唐海濤 王社盈

摘要：目的 研究抗寄生蟲藥物氟雷拉納對金黃色葡萄球菌的抗菌活性。方法 金黃色葡萄球菌臨床菌株SA1901和SA1902于2023年5月份收集自膿胸患者的胸水培養(yǎng)標(biāo)本；通過微量肉湯稀釋實(shí)驗(yàn)和時(shí)間-殺菌曲線檢測金黃色葡萄球菌對氟雷拉納的敏感性；通過連續(xù)誘導(dǎo)耐藥實(shí)驗(yàn)檢測氟雷拉納的耐藥誘導(dǎo)能力；通過構(gòu)建持留菌、生物被膜抗菌實(shí)驗(yàn)以及激光共聚焦顯微鏡檢測氟雷拉納對金黃色葡萄球菌持留菌和生物被膜的抗菌活性；最后，棋盤稀釋實(shí)驗(yàn)用于檢測氟雷拉納與氨基糖苷類抗菌藥物的聯(lián)用效果。結(jié)果 氟雷拉納對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration， MIC）和最低殺菌濃度分別為4～8 μg/mL和8～16 μg/mL；通過時(shí)間-殺菌曲線發(fā)現(xiàn)亞抑菌濃度的氟雷拉納即可有效抑制細(xì)菌的增殖；氟雷拉納連續(xù)處理金黃色葡萄球菌15 d也未見耐藥突變的形成；8×MIC的氟雷拉納作用ATCC 25923持留菌4 h可使其活菌計(jì)數(shù)從（8.97± 0.35）Log10 CFU/mL降低到（7.47± 0.09）Log10 CFU/mL（t=7.17， P=0.002），使USA300持留菌從（9.35±0.31）Log10 CFU/mL降低到（6.79±0.20）Log10 CFU/mL（t=12.04， P<0.001）；1×MIC的氟雷拉納可顯著抑制USA300生物被膜的形成，使其生物被膜的形成量從（2.41±0.12）降低到（0.20±0.06）（t=44.03， P<0.0001）；1×MIC的氟雷拉納還能顯著清除已形成的生物被膜，使其生物被膜的總量從（3.02±0.02）減少到（2.04±0.39）（t=5.58， P=0.0008）；通過棋盤稀釋試驗(yàn)和活菌計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)氟雷拉納與阿米卡星聯(lián)用具有協(xié)同抗菌活性，其協(xié)同抑菌指數(shù)為0.375。結(jié)論 氟雷拉納對金黃色葡萄球菌具有顯著的抗菌作用，且與阿米卡星聯(lián)用具有協(xié)同抗菌活性。

關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌；氟雷拉納；持留菌；生物被膜；抗菌藥物

中圖分類號：R632文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Antimicrobial effects of the anti-parasite drug flurlalner against

Staphylococcus aureus

Tang Haitao1 and Wang Sheying2

（1 Department of Thoracic Surgery， The Affiliated Changsha Hospital of Xiangya School of Medicine， Central South University， Changsha 410005; 2 Department of Clinical Laboratory， The Affiliated Changsha Hospital of Xiangya School of Medicine，

