柳新 張圣林 李青山 董怡 謝云鵬

【摘要】 目的 探究安羅替尼對人腦膠質瘤細胞黏附、遷移、侵襲和上皮間質轉化（EMT）的影響。方法體外培養(yǎng)人腦膠質瘤T98G細胞，分為對照組（不做干預）、實驗組（2.5 μmol·L-1安羅替尼組、5 μmol·L-1安羅替尼組、10 μmol·L-1安羅替尼組）和陽性藥物組（50 mg·L-1 5-氟尿嘧啶），干預24 h。用活細胞計數（CCK-8）、細胞黏附實驗、劃痕法、Transwell小室及蛋白免疫印跡（WB）法對細胞增殖活力、黏附、遷移、侵襲能力及EMT相關蛋白表達量進行分析。結果 與對照組比較，5 μmol·L-1、10 μmol·L-1安羅替尼組和陽性藥物組增殖活力顯著降低（P<0.05），實驗組和陽性藥物組T98G細胞黏附、遷移、侵襲能力，纖維粘連蛋白（FN）、波形蛋白（Vimentin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）蛋白的表達水平呈現顯著下調趨勢（P<0.05），而E-鈣黏蛋白（E-cadherin）蛋白的表達水平呈現明顯上調趨勢（P<0.05），且濃度越高變化越顯著；與陽性藥物組相比，2.5 μmol·L-1、5 μmol·L-1安羅替尼組細胞增殖活力、黏附、遷移、侵襲能力，N-cadherin、Vimentin及FN的蛋白水平上調（P<0.05），而E-cadherin蛋白水平則下調（P<0.05）；10 μmol·L-1安羅替尼組與陽性藥物組相比無顯著差異（P>0.05）。結論 安羅替尼可能是通過抑制EMT進程進而抑制人腦膠質瘤T98G細胞的增殖、黏附、遷移、侵襲能力。

【關鍵詞】 安羅替尼；腦膠質瘤；黏附；遷移；侵襲；上皮間質轉化

【中圖分類號】 R739.41? 【文獻標志碼】 A? 【文章編號】 1672-7770（2024）03-0286-06

腦膠質瘤屬于臨床常見的顱內惡性腫瘤，具有高復發(fā)率和高死亡率的特點。腦膠質瘤由于其特殊位置，發(fā)病較為隱匿，早期的臨床癥狀不明顯，因此往往發(fā)現時已多為晚期。手術、放化療是目前治療腦膠質瘤的主要方法；但對于晚期的腦膠質瘤患者而言，手術治療并不適用，且該病術后復發(fā)率和轉移率高，并有著較高的原發(fā)耐藥率，導致當前總體療效不甚理想［12］。因此探究有效治療腦膠質瘤的藥物具有重要意義。安羅替尼可以抑制腫瘤細胞的生長和轉移，是一種多靶點酪氨酸激酶抑制劑，主要通過抗血管生成作用發(fā)揮抗腫瘤作用［3］。安羅替尼抗胃癌侵襲作用也有相關報道［4］。近些年多項研究顯示上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）與腫瘤的遷移、侵襲及耐藥關系密切［5］。Guan等［6］研究發(fā)現，敲低視黃醇脫氫酶10的表達能通過調控相關信號通路抑制膠質瘤細胞的轉移，其可能與腫瘤細胞EMT過程相關，腫瘤細胞發(fā)生EMT，其黏著力、形態(tài)、基質性狀會發(fā)生改變，細胞形態(tài)向間充質轉變，具有更高侵襲力，逐漸入侵周圍的組織、血管及淋巴管等，發(fā)生遠處轉移［7］。目前安羅替尼對腦膠質瘤細胞黏附、遷移、侵襲及EMT的作用尚未完全闡明，本研究旨在探討安羅替尼對腦膠質瘤細胞T98G黏附、遷移、侵襲及EMT進程的影響，為安羅替尼對腦膠質瘤的相關治療提供體外實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人腦膠質瘤T98G細胞，購自上海中科院細胞庫。5-氟尿嘧啶［賽百慷（上海）生物技術股份有限公司］、安羅替尼（selleckchem公司），胎牛血清（美國Gibco公司），DMEM-H培養(yǎng)基（北京索萊寶生物科技有限公司），活細胞計數（cell counting kit-8，CCK-8）試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司），鼠抗人［波形蛋白（Vimentin）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、纖維粘連蛋白（fibronectin，FN）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）及β-actin單克隆抗體］、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG及山羊抗鼠IgG多克隆抗體（英國Abcam公司）。BBS-V500型超凈工作臺（濟南卓隆生物技術有限公司）；WMS-1033型倒置熒光顯微鏡（上海無陌光學儀器有限公司）；TG-21WC離心機購自山東博科公司；Gel Doc2000型凝膠成像系統(tǒng)（美國Thermo公司）；Multiskan FC型酶標儀（美國Thermo公司）等。

