楊曉凈 肖婷 曹晨 鄧向群

摘要 目的： 探討微小RNA.200a（miR.200a）對老年糖尿病大鼠心肌的保護(hù)作用及機(jī)制。 方法： 采用高脂飲食＋鏈脲菌素（STZ）誘導(dǎo)大鼠糖尿病心肌病模型，分為對照組和STZ組。通過注射攜帶miR.200a腺相關(guān)病毒9（AAV9）在心肌內(nèi)過表達(dá)miR.200a，分為對照＋AAV9.control組、對照＋AAV9.miR.200a組、STZ＋AAV9.control組、STZ＋AAV9.miR.200a組，每組8只。體外培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞H9c2，分為對照組（5.5 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)24 h）、高糖＋AAV9.control＋si RNA組（轉(zhuǎn)染AAV9.control和si RNA 48 h后用33 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)24 h）、高糖＋AAV9.control＋si核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）組（轉(zhuǎn)染AAV9.control和si Nrf2 48 h后使用33 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)24 h）、高糖＋AAV9.miR.200a＋siRNA組（轉(zhuǎn)染AAV9.miR.200a和si RNA 48 h后 用33 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)24 h）、 高糖＋AAV9.miR.200a ＋si Nrf 2組（轉(zhuǎn)染AAV9.miR.200a和si Nrf2 48 h后用33 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)24 h）。使用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒檢測超氧化物歧化酶（SOD）、肌酸激酶同工酶（CK.MB）、乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛（MDA）含量；實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測miR.200a表達(dá)水平，蛋白免疫印跡法檢測相關(guān)蛋白表達(dá)水平；2′，7′.二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH.DA）染色檢測細(xì)胞活性氧（ROS）水平；免疫熒光檢測Nrf2表達(dá)。 結(jié)果： 與對照組比較，STZ組心肌組織miR.200a表達(dá)下調(diào)（ P ＜0.05）。與對照＋AAV9.control組比較，STZ＋AAV9.control組心肌組織LDH、CK.MB、MDA水平升高，SOD水平、血紅素氧化酶1（HO.1）、細(xì)胞核Nrf2蛋白、細(xì)胞質(zhì)Nrf2蛋白表達(dá)及Nrf2熒光密度降低（ P ＜0.05）。與STZ＋AAV9.control 組比較，STZ＋AAV9.miR.200a組心肌組織LDH、CK.MB、 MDA水平及TUNEL陽性細(xì)胞率降低，SOD水平、HO.1、細(xì)胞核Nrf2蛋白、細(xì)胞質(zhì)Nrf2蛋白表達(dá)及Nrf2熒光密度升高（ P ＜0.05）。高糖處理可降低H9c2細(xì)胞存活率，提高ROS、MDA、LDH水平（ P ＜0.05）；在此基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染miR.200a后上述指標(biāo)被抑制；同時轉(zhuǎn)染miR.200a和si Nrf2后，ROS、MDA、LDH升高，細(xì)胞存活率降低（ P ＜0.05）。 結(jié)論： miR.200a提高Nrf2表達(dá)從而減輕高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡，這一效應(yīng)與Nrf2核易位的促進(jìn)及下游抗氧化應(yīng)激信號有關(guān)。

關(guān)鍵詞 ?糖尿病心肌??；微小RNA.200a；核因子E2相關(guān)因子2；氧化應(yīng)激；大鼠；實(shí)驗(yàn)研究

doi： ?10.12102/j.issn.1672.1349.2024.10.008

Protective Effect of miR.200a on Myocardium of Elderly Diabetic Cardiomyopathy Rats by Up.regulating Nrf2