Central South University， Changsha 410005）

Abstract Objective This study aimed to investigate the antimicrobial effects of the anti-parasite drug fluralaner against Staphylococcus aureus. Methods S. aureus clinical isolates of SA1901 and SA1902 were collected from the thoracic fluid of pyothorax patients in May 2023. The antimicrobial susceptibility of fluralaner against S. aureus was determined by the micro-broth dilution assay and time-killing curves. The consecutive resistance-inducing assay was used to detect the resistance-inducing ability of fluralaner. The persister cell killing assay， the anti-biofilm assay and the laser confocal microscope were used to explore the anti-persister and anti-biofilm activities of fluralaner. Last， the combinational antimicrobial effects between fluralaner and aminoglycosides were determined by the checkerboard dilution assay. Results The minimal inhibitory concentration （MIC） and minimal bactericidal concentration of fluralaner against S. aureus were 4～8 μg/mL and 8～16 μg/mL， respectively. The sub-MIC of fluralaner was found to effectively inhibit bacterial growth by the time-killing assay. No resistant mutation was observed even after fluralaner treatment for 15 consecutive days. After 4 h treatment， 8×MIC of fluralaner could significantly reduce the viable persister cells of ATCC 25923 and USA300 from （8.97± 0.35） Log10 CFU/mL to （7.47± 0.09） Log10 CFU/mL （t=7.17， P=0.002）， and from （9.35±0.31） Log10 CFU/mL to （6.79±0.20） Log10 CFU/mL （t=12.04， P<0.001）， respectively. Fluralaner could significantly inhibit the biofilm formation of USA300 from （2.41±0.12） to （0.20±0.06） （t=44.03， P<0.0001） at the concentration of 1×MIC; and 1×MIC of fluralaner could also significantly eradicate the pre-formed biofilm form （3.02±0.02） to （2.04±0.39） （t=5.58， P=0.0008）; By checkerboard dilution assay and viable bacteria counting， amikacin was found to be synergistic with fluralaner against S. aureus with a synergistic antiacterial index of 0.375. Conclusion Fluralaner showed significant antimicrobial effects against S. aureus and could be synergistic with amikacin against S. aureus.

Key words Staphylococcus aureus; Fluralaner; Persister cells; Biofilm; Antibiotic drug

金黃色葡萄球菌簡稱金葡菌，是一種常見的革蘭陽性條件致病菌，常引起社區(qū)或醫(yī)院獲得性感染。金葡菌可以引起多種類型的感染，例如：膿胸、肺炎、皮膚軟組織感染、植入物相關(guān)感染和敗血癥等[1]。金葡菌還能黏附于人體組織表面或醫(yī)療器械表面，分泌胞外基質(zhì)，相互聚集而形成具有立體結(jié)構(gòu)的生物被膜。由于生物被膜的物理屏障作用和生物被膜內(nèi)部細(xì)菌的休眠狀態(tài)等原因，使生物被膜狀態(tài)下金葡菌的耐藥性比相應(yīng)浮游狀態(tài)細(xì)菌高達(dá)10～1000倍不等[2]。因此，研究生物被膜的抗菌藥物具有重要的臨床意義。

近年來，“老藥新用”已成為藥物研發(fā)的有效且快捷途徑。已上市藥物的合成工藝和毒理學(xué)數(shù)據(jù)可以加快藥物的研發(fā)過程。例如：Liu等[3]發(fā)現(xiàn)二甲雙胍對金葡菌和大腸埃希菌等具有顯著的抗菌活性；Kim等[4]發(fā)現(xiàn)抗腫瘤藥物CD437對金葡菌具有有效的體內(nèi)和體外抗菌活性等。氟雷拉納是1種抗寄生蟲藥物[5]，然而，尚未見研究報(bào)道其對金葡菌的抗菌作用。本研究通過藥敏實(shí)驗(yàn)、殺菌動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)和生物被膜清除實(shí)驗(yàn)等方法，研究了氟雷拉納對金葡菌的抗菌活性，并進(jìn)一步評估了其作為抗菌藥物的細(xì)胞毒性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

氟雷拉納、環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、萬古霉素（vancomycin， VAN）、慶大霉素（gentamycin，GEN）、卡那霉素（kanamycin，KANA）、妥布霉素（tobramycin，TOB）、奈替米星（netilmicin，NET）、大觀霉素（spectinomycin，SH）、阿米卡星（amikacin，AMK）、CCK-8試劑盒和Triton×-100均購自美國MedChem Express公司）；胎牛血清（以色列BI公司）；DMEM（蘭州市民海生物工程有限公司）；RPMI-1640（上海索萊寶生物有限公司）；人紅細(xì)胞（上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司）；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（愛必信（上海）生物科技公司）；結(jié)晶紫染液（日本同仁化學(xué)；人紅細(xì)胞（上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司）；SYTO9/PI熒光試劑盒（美國賽默飛公司）；陽離子校正的Mueller-Hinton（MH）肉湯和胰蛋白大豆肉湯（Tryptic Soy Broth，TSB）肉湯（北京索萊寶科技有限公司）；羊血瓊脂平板（鄭州安圖生物科技有限公司）；96孔和6孔細(xì)胞培養(yǎng)板（美國Corning公司）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek儀器公司）；恒溫?fù)u床和恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；激光共聚焦顯微鏡Zeiss LSM 800（德國Zeiss公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌株及培養(yǎng)條件