1.2 方法

1.2.1 人腦膠質瘤T98G細胞培養(yǎng) 將凍存細胞腦膠質瘤T98G細胞進行復蘇后（≥80%密度）接種于培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中，置于37 ℃，5% CO2，70%～80%濕度培養(yǎng)箱環(huán)境中，在完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM-H）上進行培養(yǎng)。

1.2.2 分組及給藥 將細胞分成對照組、實驗組、陽性藥物組，其中對照組細胞不做干預，實驗組（2.5 μmol·L-1安羅替尼組、5 μmol·L-1安羅替尼組、10 μmol·L-1安羅替尼組）分別以2.5 μmol·L-1、5 μmol·L-1、10 μmol·L-1安羅替尼進行干預。陽性藥物組以50 mg·L-1 5-氟尿嘧啶進行干預，每組設置3個復孔，后置于37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.3 CCK-8法測定人腦膠質瘤T98G細胞的增殖活力 將細胞胰酶消化后用完全細胞培養(yǎng)液重懸，細胞傳代并以5×103個/孔的密度鋪于96孔板中，待各組干預24 h之后，各孔加入10%（v∶v）CCK8溶液，并在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)2 h，之后在酶標儀上檢測各孔細胞在450 nm處的吸光度（optical density，OD）值。細胞活力（%）=OD（實驗組或陽性藥物組）/OD對照組×100%。

1.2.4 細胞黏附實驗測定T98G細胞黏附數 用無胎牛血清培養(yǎng)液稀釋重組人纖維連接蛋白后取20 μg·mL-1鋪于96孔板，風干后用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌3次，每次20 min。取各組干預24 h細胞，用胰蛋白酶消化細胞，并制成單細胞懸液。取100 μL單細胞懸液，濃度為1×104個/mL，加入鋪膠的96孔板中，設3個復孔，置于37 ℃培養(yǎng)1 h，取出96孔板，進行3次洗滌后用甲醇進行相應固定，時間為10 min，接著用結晶紫進行染色，時間為15 min，然后再洗滌3次，最后于50倍顯微鏡下觀察細胞黏附數。

1.2.5 劃痕法測定T98G細胞的遷移能力 將細胞接種至6孔板，細胞生長密度約為90%后進行劃痕，然后將細胞放置于37 ℃，5% CO2的條件下進行24 h培養(yǎng)。0和24 h的劃痕情況使用顯微鏡進行拍照記錄，S0與S24分別表示0和24 h的劃痕面積。細胞遷移率=（S0-S24）/S0。

1.2.6 Transwell小室法測定T98G細胞的侵襲能力 將基質膠濃度用無血清的完全培養(yǎng)基進行稀釋（1 mg/mL）后加入Transwell小室（100 μL），孵育5 h（37 ℃，5% CO2）使其呈干膠狀。各組細胞在藥物干預24 h后，重懸在無血清的完全培養(yǎng)基中，并將1×105個細胞接種到提前包被基質膠的Transwell小室的腔室中，Transwell小室和24孔板之間的腔室中加入500 μL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。細胞在37 ℃中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，小室下表面的細胞與4%組織細胞固定液室溫孵育15 min，再與1%結晶紫染色液室溫孵育20 min后利用顯微鏡進行拍照。侵襲細胞數使用Image J圖像分析軟件進行計算。