YANG Xiaojing， XIAO Ting， CAO Chen， DENG Xiangqun

Wuhan Third Hospital， Wuhan 430000， Hubei， China

Corresponding Author ?DENG Xiangqun， E.mail： dengxiangqun@hotmail.com

Abstract Objective： To investigate the protective effect of microRNA.200a（miR.200a） on myocardium of elderly diabetic rats and its mechanism. ?Methods： The rats diabetic cardiomyopathy model was induced by high.fat diet＋streptococcin（STZ） and divided into control group and STZ group.miR.200a was overexpressed in myocardium by injecting miR.200a.carrying adeno.associated virus 9（AAV9），which was divided into control＋AAV9.control group，control＋AAV9.miR.200a group，STZ＋AAV9.control group，and STZ＋AAV9.miR.200a group，with 8 rats in each group.The cardiomyocytes H9c2 of rats were cultured in vitro and divided into control group（5.5 mmol/L glucose for 24 h），high glucose＋AAV9.control＋si RNA group（transfected with AAV9.control and si RNA for 48 h and then cultured with 33 mmol/L glucose for 24 h），high glucose＋AAV9.control＋si nuclear factor E2.related factor 2（Nrf2） group（ transfected with AAV9.control and si Nrf2 for 48 h and incubated with 33 mmol/L glucose for 24 h），high glucose＋AAV9.miR.200a＋si RNA group（transfected with AAV9.miR.200a and si RNA for 48 h and incubated with 33 mmol/L ?glucose for 24 h），high glucose＋AAV9.miR.200a＋si ?Nrf2 group（transfected with AAV9.miR.200a and si Nrf2 for 48 h and then incubated with 33 mmol/L glucose for 24 h）.The levels of superoxide dismutase（SOD），creatine kinase isoenzyme（CK.MB），lactate dehydrogenase（LDH），and malondialdehyde（MDA） were detected using enzyme.linked immunosorbent assay（ELISA）.miR.200a expression was detected by real.time fluorescence quantitative polymerase chain reaction（PCR）.The protein expression was detected by immunoblotting.The level of reactive oxygen species（ROS） was detected by staining with 2′，7′.dichlorodihydrofluorescein diacetate（DCFH.DA），and Nrf2 expression was detected by immunofluorescence. ?Results： Compared with the control group，miR.200a expression of myocardial tissue downregulated in the STZ group（ P ＜0.05）.Compared with the control＋AAV9.control group，levels of LDH，CK.MB，and MDA in the STZ＋AAV9.control group were significantly higher，and SOD，heme oxidase.1（HO.1），cytosolic Nrf2 protein，cytoplasmic Nrf2 protein expression，and Nrf2 fluorescence density were significantly lower（ P ＜0.05）.Compared with the STZ＋AAV9.control group，levels of LDH，CK.MB，MDA and TUNEL.positive cell rate were significantly lower in the STZ＋AAV9.miR.200a group，and SOD，HO.1，cytosolic Nrf2 protein，cytoplasmic Nrf2 protein expression and Nrf2 fluorescence density were significantly higher（ P ＜0.05）.High.glucose treatment could decrease the survival rate of H9c2 cells and increase the levels of ROS，MDA，and LDH（ P ＜0.05）.The levels of the above indexes were opposite expressed after transfection of miR.200a.The simultaneous transfection of miR.200a and si Nrf2 resulted in the elevation of ROS，MDA，and LDH，and the decrease of cell survival rate（ P ＜0.05）. ?Conclusion： miR.200a enhanced Nrf2 expression to attenuate oxidative stress and apoptosis induced by high glucose，which was related to the promotion of Nrf2 nuclear translocation and its downstream anti.oxidative stress signal pathway.

Keywords ?diabetic cardiomyopathy; microRNA.200a; nuclear factor E2 related factor 2; oxidative stress; rats; experimental study

老年糖尿病性心肌病（elderly diabetic ?cardiomyopathy， EDC）是糖尿病嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，也是老年人的常見病和多發(fā)病，以糖尿病病人心臟結(jié)構(gòu)和功能障礙為特征 ?［1］ 。EDC是糖尿病病人死亡的主要原因，目前尚無有效的策略預(yù)防糖尿病的發(fā)展。EDC的發(fā)病機(jī)制涉及多因素，如氧化應(yīng)激、自噬和焦亡等 ?［2］ 。有研究表明，心肌細(xì)胞損傷誘發(fā)的氧化應(yīng)激是EDC病理生理過程的主要因素 ?［3］ 。高血糖、游離脂肪酸和糖基化終產(chǎn)物導(dǎo)致活性氧（reactive oxygen species，ROS）過度釋放，被認(rèn)為是EDC心肌結(jié)構(gòu)和功能損傷的關(guān)鍵 病理信號 ?［4］ 。因此，減輕氧化應(yīng)激可能是預(yù)防EDC的治療策略。