人HepG2細(xì)胞和LO2細(xì)胞株、甲氧西林敏感金葡菌（methicillin sensitive Staphylococcus aureus，MSSA）標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25923和ATCC 29213以及MRSA標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 43300和USA300均購自美國模式細(xì)胞/菌種收集中心（American Type Culture Collection，ATCC）。金葡菌臨床菌株MRSA SA1901和MSSA SA1902于2023年5月份收集自膿胸患者的胸水培養(yǎng)標(biāo)本，經(jīng)羊血平板分純和質(zhì)譜鑒定。并通過是否對氨芐西林耐藥鑒定其是否為MRSA。所有菌種均接種于甘油磁珠中，于-80 ℃保存。并于羊血瓊脂平板上傳代兩次后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 微量肉湯稀釋實(shí)驗(yàn)

將金葡菌于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)后，挑取新鮮單個(gè)純菌落于無菌生理鹽水中，調(diào)至1.5×

108 CFU/mL的菌懸液，用MH肉湯1：1000稀釋后備用。將氟雷拉納用MH肉湯倍比稀釋后（0.5～32 μg/mL），于96孔板中每孔加入50 μL，再分別加入50 μL備用菌懸液。將96孔板放置濕盒中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)16～18 h后觀察結(jié)果。最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration， MIC）即為肉眼可見抑制細(xì)菌增殖的最低抗菌藥物濃度。隨后，從1×MIC至最高測試濃度，每孔分別吸取10 μL懸液至羊血瓊脂平板上，37 ℃過夜孵育后，讀取最低殺菌濃度（minimal bactericidal concentration，MBC）值，即為殺滅99.9%活菌的最低抗菌藥物濃度[6]。

1.2.3 時(shí)間-殺菌曲線

挑取單個(gè)菌落于生理鹽水中，調(diào)為1.5×108 CFU/mL，再用新鮮TSB肉湯于50 mL離心管中稀釋至1×106 CFU/mL。將氟雷拉納用TSB肉湯進(jìn)行倍比稀釋，再等體積加入含菌的TSB肉湯中，使氟雷拉納的終濃度為1/4～4×MIC。DMSO設(shè)置為陰性對照組。將離心管放置于37 ℃恒溫?fù)u床中，180 r/min搖菌培養(yǎng)至0、2、4、6和12 h，分別吸取100 μL菌懸液進(jìn)行平板稀釋菌落計(jì)數(shù)[7]。

1.2.4 連續(xù)誘導(dǎo)耐藥實(shí)驗(yàn)

通過微量肉湯稀釋實(shí)驗(yàn)檢測氟雷拉納的MIC值后，選取1/2×MIC孔中的菌懸液用新鮮MH肉湯1：1000稀釋繼續(xù)進(jìn)行微量肉湯稀釋實(shí)驗(yàn)，37 ℃孵育24 h后，記錄MIC值。同時(shí)，選取1/2×MIC孔中的菌懸液用新鮮MH肉湯稀釋后進(jìn)行微量肉湯稀釋實(shí)驗(yàn)。直至連續(xù)檢測15 d，記錄每日MIC值，繪制時(shí)間-MIC變化曲線。本實(shí)驗(yàn)將CIP設(shè)置為陽性對照組[4]。

1.2.5 持留菌殺菌實(shí)驗(yàn)

挑取單個(gè)新鮮金葡菌菌落于適量TSB肉湯中，37 ℃ 180 r/min搖菌培養(yǎng)24 h確保細(xì)菌到達(dá)平臺期[8]。5000× g離心15 min收集平臺期持留菌，并用無菌生理鹽水漂洗3次以去除多余的培養(yǎng)基。用1×PBS（pH=7.4）重懸菌沉淀，并調(diào)至108～109 CFU/mL。加入氟雷拉納存儲液使體系的終濃度分別為1～8×MIC。同時(shí)，將10× MIC的VAN設(shè)置為對照組。將菌懸液放置37 ℃恒溫?fù)u床中，180 r/min搖菌培養(yǎng)，分別于0、1、2、3和4 h時(shí)間點(diǎn)吸取100 μL菌懸液進(jìn)行平板稀釋菌落計(jì)數(shù)。

