黃建明 劉滴 金道群 朱定君

摘要 目的： 探討苦瓜皂苷L對內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）增殖能力和內(nèi)皮功能的作用及機(jī)制。 方法： 體外分離、培養(yǎng)、鑒定外周血EPC。使用不同濃度苦瓜皂苷L處理EPC 24 h后，應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK.8）法檢測各組細(xì)胞活力。使用AutoDock Tools 5.6軟件，分別以磷脂酰肌醇3.激酶（PI3K）和蛋白激酶B（AKT）為受體， 以藥物分子苦瓜皂苷L為配體采用盲對接法進(jìn)行分子對接。使用PI3K/AKT 抑制劑LY294002和最佳使用濃度的苦瓜皂苷L單獨(dú)或同時(shí)處理EPC 24 h后檢測各組細(xì)胞活力和磷酸化PI3K（p.PI3K）、磷酸化AKT（p.AKT）及磷酸化內(nèi)皮型一氧化氮合酶（p.eNOS）表達(dá)水平。 結(jié)果： 與對照組比較，苦瓜皂苷L呈劑量依賴性地促進(jìn)EPC增殖，且40 μmol/L的苦瓜皂苷L是最佳藥物濃度。與對照組比較，LY294002可下調(diào)EPC細(xì)胞活力，苦瓜皂苷L可上調(diào)細(xì)胞活力。與苦瓜皂苷L組比較，共同使用苦瓜皂苷L和LY294002可降低細(xì)胞活力。分子對接結(jié)果顯示，苦瓜皂苷L與PI3K和AKT均存在直接作用，形成穩(wěn)定的鎖鑰結(jié)構(gòu)。與對照組比較，LY294002可顯著下調(diào)p.PI3K、p.AKT和 p.eNOS蛋白水平；苦瓜皂苷L可上調(diào)p.PI3K、 p.AKT和p.eNOS蛋白水平。與苦瓜皂苷L組比較，使用苦瓜皂苷L和LY294002可降低p.PI3K、p.AKT和p.eNOS蛋白水平。 結(jié)論： 苦瓜皂苷L通過PI3K/AKT信號通路靶向調(diào)節(jié)EPC的增殖能力，進(jìn)而上調(diào)內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）活化水平以促進(jìn)EPC內(nèi)皮功能。

關(guān)鍵詞 ?內(nèi)皮祖細(xì)胞；苦瓜皂苷L；細(xì)胞增殖；內(nèi)皮功能；實(shí)驗(yàn)研究

doi： ?10.12102/j.issn.1672.1349.2024.10.006

Experimental Study on the Regulation of PI3K/AKT Pathway by Momordicoside L ?Promoting Endothelial Progenitor Cell Proliferation and Endothelial Function

HUANG Jianming， LIU Di， JIN Daoqun， ZHU Dingjun

Huangshi Central Hospital， Affiliated Hospital of Hubei Polytechnic University， Huangshi 435000， Hubei， China

Corresponding Author ?ZHU Dingjun， E.mail： djzhu2005@163.com

Abstract Objective： To explore the effect of Momordicoside L on endothelial progenitor cells（EPC） proliferation and endothelial function and its mechanism. ?Methods： Peripheral blood EPCs were isolated，cultured，and identified in vitro.After EPC was treated with different concentrations of Momordicoside L for 24 h，cell viability was detected by cell count（CCK.8）.By AutoDock Tools 5.6 software，the molecular docking was performed by blind docking method with phosphatidylinositol 3.kinase（PI3K） and protein kinase B（AKT） as receptors，and the drug molecule Momordicoside L as ligand.The cell viability and the expressions of phosphorylated PI3K（p.PI3K），phosphorylated AKT（p.AKT） and phosphorylated endothelial nitric oxide synthase（p.eNOS） in each group were detected，when EPC was treated with PI3K/AKT inhibitor LY294002 and the optimal concentration of Momordicoside L alone or simultaneously for 24 h. ?Results： Compared with control group，Momordicoside L could promote EPC proliferation in a dose.dependent manner，and 40 μmol/L was the optimal concentration.Compared with the control group，LY294002 could down.regulate EPC cell viability，and Momordicoside L could up.regulate EPC cell viability.Compared with Momordicoside L group，the co.administration of Momordicoside L and LY294002 decreased cell viability.Molecular docking results showed that Momordicoside L had direct interaction with PI3K and AKT，and could form a stable lock key structure.Compared with the control group，LY294002 significantly down.regulated the protein levels of p.PI3K，p.AKT and p.eNOS.Momordicoside L up.regulated the protein levels of p.PI3K，p.AKT and p.eNOS. Compared with the Momordicoside L ?group，the administration of Momordicoside L and LY294002 decreased the protein levels of p.PI3K，p.AKT and p.eNOS. ?Conclusion： Momordicoside L could regulate the proliferation ability of EPC through the PI3K/AKT signaling pathway，and then up.regulate the activation level of endothelial nitric oxide synthase（eNOS） to promote endothelial function of EPC.