微?。╩icro）RNA是高度保守可翻譯后修飾mRNA的單鏈非編碼RNA。miRNA失調(diào)與高糖引起的心臟毒性有關(guān) ?［5］ 。一項(xiàng)研究表明，miR.200a通過靶向神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的叉頭框蛋白A1（FOXA1）抑制腫瘤 ?［6］ 。miR.200a可減輕氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌壞死 ?［7］ 。核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）是調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的關(guān)鍵分子，Nrf2從Keap1釋放并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核以調(diào)節(jié)抗氧化劑基因，抑制ROS產(chǎn)生 ?［8］ 。有研究表明，miR.200a通過靶向Keap1 mRNA導(dǎo)致Nrf2激活并促進(jìn)糖尿病病人Keap1 mRNA降解 ?［9］ 。有研究表明，血紅素氧化酶1（heme oxidase.1，HO.1）與糖尿病密切相關(guān)，其作為Nrf2的下游基因之一，不僅可催化體內(nèi)血紅素的降解，而且參與細(xì)胞信號傳導(dǎo)、炎癥反應(yīng)和對抗氧化應(yīng)激的過程，Nrf2通過調(diào)控HO.1表達(dá)，在抗氧化應(yīng)激及抗炎中發(fā)揮重要作用 ?［10］ 。鑒于miR.200a具有調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的功能，miR.200a在EDC中作用的研究報(bào)道較少。本研究通過構(gòu)建糖尿病心肌病大鼠模型，觀察miR.200a對疾病的影響并探討可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大鼠心肌細(xì)胞系H9c2購自American Type Culture Collection 公司，miR.200a腺相關(guān)病毒（AAV9）購自上海典君生物公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)（CCK）.8試劑盒購自Solarbio公司，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶dUTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Roche公司，鏈脲佐菌素（STZ）購自Sigma.Aldrich 公司，二氫乙錠（DHE）購自武漢塞維爾生物有限公司，杜氏改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）、胎牛血清、胰蛋白酶購自GIBICO公司，超氧化物歧化酶（SOD）、肌酸激酶同工酶（CK.MB）、丙二醛（MDA）購自上海碧云天公司，所有一抗均購自Abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物及分組

選取老年雄性SD大鼠，18～20周齡。將大鼠隨機(jī)分為對照組、STZ組，各16只。STZ組大鼠尾靜脈注射STZ（65 mg/kg）構(gòu)建糖尿病心肌病模型，對照組大鼠注射等量檸檬酸鹽緩沖液。STZ組大鼠 隨機(jī)分成兩組，各8只，分別在注射STZ前1周尾靜脈注射1×10 ?12 ?病毒拷貝量的AAV9.miRscramble（AAV9.control）或AAV9.miR.200a， 作為STZ＋AAV9.control組、STZ＋ AAV9.miR.200a組；對照組大鼠隨機(jī)分為兩組，各8只，分別在注射檸檬酸鹽緩沖液的1周前尾靜脈注射 1×10 ?12 病毒拷貝量的AAV9.control或AAV9.miR.200a， 作為對照＋AAV9.control組、對照＋AAV9.miR.200a組。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組干預(yù)

H9c2細(xì)胞在含有10%胎牛血清、1%青霉素.鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃溫度、95%濕度和5% CO 2中培養(yǎng)。H9c2細(xì)胞接種至6孔板，每孔1×10 4細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)48 h 后，將細(xì)胞分為對照組（5.5 mmol/L 葡萄糖培養(yǎng)24 h）、高糖＋AAV9.control＋si RNA組（轉(zhuǎn)染AAV9.control和si RNA 48 h后用33 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)24 h）、高糖＋AAV9.control＋si Nrf2組（轉(zhuǎn)染AAV9.control和si Nrf2 48 h后用33 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)24 h）、高糖＋AAV9.miR.200a＋si RNA組（轉(zhuǎn)染AAV9.miR.200a和si RNA 48 h后用33 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)24 h）、高糖＋AAV9.miR.200a ＋si Nrf2組（轉(zhuǎn)染AAV9.miR.200a和si Nrf2 48 h后用33 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)24 h）。