1.2.6 生物被膜抗菌實(shí)驗(yàn)

生物被膜抑制實(shí)驗(yàn)[9]：用TSB將金葡菌搖菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用生理鹽水調(diào)為1.5×108 CFU/mL的菌懸液，并用TSB肉湯稀釋至約1×106 CFU/mL備用。用TSB肉湯將氟雷拉納倍比稀釋，加入100 μL至96孔板中，每孔再分別加入備用的菌懸液。DMSO設(shè)置為陰性對照組。將96孔板放置于濕盒中，37 ℃靜置孵育24 h后，棄上清，用無菌生理鹽水漂洗2次后，各孔分別加入0.25%（W/V）結(jié)晶紫染液，靜置孵育15 min后，棄上清，繼續(xù)用無菌生理鹽水漂洗3次以去除未與生物被膜結(jié)合的結(jié)晶紫。每孔分別加入

100 μL無水乙醇溶解與生物被膜結(jié)合的結(jié)晶紫，室溫放置30 min后，于酶標(biāo)儀檢測570 nm處的吸光度（A570），即為生物被膜的相對量；生物被膜清除實(shí)驗(yàn)[9]：用TSB將金葡菌搖菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，并稀釋至約1×106 CFU/mL，于96孔板中每孔加入200 μL菌懸液。37 ℃靜置孵育24 h后形成生物被膜，棄上清，將孔中的生物被膜用無菌生理鹽水漂洗2次。棄上清，每孔再分別加入200 μL用TSB肉湯倍比稀釋的氟雷拉納。37 ℃靜置孵育24 h后，棄上清液，漂洗3次進(jìn)行結(jié)晶紫染色，其余步驟同上。

1.2.7 激光共聚焦顯微鏡觀察生物被膜

生物被膜抑制實(shí)驗(yàn)[10]：將對數(shù)生長期的金葡菌用新鮮TSB肉湯稀釋至約1×106 CFU/mL，并于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入1 mL。各孔中再分別加入1 mL TSB倍比稀釋的氟雷拉納，DMSO設(shè)置為陰性對照組。充分混勻后，每孔放入1塊無菌蓋玻片。37 ℃靜置孵育24 h后，用生理鹽水漂洗蓋玻片，并在蓋玻片上分別滴加10 μmol/L的SYTO/PI染液。避光孵育15 min后，繼續(xù)漂洗蓋玻片，并于激光共聚焦顯微鏡下觀察生物被膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)，SYTO和PI的激發(fā)光和發(fā)射光波長分別設(shè)置為488 nm/550 nm和540 nm/ 620nm；生物被膜清除實(shí)驗(yàn)[10]：加入2 mL TSB稀釋的對數(shù)生長期菌懸液至6孔板中，每孔中再分別加入無菌蓋玻片，37 ℃靜置孵育24 h構(gòu)建生物被膜。用生理鹽水漂洗后，每孔加入2 mL氟雷拉納，DMSO設(shè)置為陰性對照組，37 ℃繼續(xù)孵育24 h后，漂洗去除未與蓋玻片結(jié)合的細(xì)菌，并進(jìn)行SYTO9/PI染色，其余步驟同上。

1.2.8 棋盤稀釋實(shí)驗(yàn)

挑取單個(gè)菌落于TSB中，37 ℃ 180 r/min搖菌2～3 h

至對數(shù)生長期。用無菌生理鹽水調(diào)至1.5×108 CFU/mL，再用MH肉湯稀釋至約1×106 CFU/mL備用。用MH肉湯將氟雷拉納倍比稀釋后，于96孔板中每橫排設(shè)置為一個(gè)濃度，分別加入50 μL/孔。再用備用的含菌MH肉湯倍比稀釋氨基糖苷類抗菌藥物，加入50 μL至96孔板中，使每豎排為同一濃度。將96孔板放置濕盒中，37 ℃靜置孵育16～18 h后，讀取MIC值并于酶標(biāo)儀檢測630 nm處的光密度（A630），即為細(xì)菌的生長濁度，根據(jù)A630繪制棋盤稀釋細(xì)菌濁度圖。計(jì)算協(xié)同抑菌指數(shù)（fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI）=MICA聯(lián)用/MICA單用+MICB聯(lián)用/MICB單用。其中，A和B分別為兩種聯(lián)用的抗菌藥物。FICI≤0.5為協(xié)同作用，0.54為拮抗作用[11]。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad 8.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，x±s）表示，組間比較采用Student's t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氟雷拉納對金葡菌具有一定的抗菌活性