Keywords ?endothelial progenitor cells; Momordicoside L; cell proliferation; endothelial function; experimental study

內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cell，EPC）是 起源于骨髓的多能干細(xì)胞，可定向分化為內(nèi)皮細(xì)胞，參與血管生成和損傷修復(fù) ?［1］ 。已證實(shí)在糖尿病、高血壓、冠心病等慢性疾病中EPC水平下降，且功能受損 ?［2.4］ 。Schmidt.Lucke等 ?［5］ 研究顯示，與穩(wěn)定性冠心病病人比較，急性冠脈綜合征病人循環(huán)血EPC數(shù)量顯著減少，提示心血管急性缺血性事件的發(fā)生可能與EPC的數(shù)量呈負(fù)相關(guān)。本研究團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，與絕經(jīng)前女性組比較，絕經(jīng)后女性血清雌二醇水平與外周血EPC數(shù)量均明顯降低，這可能是女性絕經(jīng)后心血管病風(fēng)險(xiǎn)升高的危險(xiǎn)因素之一 ?［6］ 。目前尚無安全的治療措施顯著升高外周循環(huán)中EPC水平?？喙显碥誏是苦瓜總皂苷的主要活性成分，具有抗炎、降糖、調(diào)脂的作用，可能成為預(yù)防糖尿病、高血壓及高脂血癥的膳食補(bǔ)劑。有研究顯示，苦瓜皂苷L對細(xì)胞增殖、分化、遷移具有較好的作用 ?［7.8］ 。然而，苦瓜皂苷L對EPC增殖能力的影響研究較少。本研究結(jié)合生物信息學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)綜合探討苦瓜皂苷L對EPC增殖能力和內(nèi)皮功能的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

苦瓜皂苷L（T10N8Z47950）購自上海源葉生物科技有限公司；內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基（ECM，中喬新舟公司）；人纖維連接蛋白（Millipore Chemicon公司）；Dil標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍祝╝c.LDL.Dil，Sigma公司）；圖譜FITC標(biāo)記的荊豆凝集素Ⅰ（FITC.UEA.Ⅰ，Sigma公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（CCK.8，Dojindo公司）；二甲基亞砜（DMSO，碧云天公司）；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS.PAGE）試劑盒（塞維爾公司）；磷酸化磷脂酰肌醇3.激酶（p.PI3K，#17366）、 磷酸化蛋白激酶B（p.AKT，#4060）、磷酸化內(nèi)皮型一氧化氮合酶 （p.eNOS）（#9570）均購自Cell Signaling Technology公司。

1.2 EPC培養(yǎng)及鑒定

本研究團(tuán)隊(duì)前期已從兔 外周血中分離得到EPC，本次實(shí)驗(yàn)繼續(xù)培養(yǎng)EPC并采用FITC.UEA.Ⅰ和ac.LDL.Dil 雙染法鑒定EPC純度 ?［9］ 。使用ac.LDL.Dil（10 μg/mL）于37 ℃下孵育細(xì)胞1 h后，使用2%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，使用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗3次。加入FITC.UEA.Ⅰ（10 g/mL）于37 ℃孵育1 h后，使用PBS清洗3次以減少假陽性。使用激光共聚焦顯微鏡分別激發(fā)綠色熒光（波長477 nm）和紅色熒光（波長543 mm），并保存照片。

1.3 細(xì)胞分組及處理

首先將貼壁的EPC隨機(jī)分為6組（對照組及不同濃度的苦瓜皂苷L組），以每孔1×10 4的密度均勻鋪于96孔板上，每組5個(gè)復(fù)孔。24 h后，分別使用0.1%DMSO和不同濃度的苦瓜皂苷L孵育24 h，檢測苦瓜皂苷L對EPC活力的影響。將貼壁的EPC隨機(jī)分為4組，分別以每孔1×10 4和5×10 5的密度均勻鋪于96孔板和6孔板。24 h后，分別使用DMSO（對照組）、磷脂酰肌醇3.激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）抑制劑LY294002（LY294002組）、苦瓜皂苷L（苦瓜皂苷L組）及苦瓜皂苷L＋LY294002（苦瓜皂苷L＋LY294002組）孵育24 h，進(jìn)行細(xì)胞活力檢測和分子學(xué)分析。

1.4 增殖能力檢測

使用CCK.8測定細(xì)胞增殖能力，操作步驟按照說明書進(jìn)行。于96孔板細(xì)胞孔內(nèi)每孔勻速加入10 μL CCK.8試劑，于37 ℃、5%CO 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 h后，使用酶標(biāo)儀于490 nm波長條件下檢測OD值。

