初毅 代寧 曹艷杰

摘要目的：探討金銀花提取物對脂多糖（LPS）致心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響及分子機(jī)制。方法：將H9c2細(xì)胞分為對照（Con）組、LPS組、LPS＋金銀花低劑量組、LPS＋金銀花中劑量組、LPS＋金銀花高劑量組、LPS＋pcDNA組、LPS＋pcDNA含山梨醇和SH3結(jié)構(gòu)域連接蛋白2（SORBS2）組、LPS＋金銀花高劑量＋siNC組、LPS＋金銀花高劑量＋siSORBS2組。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡；蛋白免疫印記（WesternBlot）法檢測蛋白表達(dá)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量、乳酸脫氫酶（LDH）活性、腫瘤壞死因子α（TNFα）、白細(xì)胞介素1（IL1）、白細(xì)胞介素6（IL6）水平。結(jié)果：金銀花提取物呈劑量效應(yīng)降低LPS誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡率、MDA含量、LDH活性，升高SORBS2蛋白表達(dá)、SOD活性，降低TNFα、IL1、IL6水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。過表達(dá)SORBS2與金銀花提取物作用相同；敲除SORBS2逆轉(zhuǎn)了金銀花提取物對LPS致心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的作用。結(jié)論：金銀花提取物可能通過上調(diào)SORBS2表達(dá)抑制LPS致心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。

關(guān)鍵詞金銀花提取物；心肌細(xì)胞；氧化應(yīng)激；細(xì)胞凋亡；炎癥反應(yīng)；脂多糖；實(shí)驗(yàn)研究

doi：10.12102/j.issn.16721349.2024.06.011

研究表明，心肌細(xì)胞凋亡參與許多心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程；心肌細(xì)胞受損之后線粒體氧化應(yīng)激引起的能量代謝障礙是許多心血管疾病的發(fā)病原因，且心肌損傷會引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而加劇心肌細(xì)胞凋亡［13］。研究發(fā)現(xiàn)，中藥可通過減輕線粒體損傷而抑制心肌細(xì)胞凋亡，對心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用［4］。金銀花（LonicerajaponicaThunb）是中國傳統(tǒng)的清熱解毒草藥，具有抗炎、抗菌等作用［5］。研究表明，從金銀花中分離提取的單體化合物JX2B6和JX2B11具有抗過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的作用［6］。金銀花提取物可抑制肺組織炎性因子的產(chǎn)生，改善脂多糖（LPS）致大鼠急性肺損傷［7］。金銀花提取物可能通過抑制活性氧（ROS）產(chǎn)生，進(jìn)而抑制NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）炎癥小體通路介導(dǎo)的促炎因子白細(xì)胞介素1β（IL1β）和白細(xì)胞介素18（IL18）的釋放，緩解肺組織炎癥損傷，從而對重癥急性胰腺炎大鼠的肺損傷具有保護(hù)作用［8］。以上研究表明，金銀花提取物具有抗心肌細(xì)胞凋亡作用及抗炎作用，然而其對心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響及機(jī)制尚不清楚。含山梨醇和SH3結(jié)構(gòu)域連接蛋白2（sorbinandSH3domaincontainingprotein2，SORBS2）為位于4q35.1的一種銜接蛋白，研究報(bào)道過表達(dá)SORBS2可減少LPS誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子α（tumornecrosisfactorα，TNFα）和白細(xì)胞介素6（IL6）釋放及細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞活力［9］。miR213p通過靶基因SORBS2調(diào)控LPS誘導(dǎo)的膿毒癥心肌?。?0］。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究金銀花提取物是否能夠通過調(diào)控SORBS2表達(dá)影響LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激凋亡和炎癥反應(yīng)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1材料

H9c2細(xì)胞購自美國ATCC；LPS購自北京索萊寶科技有限公司；金銀花提取物購自南京道斯夫生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；凋亡檢測試劑盒購自美國eBioscience公司；蛋白提取試劑盒購自美國Epigentek公司；丙二醛（malonaldehyde，MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）試劑盒、乳酸脫氫酶（lacticdehydrogenase，LDH）試劑盒均購自美國Biovision公司；TNFα、白細(xì)胞介素1（IL1）、IL6酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（ELISA）購自美國Sciencell公司。

1.2細(xì)胞處理和分組

將H9c2細(xì)胞分為對照（Con）組、LPS組、LPS＋金銀花低劑量組、LPS＋金銀花中劑量組、LPS＋金銀花高劑量組、LPS＋pcDNA組、LPS＋pcDNASORBS2組、LPS＋金銀花高劑量＋siNC組、LPS＋金銀花高劑量＋siSORBS2組。LPS組：H9c2細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基，取對數(shù)期細(xì)胞，用1μg/mL的LPS處理H9c2細(xì)胞；Con組：正常培養(yǎng)細(xì)胞；LPS＋金銀花低劑量組：用1μg/mL的LPS和濃度為125μg/mL的金銀花提取物處理細(xì)胞；LPS＋金銀花中劑量組：用1μg/mL的LPS和濃度為250μg/mL的金銀花提取物處理細(xì)胞；LPS＋金銀花高劑量組：用1μg/mL的LPS和濃度為500μg/mL的金銀花提取物處理細(xì)胞；LPS＋pcDNA組：將pcDNA轉(zhuǎn)染至H9c2細(xì)胞后用1μg/mL的LPS處理；LPS＋pcDNASORBS2組：將pcDNASORBS2轉(zhuǎn)染至H9c2細(xì)胞后用1μg/mL的LPS處理；LPS＋金銀花高劑量＋siNC組：將siNC、siSORBS2轉(zhuǎn)染至H9c2細(xì)胞后用1μg/mL的LPS和500μg/mL的金銀花提取物處理；LPS＋金銀花高劑量＋siSORBS2組：將siSORBS2轉(zhuǎn)染至H9c2細(xì)胞后用1μg/mL的LPS和500μg/mL的金銀花提取物處理。