1.2.7 蛋白免疫印跡（western blotting，WB）法對EMT相關蛋白表達水平進行檢測 收集各組細胞，提取蛋白并定量，后上樣，進行凝膠電泳，200 mA電流轉膜，封閉2 h，后加入鼠抗人（FN、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin及β-actin）的一抗進行孵育、洗滌、二抗孵育、洗滌，加顯影液，最后利用凝膠成像系統(tǒng)，進行相應的拍照記錄，并用Image J軟件進行蛋白灰度分析，β-actin為內參蛋白。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用均數±標準差（x-±s）表示符合正態(tài)分布的計量資料，采用單因素方差和Tukey檢驗進行多組間與組間的兩兩比較，以P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。用GraphPad Prism 8軟件進行繪圖。

2 結 果

2.1 人腦膠質瘤T98G細胞的增殖活力 干預24 h后，與對照組相比，2.5 μmol·L-1安羅替尼組T98G細胞增殖活力沒有顯著變化（P>0.05），5 μmol·L-1、10 μmol·L-1安羅替尼組和陽性藥物組細胞增殖活力顯著降低（P<0.05）。2.5 μmol·L-1、5 μmol·L-1安羅替尼組與陽性藥物組相比，細胞增殖活力顯著升高（P<0.05）；10 μmol·L-1安羅替尼組與陽性藥物組相比，細胞增殖活力無顯著差異（P>0.05），見圖1。

2.2 人腦膠質瘤T98G細胞的黏附能力 實驗組、陽性藥物組的細胞黏附數較對照組均減少；2.5 μmol·L-1、5 μmol·L-1安羅替尼組細胞黏附數較陽性藥物組增多，10 μmol·L-1安羅替尼組與陽性藥物組趨勢一致（圖2A）。實驗組、陽性藥物組的細胞黏附數較對照組降低（P<0.05），且實驗組呈劑量依賴性（圖2B）。2.5 μmol·L-1、5 μmol·L-1安羅替尼組細胞黏附數較陽性藥物組升高（P<0.05）；10 μmol·L-1安羅替尼組細胞黏附數較陽性藥物組無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

2.3 人腦膠質瘤T98G細胞的遷移能力 實驗組、陽性藥物組的細胞遷移數較對照組則明顯減少；2.5 μmol·L-1、5 μmol·L-1安羅替尼組細胞遷移數較陽性藥物組增多，10 μmol·L-1安羅替尼組與陽性藥物組趨勢一致（圖3A）。實驗組、陽性藥物組的細胞遷移率較對照組降低（P<0.05），且實驗組呈劑量依賴性（圖3B）。2.5 μmol·L-1、5 μmol·L-1安羅替尼組細胞遷移率較陽性藥物組升高（P<0.05）；10 μmol·L-1安羅替尼組細胞遷移率較陽性藥物組無顯著差異（P>0.05）。

2.4 人腦膠質瘤T98G細胞的侵襲能力 實驗組、陽性藥物組的細胞侵襲數較對照組降低（P<0.05），且實驗組呈劑量依賴性（圖4）。2.5 μmol·L-1、5 μmol·L-1安羅替尼組細胞侵襲數較陽性藥物組升高（P<0.05）；10 μmol·L-1安羅替尼組細胞侵襲數較陽性藥物組無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

2.5 人腦膠質瘤T98G細胞中EMT相關蛋白表達量情況 T98G細胞中E-cadherin蛋白水平較對照組發(fā)生上調（P<0.05），N-cadherin、Vimentin、FN蛋白水平發(fā)生下調（P<0.05），見圖5A、B。2.5 μmol·L-1、5 μmol·L-1安羅替尼組E-cadherin蛋白表達水平較陽性藥物組下調（P<0.05），而N-cadherin、Vimentin和FN蛋白水平較陽性藥物組上調（P<0.05）；10 μmol·L-1安羅替尼組EMT相關蛋白的表達水平較陽性藥物組無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

