馬詩(shī)經(jīng) 何春艷 關(guān)天竹 姚雪霜 張俊鵬

DOI：10.3976/j.issn.1002-4026.20230120

收稿日期：2023-08-07

作者簡(jiǎn)介：馬詩(shī)經(jīng)（1989—），男，碩士，研究方向?yàn)榻】禒I(yíng)養(yǎng)品研發(fā)。E-mail：871990221@qq.com

*通信作者，何春艷（1982—），女，碩士，研究方向?yàn)榻】禒I(yíng)養(yǎng)品研發(fā)。E-mail：41397535@qq.com

摘要：采用高血脂癥斑馬魚(yú)模型和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討黃鱔肽抗高脂血癥的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制。構(gòu)建高血脂斑馬魚(yú)模型及測(cè)試甘油三酯染色信號(hào)強(qiáng)度、膽固醇熒光強(qiáng)度指標(biāo)，分析黃鱔肽對(duì)高血脂癥的改善作用；利用BIOPEP-UWM、SwissTargetPrediction、GeneCards、STRING等數(shù)據(jù)庫(kù)篩選黃鱔肽及疾病靶點(diǎn)，使用DAVID軟件進(jìn)行靶點(diǎn)GO功能富集分析和 KEGG 通路富集分析，并構(gòu)建黃鱔肽-潛在靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)和蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果顯示，質(zhì)量濃度為62.5、125.0 μg/mL的黃鱔肽可顯著降低高脂血癥斑馬魚(yú)血管中的甘油三酯染色信號(hào)強(qiáng)度（p＜0.01）、膽固醇熒光強(qiáng)度（p＜0.001）。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果顯示黃鱔肽中有35個(gè)潛在活性肽段序列，通過(guò)蛋白互作分析得到21個(gè)核心靶點(diǎn)，GO和KEGG富集分析表明黃鱔肽主要涉及脂質(zhì)代謝過(guò)程的調(diào)節(jié)等生物過(guò)程，通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥、胰島素抵抗及脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化等通路發(fā)揮抗高脂血癥的作用。研究結(jié)果初步證實(shí)了黃鱔肽具有抗高血脂癥功效，揭示了黃鱔肽降血脂生物過(guò)程中多活性肽段、多靶點(diǎn)、多通路的作用特點(diǎn)，為進(jìn)一步深入研究黃鱔肽物質(zhì)基礎(chǔ)及抗高脂血癥作用與應(yīng)用提供理論依據(jù)及參考。

關(guān)鍵詞：黃鱔肽；高脂血癥；斑馬魚(yú)；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；作用機(jī)制

中圖分類號(hào)：R285??? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A??? 文章編號(hào)：1002-4026（2024）03-0027-12

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)志碼（OSID）：

Exploration of antihyperlipidemia mechanism of Monopterus albus peptides

based on hyperlipidemic zebrafish model and network pharmacology

MA Shijing， HE Chunyan*， GUAN Tianzhu， YAO Xueshuang， ZHANG Junpeng

（Guangdong Archealth Health Industry Group Co.， Ltd.， Guangzhou 510385， China）

Abstract∶This study aimed to explore the material basis and mechanism of action of Monopterus albus peptides against hyperlipidemia using hyperlipidemic zebrafish model and network pharmacology. Analysis of the ameliorating effects of Monopterus albus peptides on hyperlipidemia was conducted by constructing a hyperlipidemic zebrafish model and measuring the dye staining signal intensity of triglyceride and cholesterol fluorescence intensity changes. Monopterus albus peptides and disease targets were filtered using BIOPEP-UWM， SwissTargetPrediction， GeneCards， STRING， and other databases. Target GO functional enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis were performed using the DAVID bioinformatics software， and the Monopterus albus peptides-potential target-signaling pathway network and theprotein-protein interaction （PPI） network were constructed. The results showed that Monopterus albus peptides at mass concentrations of 62.5 μg/mL and 125.0 μg/mL significantly reduced the intensity of the triglyceride staining signal （p<0.01） and cholesterol fluorescence intensity （p<0.001） in the vasculature of hyperlipidemic zebrafish. The results of network pharmacology showed that there were 35 potentially active peptide sequences in Monopterus albus peptides， and 21 core targets were obtained by protein interaction analysis. GO and KEGG enrichment analyses indicated that Monopterus albus peptides