1.5 生物信息學(xué)預(yù)測

使用AutoDock Tools 5.6軟件工具，分別以PI3K和AKT為受體，以藥物分子苦瓜皂苷L為配體采用盲對接法進(jìn)行分子對接。根據(jù)蛋白活性口袋設(shè)置對接盒子坐標(biāo)和大小，進(jìn)行分子對接，其他按軟件默認(rèn)設(shè)置，最終得到結(jié)合構(gòu)象文件和結(jié)合能，并通過PyMOL 1.8軟件和Ligplot＋1.4對接構(gòu)象進(jìn)行可視化分析，得到相應(yīng)的三維和二維結(jié)構(gòu)圖。

1.6 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測

使用RIPA緩沖液、磷酸酶抑制劑A/B、苯甲基磺酰氟（PMSF）處理細(xì)胞30 min后于低溫高速離心機(jī)下以14 000 r/min條件離心10 min，取上層澄清液體，測量蛋白濃度。將細(xì)胞裂解物于金屬浴鍋內(nèi)以95 ℃變性10 min后，于－20 ℃冷藏保存。使用SDS.PAGE試劑盒分別配置分離膠及濃縮膠，經(jīng)上樣、電泳后，使用濕法轉(zhuǎn)膜將蛋白印跡轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。 將膜浸泡在封閉液內(nèi)于室溫下封閉1 h后，使用TBST清洗3次。分別使用p.PI3K、p.AKT、p.eNOS一抗以1∶1 000 比例與一抗稀釋液配制成液體，將膜浸泡于相應(yīng)的抗體液中，于4 ℃條件下?lián)u床內(nèi)孵育過夜。將已孵育好一抗的膜取出后清洗3次，于室溫下孵育二抗2 h。于避光條件下，使用化學(xué)發(fā)光試劑浸潤膜后于顯影儀器下進(jìn)行顯像。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x ?± s ）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用LSD法分析。以 P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 EPC的染色及鑒定結(jié)果

使用ac.LDL.Dil和FITC.UEA.Ⅰ雙染色鑒定分離培養(yǎng)的EPC，詳見圖1。其中綠色熒光代表EPC與凝集素結(jié)合，紅色熒光代表EPC攝取ac.LDL.Dil后，橙色熒光為雙染色陽性的EPC，陽性率達(dá)95%以上。

2.2 苦瓜皂苷L對EPC細(xì)胞增殖能力的影響

苦瓜皂苷L的結(jié)構(gòu)分子式詳見圖2。檢測不同劑量苦瓜皂苷L對EPC細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示，苦瓜皂苷L可顯著提高細(xì)胞活力，提示細(xì)胞增殖或功能顯著上調(diào)，且作用呈劑量依賴性，詳見圖3。當(dāng)苦瓜皂苷L濃度為40 μmol/L時(shí)上調(diào)細(xì)胞活力的效果最佳，因此，選擇該濃度為后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用濃度。為探討苦瓜皂苷L發(fā)揮作用的具體機(jī)制，進(jìn)一步使用LY294002作為PI3K/AKT抑制劑，結(jié)果顯示，與對照組比較，LY294002處理EPC后可顯著下調(diào)細(xì)胞活力，苦瓜皂苷L可顯著上調(diào)細(xì)胞活力。與單獨(dú)使用苦瓜皂苷L比較，共同使用苦瓜皂苷L和LY294002可降低苦瓜皂苷L對細(xì)胞活力的影響。詳見圖4。結(jié)果提示， 苦瓜皂苷L可有效促進(jìn)EPC活力，其作用可能與PI3K/AKT 信號通路激活有關(guān)。

2.3 苦瓜皂苷L與PI3K、AKT的分子對接結(jié)果

使用生物信息學(xué)技術(shù)分析苦瓜皂苷L與PI3K、AKT之間的關(guān)系，明確作用靶點(diǎn)?？喙显碥誏與PI3K和AKT均可靶向結(jié)合，并形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的鎖鑰結(jié)構(gòu)，詳見圖5。提示其可靶向作用于PI3K和AKT。

2.4 苦瓜皂苷L對PI3K、AKT、eNOS的表達(dá)影響

為進(jìn)一步明確苦瓜皂苷L對PI3K/AKT信號通路的作用機(jī)制，采用Western Blot檢測PI3K、AKT及eNOS的磷酸化活化形式。與對照組比較，LY294002處理可下調(diào)p.PI3K、p.AKT 及p.eNOS水平，苦瓜皂苷L 處理可上調(diào)p.PI3K、p.AKT及p.eNOS水平。與單獨(dú)使用苦瓜皂苷L比較，同時(shí)使用苦瓜皂苷L和LY294002處理EPC將降低細(xì)胞活力。詳見圖6。上述結(jié)果提示，苦瓜皂苷L對EPC活力的影響可能通過PI3K/AKT信號通路發(fā)揮作用。