1.4 ?逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT.qPCR）

從心臟組織和各組H9c2細(xì)胞中提取總RNA。TRIzol（TaKaRa Bio，Inc.）并通過PrimeScript ?TM 轉(zhuǎn)化為cDNART預(yù)混液。使用SYBR Green PCT Master Mix（TaKaRa Bio，Inc.）的Biosystems Prism 7000檢測miR.200a表達(dá)水平。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測

收集1.2中各組大鼠心肌組織及1.3中各組H9c2細(xì)胞，按照ELISA試劑盒說明書方法檢測心肌組織LDH、CK.MB、MDA、SOD水平及H9c2細(xì)胞MDA、LDH水平。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測

采用TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡，在熒光顯微鏡下觀察切片凋亡細(xì)胞核占總數(shù)百分比，每張切片選取5個隨機(jī)區(qū)域進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 蛋白免疫印跡法（Western Blot）

將大鼠心肌組織按照蛋白提取試劑盒操作說明提取蛋白并定量。將提取后的蛋白進(jìn)行上樣，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后加入一抗。過夜孵育加入二抗后采用電化學(xué)發(fā)光（ECL）法顯色，檢測HO.1、Nrf2表達(dá)。

1.8 免疫熒光染色

大鼠心肌石蠟包埋，二甲苯脫蠟，乙醇梯度脫水?？乖?00 ℃下修復(fù)10 min，切片在37 ℃下用正常山羊血清 （1∶50）滲透并阻斷1 h。切片用Nrf2一抗在4 ℃ 下孵育過夜。將相應(yīng)的辣根酶標(biāo)記的IgG在37 ℃孵育1 h，4′6.二脒基.2.苯基吲哚（DAPI）原液在室溫下孵育10 min，倒置熒光顯微鏡下觀察Nrf2的表達(dá)情況。

1.9 CCK.8試劑盒檢測細(xì)胞活力

H9c2細(xì)胞以每孔5×10 3個細(xì)胞密度接種在96孔板中；之后轉(zhuǎn)染和48 h處理，加入10 μL CCK.8溶液孵育2 h后，450 nm下測定吸光度。

1.10 ROS檢測

37 ℃下通過二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH.DA，10 μmol/L）染色30 min，計(jì)算DCFH.DA熒光強(qiáng)度測定H9c2細(xì)胞ROS水平。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x ?± s ）表示，采用單因素方差分析（one.way ANOVA），組間比較采用SNK. q 檢驗(yàn)。以 P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR.200a在高糖刺激下表達(dá)情況

與0 h比較，高糖刺激H9c2細(xì) 胞miR.200a表達(dá)水平隨著時間的延長而下降，且12、24、48 h的miR.200a 表 達(dá)水平降低（ P ＜0.05）。STZ組心肌組織miR.200a ?表達(dá) 水平較對照組下調(diào)（ P ＜0.05）。詳見圖1。

2.2 miR.200a減輕糖尿病心肌病大鼠的心肌損傷

與對照＋AAV9.control組比較，STZ＋AAV9.control 組心肌組織LDH、CK.MB、MDA水平升高，SOD水平降低（ P ＜0.05）。 與STZ＋AAV9.control組比較，STZ＋ AAV9.miR.200a組心肌組織LDH、CK.MB、MDA水平及 TUNEL陽性細(xì)胞率降低，SOD水平升高（ P ＜0.05）。 詳見圖2。

2.3 miR.200a激活Nrf2信號

與對照＋AAV9.control組比較，STZ＋AAV9.control 組心肌組織HO.1、細(xì)胞核Nrf2蛋白、細(xì)胞質(zhì)Nrf2蛋白表達(dá)及Nrf2熒光密度降低（ P ＜0.05）。與STZ＋AAV9.control組比較，STZ＋AAV9.miR.200a組心肌組織HO.1、細(xì)胞核Nrf2蛋白、細(xì)胞質(zhì)Nrf2蛋白表達(dá)及Nrf2熒光密度升高（ P ＜0.05）。詳見圖3。