were mainly involved in biological processes such asregulation of lipid metabolic processes， and exertan antihyperlipidemia effect viainflammation regulation， insulin resistance， and lipid and atherosclerosis channels. Initially， this study confirmed that Monopterus albus peptides have an antihyperlipidemia effect， and revealed that Monopterus albus peptides have multiple active peptide fragments， multiple targets， and multiple channels in the biological process of reducing blood lipid levels， which will provide a theoretical basis and reference for further in-depth research on the material basis of Monopterus albus peptides and their role and application in countering hyperlipidemia.

Key words∶Monopterus albus peptides; hyperlipidemia; zebrafish; network pharmacology; mechanism of action

高脂血癥（hyperlipoidemia）是指由于原發(fā)性或繼發(fā)性原因?qū)е碌目偰懝檀?、甘油三酯水平異常升高為特征的疾病?］，也是誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病等心血管疾病重要的致病因素。近年來(lái)，高脂血癥發(fā)病率顯著提高，據(jù)《中國(guó)成人血脂異常防治指南（2016年修訂版）》［2］報(bào)道，國(guó)內(nèi)成人高脂血癥患病率高達(dá)40. 4%，高脂血癥已成為全世界范圍高度關(guān)注的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。目前，臨床用于高脂血癥的藥物包括他汀類、煙酸類及膽固醇吸收抑制劑等，長(zhǎng)期使用上述藥物存在肝損傷、胃痛、心律失常等不良反應(yīng)［3］?；谒幬锏陌踩詥?wèn)題，高脂血癥的治療干預(yù)方案或策略有待進(jìn)一步研究。

黃鱔（Monopterus albus）又稱為鱔魚(yú)、田鰻、長(zhǎng)魚(yú)等，合鰓目合鰓科黃鱔屬脊索動(dòng)物。黃鱔是中國(guó)特有，盛產(chǎn)于湖北、江蘇、浙江等地。黃鱔肉含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素等成分，具有治虛損、補(bǔ)中益血等藥用功效［4］。近年來(lái)，研究證實(shí)了黃鱔骨硫酸軟骨素多糖具有降血脂與減肥功效［5-6］。在黃鱔皮膚黏液獲得的抗菌肽也證實(shí)了其可抑制微生物，同時(shí)可提高疼痛閾值及抑制溶血活性和絲氨酸蛋白酶活性［7］。目前，對(duì)于黃鱔在治療高血脂癥的作用機(jī)制研究比較欠缺。因此，本文結(jié)合高脂血癥模型藥效實(shí)驗(yàn)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，初步探索了黃鱔肽對(duì)高血脂癥的功效及相關(guān)作用機(jī)制，為深入研究黃鱔肽藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機(jī)制以及在功能食品與臨床應(yīng)用提供理論與數(shù)據(jù)支持。

1? 材料與方法

1.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

野生型AB品系斑馬魚(yú)由杭州環(huán)特生物科技股份有限公司提供（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為：SYXK（浙）2022-0004），在斑馬魚(yú)養(yǎng)殖系統(tǒng)中養(yǎng)殖，飼養(yǎng)符合國(guó)際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物評(píng)估和認(rèn)可委員會(huì)認(rèn)證（認(rèn)證編號(hào)：001458）的要求，水溫為28 ℃，pH 6.5～8.5，電導(dǎo)率為450～550 μS/cm，水質(zhì)硬度為50～100 mg/L （以CaCO3計(jì)）。斑馬魚(yú)以自然成對(duì)交配繁殖方式獲得，待受精卵孵育至受精后5 d，挑選出健康的個(gè)體進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)杭州環(huán)特生物科技股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查，IACUC倫理審查號(hào)為IACUC-2022-4199-01。