氟雷拉納對金葡菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床分離菌株的MIC和MBC分別為4～8 μg/mL和8～16 μg/mL。氟雷拉納無論是對MSSA還是MRSA均具有相同的抗菌活性（表1）。通過時(shí)間-殺菌曲線可知，亞抑菌濃度的氟雷拉納（1/2×MIC）即可有效抑制細(xì)菌的增殖，且隨著濃度增高，其抗菌活性越強(qiáng)。（2～4）×MIC的氟雷拉納處理8 h內(nèi)可有效降低MSSA標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25923的活菌數(shù)量。而（2～4）×MIC可顯著降低MRSA標(biāo)準(zhǔn)菌株USA300的活菌數(shù)量長達(dá)12 h（圖1）。此外，即使亞抑菌濃度氟雷拉納連續(xù)處理金葡菌ATCC25923和USA300長達(dá)15 d也未見耐藥突變株的形成。而經(jīng)過CIP誘導(dǎo)后的金葡菌ATCC25923和USA300的MIC分別升高了8倍和16倍（圖2）。但氟雷拉納對CIP誘導(dǎo)的耐藥菌株的MIC仍然為8 μg/mL，說明氟雷拉納與CIP之間不存在交叉耐藥。

2.2 氟雷拉納具有顯著的抗持留菌活性以及生物被膜抑制和清除活性

由圖3可知，即使高達(dá)10×MIC的VAN對金葡菌ATCC 25923和USA300均無抗菌活性。而1～8×MIC的氟雷拉納可顯著降低ATCC 25923的持留菌活菌數(shù)量，且隨著時(shí)間的延長，活菌數(shù)量顯著降低。例如，與對照組相比較，8×MIC的氟雷拉納作用ATCC25923持留菌4 h可使其活菌計(jì)數(shù)從（8.97±0.35）Log10 CFU/mL降低到（7.47±0.09）Log10 CFU/mL（t=7.17， P=0.002）。此外，（2～8）×MIC的氟雷拉納也能顯著降低USA 300的持留菌活菌量，其殺菌活性也表現(xiàn)出明顯的時(shí)間依賴性。例如，8×MIC的氟雷拉納作用USA300持留菌4 h可使其活菌計(jì)數(shù)從（9.35±0.31）Log10 CFU/mL降低到（6.79±0.20）Log10 CFU/mL（t=12.04， P<0.001）。

氟雷拉納還具有顯著的生物被膜抗菌活性。1×MIC的氟雷拉納可顯著抑制MRSA USA300生物被膜的形成，使其生物被膜的形成量從（2.41±0.12）降低到（0.20±0.06）（t=44.03， P<0.0001）（圖4A）。同時(shí)，1×MIC的氟雷拉納還能顯著清除已形成的生物被膜，使其生物被膜的總量從（3.02±0.02）減少到（2.04±0.39）（t=5.58， P=0.0008）。且隨著氟雷拉納的濃度增加，其生物被膜的清除活性明顯增強(qiáng)，具有顯著的劑量依賴性（圖4B）。進(jìn)一步通過激光共聚焦顯微鏡觀察可知，氟雷拉納能有效抑制生物被膜的形成，降低生物被膜的總量，使熒光總量減低，且使紅色熒光（死菌）比例增加。同時(shí)，氟雷拉納還能有效破壞已形成的生物被膜的結(jié)構(gòu)，使熒光總量減少，且紅色熒光比例增加（圖4C）。

