B和RD29A提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱性［39］。ZmWRKY106的過表達(dá)通過ABA信號(hào)通路調(diào)控逆境相關(guān)基因，提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)干旱和熱脅迫的耐受性［40］。過表達(dá)OsWRKY30能通過磷酸化絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）來增強(qiáng)水稻對(duì)干旱脅迫的耐受性［41］。結(jié)合WRKY家族在許多植物中的研究結(jié)果，推測(cè)假儉草中的WRKY基因可能具有與非生物脅迫相關(guān)的調(diào)控功能。

4 結(jié)論

本研究從假儉草全基因組中鑒定出92個(gè)EoWRKY基因，并對(duì)其蛋白理化性質(zhì)、系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化、染色體分布、保守基序、順式作用元件等進(jìn)行了分析，較為系統(tǒng)的鑒定了假儉草EoWRKY基因家族。同時(shí)，基于干旱脅迫下轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析發(fā)現(xiàn)假儉草葉片和根系中大量EoWRKY基因表達(dá)量上調(diào)，并通過qRT-PCR對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行驗(yàn)證，其結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致，且EoWRKY77，EoWRKY28，EoWRKY30和EoWRKY2基因在干旱脅迫下被快速誘導(dǎo)激活，推測(cè)這些基因共同發(fā)揮作用以提高假儉草的耐旱性。本研究結(jié)果為深入研究假儉草EoWRKY耐旱基因成員的篩選、抗逆作用機(jī)制及假儉草分子育種提供數(shù)據(jù)支持。

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（責(zé)任編輯 劉婷婷）

收稿日期：2023-11-01；修回日期：2023-12-28

基金項(xiàng)目：湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目面上項(xiàng)目（2018 JJ2180）；湖南省教育廳一般項(xiàng)目（17C0759）共同資助

作者簡(jiǎn)介：

于元平（1999-），男，漢族，山東威海人，碩士研究生，主要從事草坪草分子研究，E-mail：1754071305@qq.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：Lmx75@hunau.edu.cn