1.2? 主要實(shí)驗(yàn)材料與試劑

黃鱔肽（批號(hào)20220701）由廣東壹健康健康股份有限公司提供；阿托伐他汀鈣片（批號(hào)202105219C）購(gòu)自樂(lè)普制藥科技有限公司，用二甲基亞砜配成質(zhì)量濃度為11.6 mg/mL阿托伐他汀鈣溶液，冷藏備用；CholesterlylBODIPYTM542/563 C11膽固醇探針（批號(hào)2291600），美國(guó)Invitrogen公司；純蛋黃粉（批號(hào)20200809），浙江艾格生物科技股份有限公司，用養(yǎng)魚(yú)水配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%高脂飼料；葡萄糖（批號(hào)L2108079）、甲基纖維素（批號(hào)C2004046），上海阿拉丁生化科技股份有限公司，用養(yǎng)魚(yú)水配成葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的高糖飼料；二甲基亞砜（DMSO，批號(hào)BCCD8942）、油紅O（Oil Red O，批號(hào)SHBN4926），Sigma公司；4%組織細(xì)胞固定液（批號(hào)20210828），北京索萊寶有限公司；1，2-丙二醇（批號(hào)20211117），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3? 實(shí)驗(yàn)儀器

SZX7解剖顯微鏡，日本OLYMPUS公司；VertA1CCD相機(jī)，上海土森視覺(jué)科技有限公司；IM300顯微注射儀，PC-10拉針儀，日本Narishige公司；CP214精密電子天平，美國(guó)OHAUS公司；AZ100電動(dòng)聚焦連續(xù)變倍熒光顯微鏡，日本Nikon公司。

1.4? 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1? 黃鱔肽最大耐受濃度測(cè)定

隨機(jī)選取受精后2 d的黑色素等位基因突變型Albino品系斑馬魚(yú)，分別設(shè)正常對(duì)照組、黃鱔肽組（質(zhì)量濃度為62.5、125、250、500、1 000 μg/mL，溶劑為水）共6個(gè)實(shí)驗(yàn)組。每實(shí)驗(yàn)組為一孔，每孔（實(shí)驗(yàn)組）放置斑馬魚(yú)30尾。每孔（實(shí)驗(yàn)組）容量為3 mL，28 ℃處理96 h，分別觀察和記錄斑馬魚(yú)在受試物溶液中的毒性表型和死亡情況，測(cè)定實(shí)驗(yàn)條件下不同質(zhì)量濃度的黃鱔肽對(duì)斑馬魚(yú)的最大耐受濃度。

1.4.2? 黃鱔肽輔助降甘油三酯的作用研究

取受精后5天的斑馬魚(yú)放置測(cè)試燒杯中，采用高脂高糖飼料喂飼斑馬魚(yú)，每天喂食8 h，建立高脂血癥模型［8］。隨機(jī)選取高脂血癥模型斑馬魚(yú)置于六孔板中，每孔（實(shí)驗(yàn)組）3 mL，每孔處理斑馬魚(yú)30尾，分別設(shè)置模型對(duì)照組（model）、陽(yáng)性對(duì)照組（阿托伐他汀鈣，質(zhì)量濃度為11.6 μg/mL）、黃鱔肽低劑量組（HSP-L，質(zhì)量濃度為31.2 μg/mL）、黃鱔肽中劑量組（HSP-M，質(zhì)量濃度為62.5 μg/mL）、黃鱔肽高劑量組（HSP-H，質(zhì)量濃度為125 μg/mL）。同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組（control）斑馬魚(yú)30尾，給予養(yǎng)魚(yú)用水。各實(shí)驗(yàn)組28 ℃處理2 d后將斑馬魚(yú)取出，使用0.3%油紅O進(jìn)行染色。脫色結(jié)束后，每孔（實(shí)驗(yàn)組）隨機(jī)選取10尾斑馬魚(yú)，置于解剖顯微鏡下拍照及采集圖片數(shù)據(jù)，以斑馬魚(yú)尾部血管染色強(qiáng)度為指標(biāo)，統(tǒng)計(jì)分析黃鱔肽降甘油三酯的作用，并計(jì)算黃鱔肽對(duì)甘油三酯的抑制率：