2.3 氟雷拉納與AMK具有協(xié)同抗菌活性

通過棋盤稀釋實(shí)驗(yàn)，將氟雷拉納與氨基糖苷類抗菌藥物的聯(lián)用效果進(jìn)行了篩選。由表2可知，氟雷拉納與AMK聯(lián)用具有協(xié)同抗菌活性，其FICI值最低，為0.375。圖5A為氟雷拉納聯(lián)用AMK的代表性棋盤稀釋實(shí)驗(yàn)圖片。通過活菌計(jì)數(shù)（圖5B），亞抑菌濃度的AMK和氟雷拉納對金葡菌USA300的增殖無或僅有較弱的抑制作用，而當(dāng)兩藥聯(lián)用時(shí)可明顯抑制USA300的增殖，進(jìn)一步驗(yàn)證了其協(xié)同作用。

3 討論

金葡菌逐漸上升的耐藥性已成為全球難題，研發(fā)針對耐藥金葡菌的新型抗菌藥物已成為當(dāng)下研究熱點(diǎn)。本研究通過“老藥新用”，發(fā)現(xiàn)抗寄生蟲藥物氟雷拉納對金葡菌具有顯著的抗菌活性。且氟雷拉納合成路線成熟，成藥潛力大。目前，尚未見氟雷拉納對金葡菌抗菌作用的相關(guān)研究報(bào)道。

氟雷拉納是1種殺菌劑，其對金葡菌的MBC約為2倍MIC。氟雷拉納對持留菌還具有一定的殺菌作用。持留菌是1種處于休眠狀態(tài)的細(xì)菌，對多種抗生素均耐藥。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)靶向細(xì)菌細(xì)胞膜的抗菌藥物能不依賴于細(xì)菌的增殖而有效裂解持留菌[4]。因此，氟雷拉納的作用機(jī)制可能也涉及細(xì)菌細(xì)胞膜的裂解。此外，AMK是1種作用于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)部的氨基糖苷類抗生素，AMK與氟雷拉納的協(xié)同抗菌作用機(jī)制可能也是通過氟雷拉納對細(xì)胞膜的破壞作用從而增加了細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn)AMK進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部而發(fā)揮抗菌作用。與本研究類似，Kim等[8]發(fā)現(xiàn)抗寄生蟲藥物硫雙二氯酚不僅能破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜，還能與氨基糖苷類抗生素慶大霉素協(xié)同殺菌。She等[12]發(fā)現(xiàn)小分子藥物L(fēng)007-0069可通過破壞細(xì)菌細(xì)胞膜而發(fā)揮持留菌殺菌作用，還可與慶大霉素聯(lián)用發(fā)揮協(xié)同抗菌作用。

生物被膜狀態(tài)下的細(xì)菌耐藥性高。植入物相關(guān)生物被膜的治療往往需要通過手術(shù)且需要延長抗菌治療時(shí)間，給臨床診療帶來極大的困難[13]。近年來，有關(guān)針對生物被膜的相關(guān)抗菌藥物已成為研究熱點(diǎn)。研究者發(fā)現(xiàn)將抗菌藥物聯(lián)用特異性作用于生物被膜組成成分或調(diào)控靶點(diǎn)的抗菌藥物可以有效抑制生物被膜的形成或一定程度上清除已形成的生物被膜。例如，savirin和apicidin可以作用于金葡菌的Agr群體密度感應(yīng)系統(tǒng)而抑制生物被膜的形成；重組酶DNase I和DispersinB能通過降解生物被膜基質(zhì)而起到生物被膜清除作用；lysostaphin和抗菌肽能一定程度上殺滅生物被膜內(nèi)部的細(xì)菌等[14]。但這些抗菌藥物因穩(wěn)定性差、藥動(dòng)學(xué)不佳或合成工藝復(fù)雜等原因，目前還停留于實(shí)驗(yàn)室研究階段。本研究中的氟雷拉納屬于小分子藥物，具有生物被膜抑制和清除作用以及抗持留菌的活性，且有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、合成工藝成熟和毒性低等優(yōu)點(diǎn)，具有較大的成藥潛力。