3 討 論

腦膠質瘤約占顱內腫瘤的一半，為中樞神經系統(tǒng)中常見腫瘤。目前臨床治療腦膠質瘤主要采用手術、放化療等治療手段，但腫瘤組織很難徹底清除，且容易復發(fā)［8］。腦膠質瘤細胞在生長過程中具有高度侵襲性，因此研發(fā)抑制腦膠質瘤細胞侵襲性生長的治療藥物具有極重要的理論意義與應用價值。安羅替尼屬于臨床上治療晚期非小細胞肺癌的藥物，近年來有很多相關研究發(fā)現安羅替尼除能夠抑制肺癌細胞生長外，對其他腫瘤也同樣可以發(fā)揮抑制作用［9］。謝轉紅等［10］研究顯示，安羅替尼能夠調控結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲。在宮頸癌中，安羅替尼抑制癌細胞的遷移和侵襲也有相關報道［11］。吳廣銀等［12］通過體內外實驗發(fā)現，安羅替尼對膠質瘤有放療增敏作用，且小窩蛋白表達下降調控絲裂原活化蛋白激酶磷酸化通路改變可能是其作用機制之一。以上研究提示，安羅替尼可以抑制多種腫瘤的轉移和侵襲，可為本實驗的開展提供理論支撐。本研究結果顯示，與對照組相比，5 μmol·L-1、10 μmol·L-1安羅替尼組和陽性藥物組增殖活力顯著降低，而實驗組和陽性藥物組細胞黏附數、遷移和侵襲能力也明顯降低，且本研究采用臨床上常用的化療藥物5-氟尿嘧啶作為陽性藥物［13］進行相關研究，結果顯示2.5 μmol·L-1、5 μmol·L-1安羅替尼組與陽性藥物組相比增殖活力、黏附、遷移和侵襲能力顯著升高，10 μmol·L-1安羅替尼組與陽性藥物組相比增殖活力、黏附、遷移和侵襲能力無顯著差異，表明高濃度安羅替尼對膠質瘤細胞的抑制作用與陽性藥作用相當；提示安羅替尼可以抑制腦膠質瘤細胞的增殖、黏附、遷移和侵襲。

上皮細胞在一系列生物學過程中獲得具有遷移性與侵襲性間充質表型是EMT進程的典型特征［1415］。腦膠質瘤作為具有高度侵襲性的腫瘤細胞，其特性與其本身間質性發(fā)生改變具有密切的關系。在多種癌癥中，均有文獻報道EMT能夠促進癌細胞的轉移和侵襲，并且和癌細胞對化療藥物耐受有密切聯系［1617］。Nan等［18］的研究也表明EMT能夠促進膠質瘤細胞的侵襲。在膠質瘤細胞中，韓慶亮等［19］研究表明癌細胞的遷移和侵襲受到抑制與大黃酚調控EMT有關。張雪等［20］研究指出，在胃癌細胞中EMT相關蛋白的表達與胃癌細胞侵襲、遷移及黏附能力的增強有關。王勇等［21］研究顯示，白藜蘆醇能夠抑制EMT進程抑制人腦膠質瘤T98G細胞的生長、黏附、遷移及侵襲。這些研究表明，腦膠質瘤侵襲性生長與EMT存在密切聯系。Song等［22］在對膽管癌的研究表明，安羅替尼可以通過抑制EMT抑制癌細胞的遷移和侵襲。另有研究表明，安羅替尼可顯著抑制人口腔鱗癌細胞的EMT進程［23］。在本研究中，實驗組和陽性藥物組的T98G細胞中E-cadherin蛋白水平較對照組發(fā)生上調，N-cadherin、Vimentin、FN蛋白水平發(fā)生下調，且安羅替尼濃度越高作用越明顯；而相比于陽性藥物組，2.5 μmol·L-1、5 μmol·L-1安羅替尼組的EMT相關蛋白的表達趨勢則正好相反。以上結果與上述文獻中報道一致，提示安羅替尼可能通過抑制EMT進程，從而在腦膠質瘤T98G細胞增殖、黏附、遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，安羅替尼可抑制人腦膠質瘤T98G細胞的增殖、黏附、遷移以及侵襲，可能與通過抑制EMT進程有關。但在其他腦膠質瘤細胞系中安羅替尼作用是否相同，且是否涉及相關信號通路機制尚未明確，需要進一步探究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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