甘油三酯抑制率=Q受試組-Q模型對(duì)照組Q模型對(duì)照組×100%，（1）

其中Q表示染色強(qiáng)度。

1.4.3? 黃鱔肽輔助降膽固醇的作用研究

取受精后5 d的斑馬魚(yú)放置測(cè)試燒杯中，采用高脂高糖飼料喂飼斑馬魚(yú)，每天喂食8 h，建立高脂血癥模型［8］。隨機(jī)選取高脂血癥模型斑馬魚(yú)置于六孔板中，每孔（實(shí)驗(yàn)組）3 mL，每孔處理斑馬魚(yú)30尾，分別設(shè)置模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組（阿托伐他汀鈣，質(zhì)量濃度為11.6 μg/mL）、黃鱔肽低劑量組（質(zhì)量濃度為31.2 μg/mL）、黃鱔肽中劑量組（質(zhì)量濃度為62.5 μg/mL）、黃鱔肽高劑量組（質(zhì)量濃度為125 μg/mL）。另取30尾斑馬魚(yú)，給予養(yǎng)魚(yú)用水，作為正常對(duì)照組（control）。各實(shí)驗(yàn)組28 ℃處理1 d后將斑馬魚(yú)取出，注射膽固醇探針，繼續(xù)處理1 d后，各實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)選取10尾斑馬魚(yú)，置于熒光顯微鏡下拍照及采集圖片數(shù)據(jù)，以斑馬魚(yú)尾部血管膽固醇熒光強(qiáng)度為指標(biāo)，統(tǒng)計(jì)分析黃鱔肽降膽固醇的作用，并計(jì)算黃鱔肽對(duì)膽固醇的抑制率：

黃鱔肽對(duì)膽固醇的抑制率=Q受試組-Q模型對(duì)照組Q模型對(duì)照組×100%，（2）

其中Q表示熒光強(qiáng)度。

1.5? 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

1.5.1? 所用數(shù)據(jù)庫(kù)及分析軟件

本文網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究部分所用的數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件平臺(tái)包括SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www. swisstargetprediction. ch/）；PeptideRanker 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/）；BIOPEP-UWM 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//biochemia.uwm.edu.pl/biopep-uwm/）；SwissADME數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.swissadme.ch/）；GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）；STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//stringdb. org/）；DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/）；Venny 2.1.0 平臺(tái)（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index. html）；微生信平臺(tái)（http：//www.bioinformatics.com.cn/）；Cytoscape 3.7.1軟件。

1.5.2? 黃鱔肽潛在活性肽段序列篩選

通過(guò)PeptideRanker數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)黃鱔肽（Monopterus albus peptides，記為HSP）測(cè)試所得的肽段序列進(jìn)行生物活性打分，篩選評(píng)分大于0.8的肽段序列，使用BIOPEP-UWM 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得肽段序列的標(biāo)準(zhǔn)SMILE號(hào)，在SwissADME 網(wǎng)站中預(yù)測(cè)肽段的ADME性質(zhì)，以血腦屏障透過(guò)性、疏水常數(shù)、生物可用性評(píng)分為指標(biāo)，篩選潛在活性肽段序列。

1.5.3? 黃鱔肽活性肽段序列靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及高脂血癥靶點(diǎn)篩選

將黃鱔肽有效肽段序列通過(guò)Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索收集肽段序列所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，剔除無(wú)法查詢 SMILES 號(hào)的肽段序列及重復(fù)靶點(diǎn)，選取 Probability*≥0.1的活性靶點(diǎn)，合并所有肽段序列的有效靶點(diǎn)，待下一步分析。以“hyperlipidemia”為關(guān)鍵詞，通過(guò)GeneCards在線數(shù)據(jù)庫(kù)收集高脂血癥相關(guān)疾病靶點(diǎn)。