3 討 論

高血壓、糖尿病、高脂血癥及缺血性心肌病等急慢性疾病早期均導(dǎo)致內(nèi)皮損傷或功能失調(diào)，進(jìn)而影響臟器功能 ?［10］ 。EPC已證實(shí)是內(nèi)皮修復(fù)和血管新生的關(guān)鍵因素，升高特定人群的EPC水平可能成為心血管疾病病人的防治措施 ?［11］ 。EPC增殖能力及其功能水平與細(xì)胞活力密切相關(guān)，促進(jìn)其增殖水平和細(xì)胞功能可顯著減少心血管不良事件的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，苦瓜皂苷L可有效促進(jìn)EPC增殖，通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)苦瓜皂苷L可靶向結(jié)合PI3K和AKT，促進(jìn)兩者的磷酸化，進(jìn)而激活下游信號分子eNOS活化水平升高。結(jié)果提示：苦瓜皂苷L通過PI3K/AKT信號通路靶向調(diào)節(jié)EPC的增殖能力并上調(diào)eNOS活化水平促進(jìn)內(nèi)皮功能。

苦瓜（momordica charantia L.）作為一種草本植物已被食用、藥用近千年，既往中醫(yī)認(rèn)為其具有祛暑退熱、明目、解毒等功能，現(xiàn)代研究顯示，其具有降糖、降脂、抗炎、抗?jié)兗翱鼓[瘤等多種功效 ?［12.13］ 。隨著對其藥理學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，目前已鑒定出苦瓜的生物活性成分包括三萜類化合物、皂苷、多肽、類黃酮及生物堿等 ?［14］ ?？喙显碥誏主要存在于苦瓜根莖和果實(shí)中，是苦瓜皂苷類主要的葫蘆烷型三萜類化合物。既往研究顯示，苦瓜皂苷L可顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖 能力，提高細(xì)胞活性 ?［15］ 。本研究證實(shí)了苦瓜皂苷L經(jīng)PI3K/AKT 信號通路促進(jìn)EPC的增殖能力，其可上調(diào)eNOS水平，進(jìn)而增強(qiáng)EPC細(xì)胞功能。苦瓜皂苷L可能成為升高EPC水平及功能的治療措施。

PI3K/AKT信號通路已被證實(shí)在細(xì)胞增殖、遷移、細(xì)胞凋亡和血管生成等生理過程中發(fā)揮重要作用 ?［16］ 。PI3K/AKT信號通路在動(dòng)員和改善EPC的功能中發(fā)揮著重要作用 ?［17］ 。Liu等 ?［18］ 研究顯示，趨化因子受體4無論在常氧還是缺氧/復(fù)氧條件下均可促進(jìn)EPC增殖，并抑制細(xì)胞凋亡，上述作用可被PI3K/AKT抑制劑LY294002削弱，提示PI3K/AKT是調(diào)控EPC增殖的關(guān)鍵信號通路。本研究結(jié)果顯示，使用苦瓜皂苷L可上調(diào)EPC的細(xì)胞活力， 使用LY294002可削弱苦瓜皂苷L 的促增殖作用，提示苦瓜皂苷L的促增殖作用可能依賴PI3K/AKT信號通路；生物信息學(xué)分析預(yù)測了其具有靶向調(diào)節(jié)PI3K和AKT的能力，進(jìn)一步分子生物學(xué)分析證實(shí)了其作用依賴于PI3K/AKT信號通路的磷酸化激活。既往研究證明，激活PI3K/AKT信號通路可誘導(dǎo)下游eNOS磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)EPC的細(xì)胞功能 ?［19］ 。eNOS活化后具有調(diào)節(jié)EPC功能的作用，可催化L.精氨酸生成一氧化氮，參與調(diào)節(jié)血管收縮、舒張等生理作用，還可促進(jìn)血管生成以應(yīng)對組織缺血 ?［20］ 。因此，eNOS認(rèn)為是判斷EPC功能的關(guān)鍵指標(biāo)。同時(shí)本研究結(jié)果還顯示，LY294002可抑制PI3K/AKT活性，降低eNOS活化水平，苦瓜皂苷L可顯著上調(diào)eNOS磷酸化水平，且該作用可被LY294002削弱。

綜上所述，苦瓜皂苷L通過PI3K/AKT信號通路靶向調(diào)節(jié)EPC的增殖能力，進(jìn)而上調(diào)eNOS活化水平以促進(jìn)EPC的內(nèi)皮功能，這些作用可能對血管損傷修復(fù)和血管新生具有重要的臨床意義。

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（收稿日期：2023.02.09）

（本文編輯 薛妮）