2.4 miR.200a通過Nrf2發(fā)揮對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用

與對照組比較，高糖＋AAV9.control＋si RNA組ROS、MDA、LDH升高，細(xì)胞存活率降低（ P ＜0.05）；與高糖＋AAV9.control＋si RNA組比較，高糖＋AAV9.control＋si Nrf2組ROS、MDA、LDH升高，細(xì)胞存活率降低（ P ＜0.05），高糖＋AAV9.miR.200a＋si RNA組ROS、MDA、LDH降低，細(xì)胞存活率升高（ P ＜0.05）；與高糖＋AAV9.miR.200a＋si RNA組比較，高糖＋AAV9.miR.200a ＋si Nrf2組ROS、MDA、LDH升高，細(xì)胞存活率降低（ P ＜0.05）。詳見表1、圖4。

3 討 論

高血糖引起的氧化應(yīng)激是導(dǎo)致糖尿病心肌病的關(guān)鍵。STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠表現(xiàn)為心臟功能障礙，隨著促氧化應(yīng)激物的積聚和抗氧化物的降低 ?［11］ 。高血糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激促進(jìn)了心肌細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致心臟功能障礙。通過恢復(fù)Nrf2、HO.1表達(dá)和激活Nrf2核轉(zhuǎn)錄被證實(shí)可顯著減輕高糖誘導(dǎo)的心肌損傷 ?［12］ 。

Nrf2是重要的細(xì)胞抗氧化轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)控下游抗氧化基因表達(dá)，對抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài) ?［13］ 。本研究結(jié)果顯示，心臟Nrf2表達(dá)在糖尿病大鼠心肌組織表達(dá)明顯減少，Nrf2抑制蛋白HO.1表達(dá)減少。Nrf2被廣泛認(rèn)為是抵抗氧化應(yīng)激的保護(hù)性因素，且已證實(shí)糖尿病動物和病人心臟Nrf2表達(dá)降低 ?［14］ 。Nrf2一般與細(xì)胞質(zhì)中關(guān)聯(lián)蛋白1（Keap1）結(jié)合，Keap1主要負(fù)責(zé)Nrf2的泛素化和降解。機(jī)體抵抗氧化應(yīng)激時，Nrf2從Keap1釋放并轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核以調(diào)節(jié)抗氧化劑表達(dá) ?［15］ 。本研究結(jié)果顯示，Nrf2在糖尿病心肌病的心臟組織中表達(dá)降低，伴隨核異位減少?；謴?fù)Nrf2表達(dá)可減輕高糖引起的心臟毒性，因此，靶向調(diào)控Nrf2可作為治療糖尿病心肌病的一種策略。

miRNA是高度保守的單鏈非編碼RNA，通過調(diào)控mRNA參與蛋白的翻譯后修飾。miRNA失調(diào)與多種疾病有關(guān)，包括高糖誘導(dǎo)的心臟毒性 ?［16］ 。有研究表明，miR.200a通過靶向Keap1 mRNA激 活Nrf2，促進(jìn)糖尿病腎病病人Keap1 mRNA降解 ?［17］ 。因此，miR.200a 可能在高糖誘導(dǎo)的心肌損傷中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。在糖尿病心肌病大鼠中，通過AAV9過表達(dá)miR.200a觀察miR.200a對心肌細(xì)胞氧化損傷和凋亡的影響，探討miR.200a在糖尿病心肌病中的作用。本研究結(jié)果顯示，miR.200a在糖尿病心肌病大鼠心肌組織中表達(dá)降低，過表達(dá)miR.200a可減輕糖尿病心肌病大鼠心肌組織及高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中心肌損傷標(biāo)志物水平，增加凋亡細(xì)胞及ROS蓄積。miR.200a可激活Nrf2，且沉默Nrf2后miR.200a失去對氧化應(yīng)激和細(xì)胞的保護(hù)作用。

綜上所述，miR.200a通過激活Nrf2減輕高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞死亡，預(yù)防糖尿病誘導(dǎo)的心肌損傷。miR.200a補(bǔ)充劑可能作為一種心臟保護(hù)劑對抗高糖引起的心臟毒性。

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（收稿日期：2022.02.07）

（本文編輯 薛妮）