1.5.4? 核心靶點(diǎn)與蛋白質(zhì)相互作用分析

使用 Veney 2.1.0在線工具將黃鱔肽有效肽段序列的靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行交集處理，得出黃鱔肽的潛在活性肽段序列緩解高脂血癥的潛在作用靶點(diǎn)，繪制韋恩圖。通過(guò)STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)獲得的潛在作用靶點(diǎn)構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，將核心靶點(diǎn)TSV格式文件輸入Cytoscape 3.7.1軟件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化。采用centiscape 2.2插件計(jì)算網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的Betweenness、Closenes、Degree值，以此為指標(biāo)篩選出 PPI 網(wǎng)絡(luò)中黃鱔肽肽段序列與高脂血癥相關(guān)的核心靶點(diǎn)基因。

1.5.5? GO和KEGG功能富集分析

將篩選得到的核心靶點(diǎn)輸入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，物種設(shè)置為“Homo sapiens”，對(duì)黃鱔肽有效肽段序列改善高脂血癥的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能分析和 KEGG通路富集分析。根據(jù)P值升序排列，分別選取GO 分析中生物過(guò)程（biological process）、分子功能（molecular function）和細(xì)胞成分（cellular component）生物進(jìn)程參數(shù)的前10條，通過(guò)微生信在線工具繪制柱狀圖，進(jìn)行下一步分析。根據(jù)P值升序排列，選取P值前20條通路繪制 KEGG 通路富集分析，以闡述黃鱔肽發(fā)揮治療高脂血癥作用的生物過(guò)程、細(xì)胞成分、分子功能，以及黃鱔肽作用于高脂血癥的信號(hào)通路。

1.5.6? 黃鱔肽肽段序列-疾病靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

采用Cytoscape 3.7.1軟件將黃鱔肽有效肽段、潛在作用靶點(diǎn)、信號(hào)通路及其靶點(diǎn)進(jìn)行繪圖，構(gòu)建黃鱔肽-疾病靶點(diǎn)-信號(hào)通路圖，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化分析。

1.6? 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果采用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，p< 0.05表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果與討論

2.1? 黃鱔肽最大耐受質(zhì)量濃度與測(cè)試質(zhì)量濃度確定

斑馬魚(yú)對(duì)黃鱔肽的最大耐受質(zhì)量濃度結(jié)果見(jiàn)表1，結(jié)果顯示：質(zhì)量濃度為62.5、125.0 μg/mL黃鱔肽不誘發(fā)斑馬魚(yú)死亡和毒性表型，與正常對(duì)照組斑馬魚(yú)狀態(tài)相似。在添加質(zhì)量濃度≥250 μg/mL時(shí)，斑馬魚(yú)全部死亡，說(shuō)明在本實(shí)驗(yàn)條件下斑馬魚(yú)對(duì)黃鱔肽的最大耐受質(zhì)量濃度為125 μg/mL，后續(xù)將采用質(zhì)量濃度為31.2、62.5、125.0 μg/mL 的黃鱔肽進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2? 黃鱔肽對(duì)高脂血癥斑馬魚(yú)甘油三酯的影響

黃鱔肽對(duì)高脂血癥斑馬魚(yú)甘油三酯的測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表2、圖1，結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組斑馬魚(yú)尾部血管甘油三酯染色強(qiáng)度為13 464像素，極顯著高于正常對(duì)照組（p<0.001），說(shuō)明模型造模成功。與模型對(duì)照組相比，阿托伐他汀鈣組斑馬魚(yú)甘油三酯染色強(qiáng)度顯著降低（p<0.01），經(jīng)計(jì)算其輔助降甘油三酯功效為69.9%。黃鱔肽質(zhì)量濃度為62.5、125.0 μg/mL時(shí)，對(duì)應(yīng)斑馬魚(yú)尾部血管甘油三酯染色強(qiáng)度分別為6 915、7 351像素，極顯著低于模型對(duì)照組（p<0.001），上述質(zhì)量濃度黃鱔肽對(duì)甘油三酯的抑制率分別為48.6%、45.4%，說(shuō)明黃鱔肽具有顯著降低高脂血癥斑馬魚(yú)甘油三酯含量的功效。