AMK一般臨床上用于治療革蘭陰性菌引起的感染，但與某些抗菌藥物聯(lián)用可以降低其毒性，擴(kuò)大抗菌譜從而提高其臨床適用性。此外，包括生物被膜在內(nèi)的難治性金葡菌往往對常用抗菌藥物耐藥，且對單一藥物具有較高的耐藥性，而當(dāng)AMK聯(lián)用其他抗菌藥物時(shí)，對生物被膜具有良好的殺菌效果。例如：Cui等[15]發(fā)現(xiàn)AMK聯(lián)用鵝去氧膽酸可通過改變細(xì)菌質(zhì)子動(dòng)力勢和促進(jìn)活性氧的產(chǎn)生而促進(jìn)AMK對金葡菌的抗菌活性。Broussou等[16]和Boles等[17]發(fā)現(xiàn)萬古霉素聯(lián)用AMK不僅能有效降低AMK誘導(dǎo)金葡菌的耐藥突變發(fā)生率，還能協(xié)同抑制植入物表面金葡菌生物被膜的形成。與單一抗菌藥物的使用相比，抗菌藥物聯(lián)用具有諸多其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。例如，抗菌藥物聯(lián)用可以在不增加用藥劑量的前提下提高藥物的療效；聯(lián)用可以減少耐藥突變的發(fā)生率；聯(lián)用還可以降低藥物的毒性等[18]。本研究發(fā)現(xiàn)氟雷拉納與AMK聯(lián)用對MRSA具有顯著的協(xié)同抗菌作用。亞抑菌濃度的氟雷拉納即可顯著提高AMK的抗菌活性，有效降低了用藥劑量，解決了AMK的毒性難題，從而進(jìn)一步提高了AMK的利用價(jià)值，延緩了細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。

氟雷拉納主要用于治療動(dòng)物寄生蟲感染，其作用靶點(diǎn)為一種寄生蟲特有的γ-氨基丁酸門控氯離子通道。由于哺乳動(dòng)物和節(jié)肢動(dòng)物的γ-氨基丁酸門控氯離子通道結(jié)構(gòu)與寄生蟲不同，因此，不存在共同作用靶點(diǎn)，從而氟雷拉納對人體細(xì)胞的毒性低且具有良好的體內(nèi)耐受性[19]。氟雷拉納具有良好的體內(nèi)代謝參數(shù)，在實(shí)驗(yàn)狗中，口服25 mg/kg的氟雷拉納可使血藥濃度最高達(dá)到3.95 μg/mL。其作用時(shí)間長，半衰期可持續(xù)12 d，曲線下面積為46.12μg·d/mL，提示氟雷拉納能被良好的吸收利用[20]。雖然，本研究中的最高血藥濃度僅為3.95 μg/mL（低于本研究中金葡菌的MIC值8 μg/mL），但其給藥劑量僅為25 mg/kg，鑒于其耐受性良好，有望通過加大劑量提高藥物在體內(nèi)濃度。一項(xiàng)針對于實(shí)驗(yàn)狗的臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，即使高達(dá)56 mg/kg的氟雷拉納持續(xù)用藥8周也未見明顯的體內(nèi)毒性[21]。此外，氟雷拉納也被研究用于治療媒介傳播疾病，Miglianico等[22]發(fā)現(xiàn)氟雷拉納對按蚊、伊蚊、庫蚊和白鰭豚沙蠅具有顯著的殺滅作用，其半數(shù)抑制濃度低至33～575 nmol/L。通過臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)分析，研究者預(yù)測410 mg的人體使用劑量能維持50～90 d的作用效果，從而能有效防止塞卡病毒和瘧原蟲的感染。近年來，通過“老藥新用”，抗寄生蟲藥物被廣泛研究用于新型冠狀病毒[23]和抗菌治療[24]，且都表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景、降低了人力和財(cái)力的消耗，加快了藥物的研究進(jìn)程。因此，將氟雷拉納改造為抗菌藥物具有較大的研發(fā)潛力。

本研究通過藥敏試驗(yàn)、生物被膜和持留菌殺菌實(shí)驗(yàn)以及棋盤稀釋實(shí)驗(yàn)等方法，發(fā)現(xiàn)抗螨蟲藥物氟雷拉納對金葡菌及其耐藥菌株具有顯著的抗菌活性，且與AMP聯(lián)用還具有顯著的協(xié)同抗菌活性。有望為金葡菌感染提供新武器。

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