1.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

收集細(xì)胞，按試劑盒說明操作，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.4蛋白免疫印記（WesternBlot）法檢測蛋白表達(dá)

提取總蛋白，行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），轉(zhuǎn)膜、封閉，分別加一抗和二抗孵育2h，加增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑（enhancedchemiluminescence，ECL）顯色，暗室顯影、定影；分析蛋白條帶灰度值，計(jì)算蛋白的相對表達(dá)量。

1.5細(xì)胞SOD活性、MDA含量和LDH活性檢測

收集培養(yǎng)48h各組細(xì)胞上清液，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.6ELISA檢測TNFα、IL1、IL6水平

收集培養(yǎng)48h各組細(xì)胞上清，具體按照試劑盒操作進(jìn)行檢測。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS20.0軟件進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著差異法（LSD）t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1金銀花提取物對LPS處理的H9c2凋亡的影響

與Con組相比，LPS組H9c2細(xì)胞凋亡率升高，SORBS2蛋白表達(dá)水平下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與LPS組相比，LPS＋金銀花低劑量組、中劑量組、高劑量組H9c2細(xì)胞凋亡率降低，SORBS2蛋白表達(dá)水平升高，且呈濃度依賴性（P＜0.05）。詳見圖1～圖4。

2.2金銀花提取物對LPS處理的H9c2中氧化應(yīng)激的影響

與Con組相比，LPS組H9c2細(xì)胞中SOD活性降低，MDA含量、LDH活性升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與LPS組相比，LPS＋金銀花低劑量組、中劑量組、高劑量組MDA含量、LDH活性降低，SOD活性升高，且呈濃度依賴性（P＜0.05）。詳見表1。

2.3金銀花提取物對LPS處理的H9c2中炎性因子的影響

與Con組相比，LPS組TNFα、IL1、IL6水平升高（P＜0.05）；與LPS組相比，LPS＋金銀花低劑量組、中劑量組、高劑量組TNFα、IL1、IL6水平下降，且呈濃度依賴性（P＜0.05）。詳見表2。

2.4ORBS2對LPS處理的H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎性因子的影響

與LPS組和LPS＋pcDNA組相比，LPS＋pcDNASORBS2組細(xì)胞凋亡率、MDA含量、LDH活性降低，SORBS2蛋白表達(dá)水平、SOD活性升高，TNFα、IL1、IL6水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表3、圖5～圖8。

2.5敲除SORBS2對金銀花作用的H9c2凋亡和氧化應(yīng)激的影響

與LPS＋金銀花高劑量＋siNC組相比，LPS＋金銀花高劑量＋siSORBS2組H9c2細(xì)胞凋亡率升高，SORBS2蛋白表達(dá)水平降低，SOD活性降低，MDA含量、LDH活性升高（P＜0.05）。詳見表4、圖9～圖12。

2.6敲除SORBS2對金銀花作用于H9c2炎性因子的影響

與LPS＋金銀花高劑量＋siNC組相比，LPS＋金銀花高劑量＋siSORBS2組H9c2細(xì)胞中TNFα、IL1、IL6水平升高（P＜0.05）。詳見表5。

3討論

心血管疾病是危害健康的重要疾病，氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)在心血管疾病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用［1112］。研究顯示，中藥具有多靶點(diǎn)效應(yīng)，通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等發(fā)揮保護(hù)心肌的作用［13］。有研究報(bào)道，金銀花提取物可通過降低肺泡灌洗液中促炎細(xì)胞因子IL1、IL6和TNFα的釋放和減輕組織臟器的損傷，對LPS誘導(dǎo)的急性呼吸窘迫綜合征大鼠具有顯著的保護(hù)作用［14］。金銀花提取物通過抑制小鼠的肝星狀細(xì)胞激活，逆轉(zhuǎn)上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）并通過誘導(dǎo)Nrf2激活減少肝臟損傷，從而減輕小鼠肝纖維化［15］。金銀花提取物可通過激活磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/核因子κB（NFκB）信號通路來抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)［16］。本研究通過建立心肌細(xì)胞損傷模型，用不同劑量金銀花提取物處理，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡率、MDA含量、LDH活性、TNFα、IL1、IL6水平降低，SORBS2蛋白表達(dá)水平、SOD活性升高，且呈濃度依賴性，表明金銀花提取物能抑制LPS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷。

有研究顯示，SORBS2在心肌梗死病人組織中表現(xiàn)出異常降低［17］。LncRNAH19通過調(diào)節(jié)miR935p/SORBS2軸來抑制敗血癥誘導(dǎo)的心肌損傷的進(jìn)展［18］。本研究顯示，LPS誘導(dǎo)可降低心肌細(xì)胞中SORBS2蛋白表達(dá)，過表達(dá)SORBS2可降低LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡率、氧化應(yīng)激及炎性因子水平。金銀花提取物可提高SORBS2的表達(dá)，而敲除SORBS2逆轉(zhuǎn)了金銀花提取物對LPS致心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的作用。

綜上所述，金銀花提取物可通過增加SORBS2減輕LPS致心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激、凋亡和炎癥反應(yīng)。

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（收稿日期：20220921）

（本文編輯郭懷?。?/p>

作者單位1.河北省保定市第一醫(yī)院（河北保定071000），Email：yoyonaa@126.com；2.河北省保定市清苑區(qū)人民醫(yī)院

引用信息初毅，代寧，曹艷杰.金銀花提取物對脂多糖致心肌細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（6）：10271032.