2.3? 黃鱔肽對(duì)高脂血癥斑馬魚(yú)膽固醇的影響

黃鱔肽對(duì)高脂血癥斑馬魚(yú)膽固醇的影響結(jié)果見(jiàn)表3、圖2，結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組斑馬魚(yú)尾部血管膽固醇熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)（p<0.001），說(shuō)明了高脂高糖飼料造成了斑馬魚(yú)膽固醇含量顯著升高。與模型對(duì)照組相比，阿托伐他汀鈣組斑馬魚(yú)尾部血管膽固醇熒光強(qiáng)度為33 087像素（p<0.01），對(duì)膽固醇的抑制率為30.4%。質(zhì)量濃度為31.2、62.5、125.0 μg/mL黃鱔肽處理高脂血癥斑馬魚(yú)后的尾部血管膽固醇熒光強(qiáng)度分別為35 188、29 848及28 914像素，與模型對(duì)照組比較p<0.05及p<0.001，抑制膽固醇功效分別為26.0%、37.2%、39.2%，并且在62.5、125.0 μg/mL質(zhì)量濃度對(duì)膽固醇抑制效果優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組，說(shuō)明在本實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度條件下，黃鱔肽具有降低高脂血癥斑馬魚(yú)膽固醇含量的功效。

2.4? 黃鱔肽潛在活性肽段序列篩選

本研究所用黃鱔肽通過(guò)第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)測(cè)試，獲得了442個(gè)黃鱔肽的肽段序列，使用 PeptideRanker數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生物活性打分，獲得241個(gè)有效多肽片段，設(shè)置Score≥0.8，獲得符合要求的54個(gè)肽段序列，將篩選得到的肽段序列輸入BIOPEP-UWM數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得了54個(gè)肽段序列的SMILE。按不具有血腦屏障透過(guò)性（BBB permeant）、MLOGP≤0.5、Bioavailability Score≥0.10指標(biāo)，篩選得到35個(gè)潛在活性肽段序列見(jiàn)表4。

2.5? 黃鱔肽與高脂血癥疾病靶點(diǎn)篩選分析

將表4所得35個(gè)黃鱔肽潛在活性肽段序列在SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)檢索分析，獲得對(duì)應(yīng)的潛在作用靶點(diǎn)有254個(gè)。以“hyperlipidemia”為關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得高脂血癥相關(guān)疾病靶點(diǎn)基因，經(jīng)去重后獲得高脂血癥靶點(diǎn)基因共2 133個(gè)。

2.6? 黃鱔肽核心靶點(diǎn)與蛋白質(zhì)相互作用分析

將黃鱔肽肽段序列的潛在作用靶點(diǎn)與高脂血癥（hyperlipidemia）疾病靶點(diǎn)輸入Venny 2.1.0平臺(tái)構(gòu)建交集靶點(diǎn)韋恩圖（見(jiàn)圖3），共獲得82個(gè)交集靶點(diǎn)。進(jìn)一步在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)交集靶點(diǎn)分析，獲得交集靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖4，包含82個(gè)節(jié)點(diǎn)，623條邊。將交集靶點(diǎn)導(dǎo)出TSV文件，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件進(jìn)行處理分析，采用Centiscape 2.2插件計(jì)算PPI網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的Betweenness、Closenes、Degree值，構(gòu)建核心靶點(diǎn)的蛋白相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖5。以節(jié)點(diǎn)度值的閾值≥15.38篩選，獲得21個(gè)核心靶點(diǎn)（見(jiàn)表5），包括TNF、EGFR、PPARA、ACE、REN、F2、APP、CCND1、HSP90AA1、MMP9等，在PPI網(wǎng)絡(luò)中排序靠前，靶點(diǎn)蛋白的節(jié)點(diǎn)越大、顏色越深，說(shuō)明相互作用越強(qiáng)。研究表明，腫瘤壞死因子（TNF，以TNF-α為主）家族蛋白表達(dá)水平可作為高脂血癥及其相關(guān)疾病發(fā)程度的重要考察指標(biāo)［9］。表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）被證實(shí)可抑制合成膽固醇，增強(qiáng)脂肪酸氧化進(jìn)而減少脂肪積累及肝損傷，可能成為治療血脂異常潛在作用靶點(diǎn)［10］。PPARA即過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-α對(duì)脂質(zhì)調(diào)節(jié)、膽固醇穩(wěn)態(tài)及高密度脂蛋白合成有著重要的影響［11］。血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)換酶（ACE）在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中有大量表達(dá)，說(shuō)明 ACE 可能成為抗動(dòng)脈粥樣硬化的重要因素之一［12］。金屬基質(zhì)蛋白酶-9（MMP9）可調(diào)節(jié)血脂且可作為高脂血癥患者血清的重要指標(biāo)之一［13］。上述核心靶點(diǎn)可能與黃鱔肽發(fā)揮降血脂作用的關(guān)系密切。

2.7? GO和KEGG富集分析

對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，以進(jìn)一步闡明核心靶點(diǎn)的潛在作用，將核心靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID在線數(shù)據(jù)庫(kù)，以通路中的基因數(shù)（count）和P值為條件進(jìn)行生物過(guò)程（biological process）、分子功能（molecular function）和細(xì)胞組分（cellular component）的GO功能富集分析，圖4展示了每部分前10個(gè) GO 條目的富集情況，其中圓圈大小表示基因富集數(shù)量，顏色代表基因P值大小。由結(jié)果可知，生物進(jìn)程（BP）主要富集在凋亡過(guò)程的正調(diào)節(jié)（positive regulation of apoptotic process）、對(duì)外來(lái)生物刺激的反應(yīng)（response to xenobiotic stimulus）、蛋白磷酸化的正調(diào)節(jié)（positive regulation of protein phosphorylation）、肽基絲氨酸磷酸化的正調(diào)節(jié)（positive regulation of peptidyl-serine phosphorylation）、蛋白水解作用（proteolysis）等；細(xì)胞組分（CC）主要富集在細(xì)胞外區(qū)（extracellular region）、細(xì)胞外空間（extracellular space）、細(xì)胞膜筏（membrane raft）、細(xì)胞表面（cell surface）、高分子復(fù)合物（macromolecular complex）等；分子功能（MF）主要富集在酶結(jié)合（enzyme binding）、肽酶活性（peptidase activity）、蛋白酶活性（protease binding）、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性（serine-type endopeptidase activity）、受體結(jié)合（receptor binding）等。通過(guò)GO富集分析發(fā)現(xiàn)，黃鱔肽活性肽段抗高脂血癥的核心靶點(diǎn)主要參與細(xì)胞組成、信號(hào)調(diào)控以及蛋白結(jié)合等生命進(jìn)程，進(jìn)而發(fā)揮降血脂功效。

為闡明黃鱔肽降血脂的作用機(jī)制，將核心靶點(diǎn)KEGG 信號(hào)通路注釋分析，按P值由小到大進(jìn)行排序，共富集到94條相關(guān)信號(hào)通路，其中85條信號(hào)通路具有顯著意義（p＜0.05）。圖5展示了前20條KEGG 條目的富集情況，包括癌癥通路（pathways in cancer）、IL-17 信號(hào)通路（IL-17 signaling pathway）、胰島素抵抗（endocrine resistance）、AGE-RAGE 信號(hào)通路（AGE-RAGE signaling pathway）、TNF 信號(hào)通路（TNF signaling pathway）及脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化（lipid and atherosclerosis）等，上述KEGG通路主要富集了PIK3CA、MAPK8、FOS、MMP9、CASP3、TNF、EGFR、CCND1、MMP2、HSP90AA1等多個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)基因（圖6），也說(shuō)明了機(jī)體的高脂血癥狀態(tài)由多通路、多靶點(diǎn)調(diào)控。研究表明，TNF信號(hào)通路中TNF-α可抑制脂肪形成和分化，促進(jìn)脂質(zhì)分解并導(dǎo)致游離脂肪酸升高，進(jìn)而抑制胰島素信號(hào)通路［14］。TNF信號(hào)通路和IL-17 信號(hào)通路是促發(fā)炎癥的關(guān)鍵信號(hào)通路，通過(guò)產(chǎn)生IL-17 的細(xì)胞介導(dǎo)高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化和免疫應(yīng)答的交聯(lián)［15-16］。脂血癥、糖尿病等疾病與AGE-RAGE通路中的高晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）密切相關(guān)，高血脂可促進(jìn)AGE受體的表達(dá)［17-18］，并激活NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)下游促炎性細(xì)胞因子（如IL-6）的過(guò)度表達(dá)。發(fā)生胰島素抵抗時(shí)，促使脂肪細(xì)胞釋放大量的游離脂肪酸進(jìn)入血液循環(huán)，致使游離脂肪酸水平升高，從而導(dǎo)致肝臟中甘油三酯（TG）水平升高［19］。此外，脂質(zhì)過(guò)度沉積可使脂質(zhì)代謝異常，同時(shí)巨噬細(xì)胞吞噬沉積的脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞，加劇高脂血癥誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化［20-21］。

2.8? 黃鱔肽成分-作用靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建分析

圖7為探討黃鱔肽降血脂的有效肽段、疾病靶點(diǎn)與信號(hào)通路三者之間的相互關(guān)系，采用Cytoscape 3.7.1構(gòu)建黃鱔肽降血脂潛在活性肽段-作用靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，其中圖中菱形為黃鱔肽有效肽段序列，成分作用與圖形顏色呈正比關(guān)系；圓形為作用靶點(diǎn)，顏色越深即說(shuō)明靶點(diǎn)交集越多；紫紅色方形為信號(hào)通路，形狀越大，信號(hào)通路作用越強(qiáng)。由圖結(jié)果可知，黃鱔肽以PAGPL、GPAPP、GPVGPM、PGLPGP、SGPPAP、PGPM、PGPGMP、GPGR、PGPGPM為主要活性肽段序列，與PIK3CA、MMP9、MAPK8、CASP3、FOS、TNF、MMP2、ACE、EGFR等關(guān)鍵靶點(diǎn)及信號(hào)通路存在多重交互作用。因此，黃鱔肽可能通過(guò)多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)細(xì)胞間信號(hào)、脂質(zhì)代謝及特異性結(jié)合等信號(hào)表達(dá)，發(fā)揮防治高脂血癥的作用。

3? 結(jié)論

本研究通過(guò)體內(nèi)斑馬魚(yú)模型實(shí)驗(yàn)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討了黃鱔肽降血脂功效以及其活性肽段序列對(duì)高脂血癥的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明黃鱔肽在62.5～125 μg/mL濃度范圍可顯著降低高脂血癥斑馬魚(yú)中血管的甘油三酯、膽固醇含量，初步證實(shí)黃鱔肽具有良好的降血脂作用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果表明，黃鱔肽中具有35個(gè)潛在活性肽段序列，其降血脂的核心靶點(diǎn)主要涉及細(xì)胞組成、細(xì)胞間信號(hào)調(diào)控和分子間蛋白結(jié)合等生命進(jìn)程，并通過(guò)IL-17 信號(hào)通路、胰島素抵抗、AGE-RAGE 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路及脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化等信號(hào)通路調(diào)節(jié)高血脂癥。綜上所述，黃鱔肽可能通過(guò)多肽段序列、多靶點(diǎn)、多通路影響細(xì)胞凋亡、脂質(zhì)合成與代謝、炎癥以及癌癥的產(chǎn)生等維度協(xié)同發(fā)揮降血脂作用。后續(xù)仍需分離純化得到具體活性肽段序列的黃鱔肽成分，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)中預(yù)測(cè)的核心靶點(diǎn)、通路等結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，為黃鱔肽在生物醫(yī)藥、營(yíng)養(yǎng)健康食品領(lǐng)域應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

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